Ecd促进U5 snRNP成熟和Prp8稳定性

摘要

剪接体催化的前mRNA剪接是基因表达调控的关键步骤，有助于转录组和蛋白质组的多样性。剪接体由五个小的核核糖核蛋白颗粒（snRNP）组成，其生物成因尚不完全清楚。在这里，我们将进化上保守的蛋白Ecdysoneless（Ecd）定义为U5 snRNP组装和Prp8稳定性的关键调节器。结合果蝇属通过蛋白质组学的遗传学方法，我们证明了Ecd对维持成人健康寿命和寿命的需求，并确定Sm环蛋白SmD3是Ecd的一个新的相互作用伙伴。我们发现，Ecd的主要任务是将Prp8传递给细胞质中出现的U5 snRNP。厄瓜多尔另一方面，缺乏导致Prp8蛋白水平降低和U5-snRNP生物发生受损，导致剪接保真度和转录组完整性的丧失。基于我们的研究结果，我们提出Ecd伴侣Prp8参与形成U5 snRNP，从而完成U5 snRNA生物生成途径的细胞质部分，以满足细胞对功能剪接体的需求。

简介

大多数真核生物基因的定义特征是内含子的存在，内含子是非编码序列，它中断被称为外显子的离散编码基因组单元。为了获得遗传信息，必须从新生的前mRNA中切除内含子，外显子在前mRNA剪接过程中精确融合。重要的是，通过选择性剪接（AS）期间外显子和剪接位点的选择性选择，基因组的编码能力显著增加，从而增强转录组和蛋白质组的多样性。相反，异常剪接事件被认为是遗传病的驱动因素，并与不同的癌症有关(1,2)，促进了人们对深入理解保护剪接过程保真度的复杂分子机制的浓厚兴趣。

前mRNA的内含子切除是由一种称为剪接体的大分子机器催化的。剪接体由五个主要构建块组成，即U1、U2、U4、U5和U6小核核糖核蛋白颗粒（U snRNP）以及与复合物动态相关的广泛蛋白质。每个snRNP包含一个短的非编码富含尿苷的RNA(U snRNA)一个常见的七元Sm或类Sm蛋白环，以及一组特定的蛋白质(三,4). U snRNPs的生物发生是一个逐步的过程，从转录U snRNA通过RNA聚合酶II（RNA Pol II）在细胞核内1号机组,U2乐队,4号机组和U5 snRNA或RNA聚合酶III（RNA Pol III）U6 snRNA.同时U6 snRNA被认为留在核内(5)，RNA Pol II合成snRNA输出到细胞质，在细胞质中，存活运动神经元（SMN）复合体引导在保守的Sm结合基序周围形成七元Sm蛋白环(三,4,6). 然后，核心snRNP颗粒作为一系列snRNP特异性蛋白质的结合平台。虽然对U snRNP组装的早期SMN依赖步骤有很好的描述，但在机械上对snRNP特异性蛋白并入成熟颗粒的了解却少得多。

Prp8是跨分类群剪接体中最大和最保守的蛋白质之一(7). 作为U5 snRNP的核心成分，Prp8通过定位关键snRNAs和底物前体mRNA残基，对剪接体催化中心的组织至关重要，同时也通过与GTPase Snu114/EFTUD2协同协调Brr2/SNRNP200解旋酶，对剪合体激活至关重要(8–12). Prp8与Snu114和Aar2在细胞质中结合核心U5 snRNP，形成前体U5 snRNA(13–16). 核导入后，Aar2被Brr2取代，并进行广泛的snRNA碱基修饰(17,18)总结功能性U5-snRNP的成熟。最近的研究表明，Hsp90共同伴侣R2TP/Prefoldin-like（R2TP/FFDL）复合物在预先形成的Prp8和Snu114/EFTUD2亚复合物向细胞质中组装U5-snRNA的转移中起作用(19). R2TP/PFDL复合物被描述为促进Hsp90介导的客户蛋白并入对细胞生长和基因表达至关重要的大分子组合，包括RNA Pol II、PI3激酶样激酶复合物（PIKK）、小核仁和核RNP(20,21).

我们和其他人最近的工作为进化保守蛋白Ecdysoneless（Ecd）和U5 snRNP的成分（包括Prp8和Aar2）之间的物理相互作用提供了证据果蝇属以及哺乳动物细胞，表明Ecd参与前mRNA剪接(19,22–24). 我们进一步证明了斯波克该基因编码一种关键的类固醇生成酶，有助于电子海图缺乏幼虫及其无法进行变态(22). 值得注意的是，还发现Ecd与R2TP/Prefoldin样（R2TP/FFDL）共伴侣复合物的亚单位相互作用(23,25,26)这表明Ecd可能作为一种分子连接物，在R2TP复合体与U5 snRNP之间架起桥梁，用于生物发生。然而，其与拼接机械的机械接触仍然未知。重要的是，电子海图是细胞在发育过程中生存所必需的基因果蝇属和哺乳动物(22,25,27,28). 有趣的是，在胰腺中观察到Ecd水平升高(29)和胃癌(30)与乳腺癌患者进展快和预后差呈正相关(31).

在这里，我们证明了Ecd不仅在发育过程中至关重要，而且在成年期对组织功能的维持也是不可或缺的。我们确定七元Sm环蛋白SmD3是Ecd的一个新的结合伙伴果蝇属并证明SmD3-Ecd相互作用对于维持转录组完整性和剪接准确性所需的新生U5 snRNP的生物发生的必要性。

材料和方法

黑腹果蝇线

以下内容黑腹果蝇使用菌株：w个¹¹¹⁸（BDSC；RRID:BDSC_3605)，电子海图¹(32)，电子海图^Δ（本研究），w、 ；；FRT2A型（BDSC；RRID:BDSC_1997)，w、 ；；FRT82B型（BDSC；RRID:BDSC_2035)，w；nubbin-Gal4，UAS-myr-mRFP(nub>mRFP，本研究），w；escargot-Gal4、UAS-GFP、tub-Gal80^TS公司(静电陀螺仪^TS公司>, 33)，w；nubbin-Gal4，无人机myr mRFP；管道-Gal80^TS公司 (节点^TS公司>mRFP公司，本研究），w、 ；；电子海图^我(三)23FRT2A型(22)，w、 ；；电子海图^ΔFRT2A型（本研究中重组），w；UAS-ecd公司^RNA干扰(22)，w；UAS-prp8型^RNA干扰（VDRC；ID18565），w、 ；；UAS-Prp8型^重量 (34)，w；；UAS-SmD3:：3xHA（FlyORF；F003987），w、 ；；无人机-SmD3:：3xHA，UAS-ecd^RNA干扰（本研究中重组），w；nubbin-Gal4，UAS-myr-mRFP；无人机-SmD3:：3xHA，管-Gal80^TS公司（本研究），w；nubbin-Gal4，UAS-myr-mRFP；电子海图¹（本研究），w、 ；；无人机-SmD3:：3xHA，UAS-Prp8^重量（本研究中重组），w、 ；；无人机-SmD3:：3xHA，无人机电子海图^RNA干扰，UAS-Prp8^重量（本研究中重组），eyFLP；动作>y⁺>Gal4，UAS-GFP；FRT82B，管-Gal80(35)，eyFLP；动作>y⁺>Gal4，UAS-GFP；Gal80管，FRT2A（本研究）w；UAS-Ecd公司^重量; FRT82B型（本研究），w；UAS-Myc:：Ecd公司^三重A; FRT82B型（本研究），w；UAS-Myc:：Ecd公司^Δ34; FRT82B型（本研究），w；无人机Ecd^重量; 电子海图^ΔFRT2A型（本研究），w；UAS-Myc:：Ecd公司^三重A; 电子海图^ΔFRT2A型（本研究），w；UAS-Myc:：Ecd公司^Δ34; 电子海图^ΔFRT2A型（本研究）。有关的详细信息果蝇属菌株描述见补充表S1.

养蜂业

果蝇属饲粮由0.8%琼脂、8%玉米粉、1%豆粕、1.8%干酵母、8%麦芽提取物和2.2%糖浆组成，辅以0.625%丙酸和0.15%尼泊金。Gal4驱动线和eyFLP市场营销策略除非另有规定，否则设置交叉线并将其保持在25°Cw个¹¹¹⁸和FRT2A型或FRT82B型行分别作为控件。用于对温度敏感的成虫实验电子海图¹和控制w个¹¹¹⁸允许在18°C下形成线条。十字架使用静电陀螺仪^TS公司>或节点^TS公司>mRFP公司建立表达系统并在室温下保存。用于利用节点^TS公司>mRFP公司，将装有三龄幼虫的小瓶升到29°C，持续24小时静电陀螺仪^TS公司>，羽化的成年苍蝇被收集2天，并在室温下再交配2天，然后被转移到苍蝇孵化器中，16小时/8小时的光/暗循环设置为29°C，直到在指定年龄进行解剖。

寿命试验

用于寿命试验电子海图¹线被回传到w个¹¹¹⁸五代人的遗传背景。配合电子海图¹和控制w个¹¹¹⁸雄性和雌性成虫被分离，并转移到1 l笼中（100只苍蝇/笼），使用装有标准苍蝇饮食的小瓶。将笼子放置在苍蝇培养箱中，将16小时/8小时的光/暗循环设置为29°C。对死苍蝇进行计数，并每2-3天更换一次食品小瓶。在Microsoft Excel中分析成年苍蝇的寿命(RRID：SCR_016137)采用log-rank检验计算统计学意义。用Prism 8（GraphPad，注册登记号：SCR_002798)代表两个独立实验之一。每次实验的苍蝇总数(n个)、基因型和条件在相应的图及其图例中指定。

的生成电子海图^Δ功能丧失等位基因

这个电子海图^Δ利用tRNA-sgRNA系统，利用CRISPR–Cas9基因组编辑技术生成突变株系(36). pCFD5质粒(36；RRID：添加基因_73914)表达两个靶向内源性电子海图根据制造商的说明，使用Gibson Assembly reaction（New England Biolabs）克隆基因位点，使用Phusion HS II聚合酶（ThermoFisher Scientific Cat#F549L）扩增的纯化PCR片段。这个pCFD5-gRNA-Ecd构造已集成到附件40利用PhiC31整合酶介导的转基因（BDSC）在第二染色体（25C6）上的位点；注册号：BDSC_79604). 产生的库存v；pCFD5-gRNA-Ecd附件40被跨越到无cas9，Lig4¹⁶⁹飞线（本研究）。收集后代，进行平衡，并通过PCR筛选是否存在缺失。恢复的电子海图^Δ等位基因编码40个氨基酸长肽，其中前23个氨基酸与野生型Ecd蛋白对齐，而其余17个因移码而无关(补充图S1A). sgRNA和引物序列见补充表S2.

质粒和转基因株系的产生

黑腹果蝇用Phusion HS II聚合酶（ThermoFisher Scientific Cat#F549L）从各自的cDNA中扩增PIH1D1（CG5792）、Pontin（CG4003）、SmD3（CG8427）、SmB（CG5352）、SmG（CG9742）、SmF（CG16792）和Ecd（CG5714）的编码DNA序列，并克隆到pENTR4双选择载体（Thermo Fisher科学Cat#A10465）中。欧洲共同体^{[E496A、E566A、E621A]}（厄瓜多尔）^三A级)该变异体是通过结合定点突变和重叠延伸PCR产生的。欧洲共同体^Δ34PCR产生截短变体，导致Q650交换为提前终止密码子。通过LR克隆酶II介导的重组（Invitrogen Cat#11791020）将N末端Myc-或Flag-tag添加到pTMW或pTFW载体（DGRC Cat#1107或Cat#1115）中。在对EcoRI和KpnI或NotI进行扩孔和限制后，将Myc:：Ecd盒插入pUAST attB载体主干（DGRC Cat#1419，37). 所有引物和质粒列于补充表S2.

通过标准P元件介导的转化（Myc:：Ecd^Δ34)到w个¹¹¹⁸股票（BDSC；RRID:BDSC_3605)或PhiC31整合酶介导的转基因附件40现场（BDSC；注册号：BDSC_25709)（Ecd^重量，Myc:：急诊^三重A).

EAD遗传镶嵌的生成

用可抑制细胞标记（MARCM）技术进行镶嵌分析(38)带有eyFLP；动作>y⁺>Gal4，UAS-GFP；Gal80管,FRT2A型和eyFLP；动作>y⁺>Gal4，UAS-GFP；FRT82B，管-Gal80苍蝇被用来在EAD内产生基因定义的克隆，如(39).

果蝇属S2细胞培养

果蝇属施耐德2（S2）细胞在25°C的Shields和Sang M3昆虫培养基（Sigma-Aldrich Cat#S8398）中培养，该昆虫培养基含有不含抗生素的8%胎牛血清（Gibco，Life Technologies）。细胞转染在6孔板（5×10⁵细胞/微孔）在无血清培养基中使用Trans-IT-昆虫试剂（Mirus Bio LLC，MIR6100），遵循制造商的说明。通过与表达GAL4的pWA-GAL4质粒在肌动蛋白5C启动子。pIE EGFP质粒(40)共转染以监测转染效率。通过转染1.5μg纯化的在体外靶向67个核苷酸长3′非翻译区（3′UTR）的转录双链RNA电子海图mRNA。靶向LacZ公司基因起到了模拟对照的作用。转染72小时后处理细胞进行下游应用。为了抑制自噬溶酶体途径，在细胞裂解之前，用100μM氯喹（Sigma-Aldrich，Cat#C6628）或400 nM Bafilomycin A1（Enzo Life Sciences，Cat#BML-CM110-0100）处理S2细胞24小时。

组织解剖和免疫染色

三龄幼虫的EAD和翅膀影像盘果蝇属幼虫（7天AEL）在室温下用4%多聚甲醛固定在含有0.1%Triton X（PBS-T）的PBS中25分钟。用4%多聚甲醛在4°C的PBS中固定成年女性肠道48小时。固定组织用PBS-T清洗三次，肠只在PBS中清洗。在封闭缓冲液中稀释初级抗体（PBS-T和0.3%BSA），并在4°C下过夜对组织进行染色。使用了以下主要抗体：兔抗-果蝇属裂解死亡半胱天冬酶1（Dcp-1，1:500，细胞信号技术类别#9578，注册登记号：AB_2721060)，rat-anti-Ecd N项（1:500，22)，鼠抗犰狳（臂，1:20，发育研究杂交瘤库#N2 7A1；注册登记号：AB_528089)，鼠抗盘大（Dlg1，1:100，发育研究杂交瘤库#4F3；注册登记号：AB_528203). 清洗后，将样品与相应的Cy3-或Cy5-结合二级抗体（1:1000，Jackson ImmunoResearch Labs Cat#711-175-152，注册登记号：AB_2340607，目录号712-165-150，注册登记号：AB_2340666，分类号715-165-151，注册登记号：AB_2315777)在室温下持续2小时，并用DAPI（5 mg/ml储备液的1:1000稀释液，Carl Roth GmbH Cat#6335.1）进行复染，以观察细胞核。组织被放置在Dabco-Mowiol 4-88（Sigma-Aldrich Cat#D2522和Cat#81381）的玻璃载玻片上，并在72小时内成像。

图像采集和处理

组织在配备20x UPlan S-Apo（NA 0.85）、40x UPlan-FL（NA 1.30）和60×UPlanApo（NA 1.35）物镜的Olympus FV-1000共焦显微镜上成像。肠的图像总是从R5中肠后部区域拍摄的。所有显微照片均显示FluoView FV-10ASW软件（奥林巴斯，RRID:SCR_014215). 在Adobe Photoshop CC（Adobe Systems。，RRID:SCR_014199). 基于DAPI染色绘制EAD的白色轮廓。

为了测量中肠直径，使用cellSens Standard 1.11软件，使用奥林巴斯CKX41倒置显微镜拍摄女性成人中肠的亮场图像，并导入Adobe Photoshop CC（Adobe Systems，Inc。，RRID：SCR_014199). 从中肠周围内脏中胚层的外部，在中肠-内脏边界前200μm处对每条肠道进行测量。在GraphPad Prism（GraphPad-Prism，注册登记号：SCR_002798)使用未配对的双尾学生t吨-用不等方差检验。

使用CellProfiler中的定制管道，根据最大强度Z投影共焦叠加的细胞核DAPI染色，确定所示基因型雌性成虫R5中肠后部成像区域的细胞数量(41,注册登记号：SCR_007358). 斐济人工计算了不同的细胞类型(RRID：SCR_002285). 根据祖细胞（ISCs和EBs）和EE的形态、较小的细胞核和细胞大小（分别为DAPI和Dlg1信号）以及Arm信号的富集程度，将其与大吸收型EC区分开来。为了量化细胞凋亡，对每个复制的Dcp-1荧光信号进行阈值化，并与DAPI、Arm和Dlg1通道重叠，以便于人工计数斐济Dcp-1阳性EC、祖细胞和EE(RRID：SCR_002285). 在GraphPad Prism（GraphPad-Prism，注册登记号：SCR_002798)使用非配对非参数双尾Mann-Whitney检验。

为了量化GFP阳性克隆体积，将镶嵌EAD的共焦Z堆栈导入斐济(RRID：SCR_002285). 阈值化后，将单个切片转换为二值图像并选择轮廓。使用3D管理器插件确定GFP和DAPI的比率。相同的宏应用于所有样本。使用的宏可根据要求提供。在GraphPad Prism（GraphPad-Prism，注册登记号：SCR_002798)使用普通的单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。

采用配备DP72 CCD相机的Olympus SZX16荧光立体显微镜，在相同的放大率和设置下，在羽化后24小时内拍摄女性镶嵌成年眼睛的亮场和荧光图像。使用奥林巴斯cellSens 1.1软件（Olympus，RRID：SCR_014551).

蛋白质印迹和免疫沉淀样品的制备

在1×PBS中从三龄幼虫的翼盘（15–20 WDs/replicate）或眼天线成像盘（20–30 EADs/replication）中解剖，并立即在50 mM Tris–HCl（pH 7.8）、150 mM NaCl、1 mM EDTA（pH 8.0）、1%Triton X-100、0.01%Igepal和蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学分类号：11 873 580 001）中溶解。用相同的缓冲液压扁并溶解三到五只成年苍蝇。果蝇属将S2细胞制成颗粒（800×g，在4°C下放置10分钟），并重新悬浮在相同的裂解缓冲液中。通过离心（4°C下12 000×g，10分钟）清除所有样品中的碎片和DNA。根据制造商的说明，通过Bradford分析（Roth GmbH Cat#K015.1）测定蛋白质浓度。

对于免疫沉淀分析，将从S2细胞或三龄幼虫影像盘中提取的250–1000μg总蛋白与抗Myc-tag（MBL国际猫号M047-11B）、抗Flag-tag（Sigma-Aldrich猫号M8823、，收到日期：AB_2637089)mAb磁珠或G蛋白动态珠（Invitrogen Cat#10004D）与所需的初级抗体偶联。在含有150–250 mM NaCl的裂解缓冲液中进行五次洗涤后，用0.1 M甘氨酸-盐酸（pH 3.0）洗脱结合蛋白5分钟，然后用0.5 M Tris-HCl（pH 7.8）和1.5 M NaCl.中和。

对于western blotting，样品在含有2.5%β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中在95°C下煮沸5分钟进行变性。样品在10%或12%SDS-PAGE上溶解。用一级抗体：兔抗dPrp8-CTD（1:1000，34)，rat-anti-Ecd N项（1:1000，22)，鼠标反标记M2（1:1000，Sigma-Aldrich Cat#F1804，注册登记号：AB_262044)，兔抗Myc（1:2000，细胞信号技术类别2272，RRID:AB_10692100)，兔抗HA（1:2000，Abcam Cat#ab9110，注册登记号：AB_307019)，小鼠抗ATP5α抗体（1:2000，Abcam Cat#ab14748，注册登记号：AB_301447)，兔抗RFP（1:1000，MBL类别号PM005，注册登记号：AB_591279)，兔抗GFP（1:2000，Acris Cat#TP401，注册登记号：AB_10013661)然后用相应的山羊抗鼠剂（1:5000，Jackson ImmunoResearch Labs Cat#715-035-150，注册登记号：AB_2340770)，兔子（1:5000，Jackson ImmunoResearch Labs Cat#711-035-152，注册登记号：AB_10015282)和大鼠（1:5000，Jackson ImmunoResearch Labs Cat#712-035-153，注册登记号：AB_2340639)HRP结合二级抗体。使用ImageQuant LAS4000阅读器捕获化学发光信号（GE Healthcare，瑞德：SCR_014246). 使用ImageJ量化信号强度(RRID：SCR_003070)并归一化为每个生物复制的感兴趣蛋白质的平均带强度。未配对或配对双尾学生的t吨-测试或普通或双向方差分析以及事后Tukey多重比较测试用于确定蛋白质水平和结合变化的统计显著性。

重组蛋白的表达与纯化

为了产生His-tagged Ecd和SmD3:：HA蛋白，将各自的cDNA分别克隆到pET28b（Sigma Cat#69865）和Gateway pDEST17（Invitrogen Cat#11803012）载体中。重组蛋白在BL21 Rosetta（DE3）中表达大肠杆菌用0.4 mM IPTG（Sigma-Aldrich Cat#I5502-5G）在16°C下诱导过夜，然后用Ni-Sepharose（GE Healthcare Cat#GE17-5268-01）进行亲和纯化，得到细胞（Invitrogen Cat#C600003）。对于下拉分析，将10μg纯化的His:：Ecd和His:∶SmD3:：HA蛋白与蛋白g Dynabeads（Invitrogen Cat#10004D）结合到3μg大鼠抗Ecd N-末端，在4°C下单独或一起培养过夜(22)抗体。如上所述进行洗涤步骤和随后通过蛋白质印迹进行检测。

质谱和蛋白质鉴定

对于蛋白质组分析，IP样品（四个生物复制品/条件）在50 mM Tris–HCl（pH 7.8）、150–250 mM NaCl、1 mM EDTA（pH 8.0）和蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学分类号11 873 580 001）的洗涤缓冲液中再洗涤三次，不使用洗涤剂。用8M尿素（Sigma Cat#U1250）从珠中洗脱结合蛋白。为了还原和烷基化二硫键，样品在室温下用10 mM DTT（Applichem Cat#3483-12-3）培养30分钟，在黑暗中用55 mM碘乙酰胺（Merck Cat#8.04744.0025）培养20分钟。蛋白质用LysC（Wako Cat#129-02541）消化2–3小时，胰蛋白酶（Serva Cat#9002-07-7）消化过夜。通过添加1%甲酸（霍尼韦尔Fluka产品目录号607-001-00-0）停止消化。最后，使用苯乙烯-二乙烯基苯（SDB）级尖端（Affinisep，SPE-Disk-Bio-RPS-47.20）纯化肽并加载到质谱仪上。对于LC-MS/MS分析，一个简单的nLC 1000（ThermoFisher Scientific）通过纳米喷雾电离源与基于四极的QExactive Plus Orbitrap（Thermo Fisher科学）仪器耦合。

所有原始文件都是用Maxquant（1.5.3.8版）处理的(42)和Andromeda搜索引擎(43). 将记录的MS2光谱与果蝇属参考蛋白质组数据库（Uniprot Release 2017）。使用了默认质量公差和修改设置。将最小肽长度设置为7个氨基酸，N-末端乙酰化以及蛋氨酸残基氧化被定义为可变修饰。半胱氨酸-氨基甲酰化被设定为固定修饰。蛋白质和肽谱匹配（PSM）水平的错误发现率（FDR）通过目标经济方法计算为1%(44). 启用了iBAQ量化方法和运行间匹配选项。LFQ强度为对数₂转化后用于双侧t检验，假设方差相等，以识别显著不同的下拉蛋白。使用InstantClue可视化蛋白质组学数据(http://www.instantclue.uni-koeln.de)和细胞景观(注册登记号：SCR_003032). 免疫沉淀蛋白GO富集分析（log₂差值≥2，P（P）-值<0.05），使用Panther（蛋白质分析THrough进化关系）分类系统进行(www.geneontology.org). 只有GO术语的倍数富集度≥15（SmD3:：HA相互作用组）和≥5（Myc:：Ecd^重量相互作用和比较SmD3:：HA与SmD3::：HA，ecd^RNA干扰interactiome）和调整后的P（P）-值<0.05。为了可视化，在REViGO的帮助下对GO术语进行了聚类(注册登记号：SCR_005825) (45)使用中等（0.7）或较小（0.5）设置消除冗余。

RNA分离、RNA免疫沉淀和基因表达分析

使用TRI试剂（Sigma-Aldrich Cat#T9424）和DNase I（Invitrogen Cat#AM2238）处理的标准方案，从八只三龄幼虫或70-90只WDs中分离出总RNA(39). 对于RNA免疫沉淀（RIP），将450μg从三龄幼虫翅膀想象盘提取的总蛋白与蛋白g Dynabeads（Invitrogen Cat#10004D）结合到2μg兔抗HA（1:2000，Abcam Cat#ab9110，注册登记号：AB_307019)或3μg大鼠抗Ecd N-端(22)抗体。在含有150 mM NaCl的裂解缓冲液中进行五次洗涤后，1/4的结合部分按照上述蛋白质洗脱协议进行洗脱，以控制相同的沉淀效率，而其余部分则用TRI试剂洗脱（Sigma-Aldrich，类别号T9424）。使用随机六聚体引物和Superscript III逆转录酶（Invitrogen Cat#18080044）从1至2μg RNA合成cDNA。半定量PCR（Semi-qPCR）产物在1.5-3%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色以进行可视化。单独PCR反应检测第49页mRNA水平（半定量PCR）和U5 snRNA对输入样品（RIP）中的水平进行测定，以控制样品制备过程中的变化。使用CFX96（Bio-Rad）实时PCR系统，使用GoTaq qPCR主混合液（Promega Cat#A600A）进行三次定量PCR（qPCR）。数据标准化为第49页使用ΔΔCT方法计算转录和折叠变化(46). 一个未配对的双尾学生的t吨-使用事后Welch校正检验或事后Tukey多重比较检验的双向方差分析来确定基因表达变化（qPCR）或U snRNA绑定（RIP）。所有引物序列列于补充表S2.

mRNA-seq、转录组和剪接分析

总RNA按照上述方法从w个¹¹¹⁸和电子海图¹幼虫在18°C下饲养10天，并在生物三倍体中转移到29°C下2天。根据Illumina协议生成RNA文库，并在Illumiana HiSeq 2000仪器上以100 bp读取长度进行配对测序。在运行时使用Illumina RTA软件进行图像分析和基本调用。使用FastQC对原始数据进行初始质量检查(RRID：SCR_014583) (补充数据集S3)，并且读数与果蝇属使用Tophat2 v2.0.10的参考基因组BDGP Release 6（dm6）(http://ccb.jhu.edu/software/tophat) (47). 使用featureCounts v1.6.4在基因元特征水平上执行映射读取摘要(RRID:SCR_012919) (48). 使用DESeq2评估差异基因表达(RRID：SCR_015687) (49). 满足log条件的基因₂fold-change，日志₂FC|≥1且已调整P（P）-与对照样品相比，值<0.05被认为是差异表达。使用GOrilla进行GO术语富集分析(http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il) (RRID:SCR_006848) (50)，带有一个由分析确定的所有基因组成的自定义背景基因列表(补充数据集S3). 使用REViGO进行GO术语聚类(注册登记号：SCR_005825) (45). 使用R gplots包的heatmap2 v3.0.1生成选定基因的log2（x+1）转换归一化计数的热图，每行的数据如下所示Z轴-分数。检测到差异拼接切叶机（版本0.2.8）(51)使用Tophat2映射读取，dm6注释和参数min_samplesper_intron=3和min_samples per_group=3。显著性阈值|deltaPSI|>0.1并进行了调整P（P）-值<0.05。使用基于bedtools intersect命令（版本2.29.0；带有选项-s-wao）的自定义脚本对可选拼接事件进行简单分类(52)从dm6注释中提取外显子坐标，使其与相应的连接重叠，然后计算并分类每个外显子到相应连接的距离(补充数据集S4). 为了最大限度地减少由于注释但未表达的转录本/外显子导致的错误分类，使用合并的从头开始用StringTie组装转录组（版本1.3.4d；亚型阈值0.1）(53). 只有匹配dm6和StringTie方法的分类才被选作最终分析和UpSet图(54).

结果

维持成人组织功能需要Ecd

Ecd与核心剪接因子的相互作用表明，它在前mRNA剪接中起着更普遍的作用，这不仅在发育过程中需要，在成年期也需要。为了测试成年期Ecd功能的必要性，我们利用了对温度敏感的隐性电子海图¹携带单个脯氨酸-656到丝氨酸（P656S）替代的突变等位基因(补充图S1A). While期间电子海图¹当保持在允许的温度（18-22°C）下时，纯合突变动物会发育成有活力和可生育的成年动物，Ecd功能可以通过转移到29°C的限制性温度来消除(27,32和补充图S1B-E). 有趣的是，当成虫羽化后第3天开始升高温度并保持在29°C时，电子海图¹纯合子男性和女性的寿命明显短于w个¹¹¹⁸控件（图1安培). 的完整性和功能果蝇属成人胃肠道已成为动物健康和寿命的重要决定因素。苍蝇后部中肠的功能相当于哺乳动物的小肠，由专门的肠干细胞群（ISC）维持（图1磅). ISC活性受到严格调节和协调，以促进机体一生中的自我平衡以及应激诱导的上皮更新(55–57). 有趣的是电子海图¹与对照组相比，变种成虫在限制温度下饲养15天，其体重明显变薄（图1磅——E类)含有较少的大吸收性肠细胞（EC）。相反，通过对活化的肠上皮细胞进行免疫染色，凋亡祖细胞（ISCs和成肠细胞（EBs））和肠内分泌细胞（EEs）的数量显著增加果蝇属裂解死亡半胱天冬酶1（Dcp-1）（图1楼——H（H）). 此外，RNAi沉默电子海图使用escargot-Gal4、UAS-GFP、tub-Gal80^TS公司系统（以下简称为静电陀螺仪^TS公司>) (58)导致Esg阳性祖细胞减少，这与它们在年龄匹配的对照组肠道中的扩张形成显著对比（图1I公司——K（K）). 这些结果突出了Ecd在成年期维持组织功能和体内平衡方面的重要作用。此外电子海图肠细胞的丧失和生存需要Ecd功能的事实表明，肠上皮细胞的更新受损可能是导致寿命缩短的因素之一。

欧洲共同体缺乏导致Prp8蛋白水平下降

为了研究Ecd丢失的分子后果，我们集中研究了它与核心U5剪接因子Prp8的相互作用。有趣的是，western blot分析显示纯合子中Prp8蛋白显著下调电子海图¹变种成虫在限制温度下保持10天(补充图S2A). 类似地，Prp8蛋白水平在从电子海图¹相对于对照组和在允许温度下检测到的水平，突变幼虫在29°C下暴露24小时（图2安培和补充图S2B). 相反，P656S突变和温度变化均未显著改变Ecd蛋白的水平（图2安培和补充图S2A、S2B)或表达电子海图和第8页mRNA，由定量RT-PCR测定（图2B型). WDs中也观察到较少的Prp8蛋白，其中Ecd通过转基因RNAi在眼袋区域特异性下调(电子海图^RNA干扰)在球蛋白Gal4,UAS-myr-mRFP驾驶员（以下简称nub>mRFP)（图2摄氏度——E类)或在中果蝇属用靶向电子海图成绩单(dsRNA ecd)（图2楼). 有趣的是，用氯喹（CQ）或Bafilomycin A1（BafA1）抑制自噬溶酶体降解途径，可恢复Prp8蛋白水平电子海图S2细胞缺陷与对照组检测到的数量(补充图S2C、S2D). 这些结果表明，Ecd的丢失导致Prp8蛋白不稳定，并表明Ecd保护Prp8不被降解。

突变Ecd蛋白保持与R2TP复合物的结合

生化和细胞培养实验表明，人类ECD与R2TP伴侣复合物的核心亚单位相互作用(25,26)这与功能性U5 snRNP的组装有关(19,23). 因此，我们假设Ecd可能通过充当U5 snRNP和R2TP复合物之间的分子适配器来促进U5 snRNA的成熟。另一方面，如果没有Ecd，U5 snRNP组件将受到损害，使Prp8暴露并容易退化。重要的是，来自果蝇属表达标记蛋白的S2细胞显示Ecd与已知R2TP亚单位、PIH1D1和Pontin（RUVBL1）结合（图3B公司,3C公司和补充图S3A、S3B)证明了哺乳动物细胞中Ecd和R2TP复合体之间的相互作用(19,25,26)可以在中重述果蝇属为了评估Ecd与R2TP结合的重要性，我们决定通过突变D[S/T]DD基序来干扰相互作用，这可能以磷酸依赖的方式促进Ecd募集到PIH1D1的PIH-N结构域(26). 苍蝇和人类蛋白质的比对揭示了一个潜在的相互作用的D[S/T]DD基序果蝇属编辑。此外，我们确定了两个DEDD氨基酸延伸，可以模拟D[S/T]DD基序的磷酸化（图3A级). 为了测试这些基序的功能意义，我们将磷酸化Ser（S496）和磷酸化Glu（E556，E621）残基与Ala交换，生成Ecd^三重A突变型（图3A级). 虽然三个丙氨酸残基的存在降低了与PIH1D1的结合，但Ecd降低了Pontin的量^三重A与野生型Ecd（Ecd）的降水效率相当^重量)（图3B公司和补充图S3A). 确定点突变的影响体内，我们利用Mosaic分析和可抑制标记（MARCM）技术(38)过度表达Ecd^三重AGFP标记的突变蛋白电子海图EADs诱导的纯合突变细胞眼睛s-FLP介导的重组。为此，我们使用CRISPR-Cas9基因组编辑工具生成了一个电子海图功能丧失等位基因(电子海图^Δ)，除了前23个氨基酸外，几乎没有整个开放阅读框架(补充图S1A). 与对照组相比，只有少数单独的GFP阳性纯合子电子海图^Δ细胞存在于三龄EADs和成年眼睛中（图三维——G公司,3牛和补充图S1B、S1F)，这与纯合细胞的非条件致死性一致电子海图^我(三)23(22和补充图S1G)和一个条件电子海图¹等位基因(补充图S1C、S1E). 重要的是，Ecd的过度表达^三重A挽救了电子海图细胞缺陷导致克隆的大小和数量与对照和电子海图^Δ过表达Ecd的克隆^重量（图3小时——K（K）,3牛). 有趣的是，Ecd的过度表达^Δ34模拟致命药物产生的截短产物的蛋白质变体电子海图^我(三)23等位基因（图3A级和补充图S1A)未能挽救纯合子的生存能力电子海图^Δ突变型EAD细胞（图3升——N个)而它保留了结合S2细胞中R2TP成分的能力（图3C公司和补充图S3B). 值得注意的是，Ecd的过度表达^三重A或Ecd^Δ34野生型EAD细胞没有明显的表型结果，镶嵌型EAD和成人眼睛与对照组难以区分(补充图S3C–K).

这些结果表明，Ecd与R2TP伴侣复合体的两个组分Pontin和PIH1D1之间的相互作用在进化上是保守的，尽管与PIH1D1的结合可能需要除D[S/T/E]DD之外的其他基序体内实验反对Ecd作为组装的U5 snRNP和R2TP之间的连接物的主要功能，同时强调了Ecd蛋白的C末端部分对细胞存活的不可或缺的作用。

Ecd与七元Sm环的蛋白质相互作用

截断的Ecd^Δ34变异体能够与R2TP复合物成分相互作用，但不能在功能上替代野生型蛋白质体内，促使我们采取公正的方法来研究Ecd的蛋白质相互作用组^重量并将其与Ecd进行比较^Δ34为此，我们表达了Myc-tagged Ecd^重量和Ecd^Δ34在S2细胞中进行IP实验，然后进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析。欧洲共同体^重量相互作用组由61个显著富集的蛋白质组成（log₂差异|≥1且P（P）-值<0.05）与模拟样本相比（图4A级和补充数据集S1). 基因本体（GO）富集和聚类分析显示，与RNP组装和组织、RNA剪接、核酸代谢和基因表达相关的生物功能相关的术语过度表达（图4B类). 除了已经描述的Ecd结合伙伴外，如U5 snRNP和R2TP/PFDL共伴侣复合物的核心成分（图4A级, 4B类和补充数据集S1)，我们鉴定了七个Sm环、SmD3、SmB、SmD1和SmG的蛋白质作为Ecd可能的新的相互作用伙伴（图4A级, 4B类). 通过在S2细胞中进行独立的co-IP实验和使用亲和纯化重组His-tagged Ecd和SmD3蛋白在细菌中表达的下拉分析，进一步验证了Ecd与SmD3的直接结合，而不是SmB、SmG或SmF（图4D（四维）和补充图S4A、S4B). 重要的是，比较MS分析和后续co-IP实验表明SmD3与截断的Ecd结合^Δ34蛋白质相对于Ecd显著降低^重量，（图4摄氏度,4D（四维）和补充数据集S1)而Ecd的相互作用^重量和Ecd^Δ34与R2TP复合物成分（PIH1D1，Pontin）和Prp8没有显著差异（图4摄氏度,3C公司,补充图S3B和补充数据集S1).

总之，我们的蛋白质组学方法确定了已知的以及新的Ecd相互作用伙伴，包括U5-snRNP复合物的核心成分、Prp8和Sm环蛋白。我们进一步证明了Ecd与SmD3的直接结合，并且Ecd蛋白的完整C末端是与组装的U5 snRNP进行生产性结合所必需的。

Ecd故障干扰U5 snRNP的生物发生

Ecd沉淀Prp8和SmD3的能力以及缺乏Prp8时Prp8水平降低的事实进一步加强了Ecd在U5 snRNP生物发生中发挥作用的概念。为了确定Ecd功能障碍是否影响U5-snRNP的组成，我们在翅膀影像细胞中表达了HA标记的SmD3蛋白（SmD3:：HAnub>mRFP由于RNAi介导的沉默而导致Ecd野生型或缺陷的驱动程序。我们用HA特异性抗体从分离的WDs裂解液中免疫沉淀SmD3相互作用蛋白，并用LC-MS/MS进行分析1号机组,U2乐队,4号机组和U5 snRNA，SmD3下调了所有其他六个亚基（SmB、SmD1、SmD2、SmE、SmF和SmG）（图第5页, 5亿和补充数据集S2). 此外，SmD3相互作用组包含许多U snRNP特异蛋白，包括U5型剪接蛋白，这也反映在与RNP复合物组装和前mRNA剪接相关的GO类别的丰富中（图第5页-C和补充数据集S2). 值得注意的是，当Ecd功能受损时，SmD3与U5 snRNP核心成分的结合强烈减少，包括Prp8、I（3）72Ab（Brr2）、Snu114、Holn1、CG3436（SNRNP40）和CG10333（DDX23）（图第五天,5楼,补充图S5A和补充数据集S2). 一致的是，由这些蛋白质组成的GO类别受到了特别的影响，并且在对照组和电子海图缺陷样品（图第五版和补充数据集S2). 相反，Ecd的丢失并没有影响SmD3与其他Sm环亚单位的相互作用（图第五天和补充数据集S2）以及U snRNA，包括5号机组,1号机组或U2 snRNA，由RNA免疫沉淀（RIP）分析确定（图5克)，表明Prp8并入U5 snRNP遵循围绕U5 snRNA.

为了进一步阐明为什么Ecd-SmD3相互作用的破坏对U5 snRNP的生物发生尤其有害，而不是影响所有含Sm-ring的snRNP组装，我们测试了特定蛋白质相互作用的相互依赖性以及U snRNA有趣的是，RIP分析显示U5 snRNA但没有其他测试U snRNA带Ecd（图6A级). 此外，当用RNA酶A预处理S2细胞裂解物时，随着相互作用减弱，RNA的存在支持了Ecd与SmD3的有效结合（图6亿). 虽然Prp8与核心U5 snRNP的关联需要Ecd，但事实上，当成像细胞使用nubbin-Gal4，无人机myr mRFP，tub-Gal80^TS公司系统（以下简称节点^TS公司>mRFP公司)（图6摄氏度)表明Ecd和Prp8在有效结合SmD3方面相互依赖。与对照组相比，过度表达Prp8的影像细胞中Ecd和SmD3之间增强的相互作用进一步支持U5 snRNP组装的协同模式(补充图S6A).

总之，我们的结果证明了在U5-snRNP生物发生的后期步骤中对Ecd的特定需求，而在U5 snRNA独立于Ecd。Prp8在组装U5-snRNP颗粒上的有效负载依赖于Ecd及其与SmD3和U5 snRNA虽然电子海图损失中止了生物生成过程，导致Prp8不稳定。

欧洲共同体缺陷导致基因表达和剪接的转录全改变

U5 snRNP组成的显著变化是由于电子海图损失意味着细胞可能受到功能性snRNP颗粒数量不足的影响。考虑到剪接和转录之间的相互耦合，这种剪接体剥夺可能表现为基因表达和前信使核糖核酸剪接模式的广泛变化。事实上电子海图¹限制温度下的纯合幼虫显示2952个基因的错误表达，其中771个基因上调，2181个基因相对于对照下调₂FC|≥1且已调整P（P）-值<0.05作为截止值（图第7章和补充数据集S3). 后续GO聚类分析强调，与各种应激刺激反应、DNA修复、消化系统过程、谷胱甘肽、几丁质和氨基酸代谢相关的基因在转录物中显著富集，这些转录物在转录物的表达中上调电子海图¹突变幼虫。相反，下调基因与“蛋白酶体分解代谢过程”、“丙酮酸、嘌呤和苹果酸代谢”、“线粒体运输”和“微管运动蛋白组装和功能”相关的功能相关（图第7章和补充图S7A和补充数据集S3). 这些数据表明电子海图缺乏导致能量失衡、代谢和氧化还原平衡的丧失以及全球应激反应的激活。重要的是，通过RT-qPCR在独立样本上验证了几个候选基因的差异表达。与对照组相比GstE6，更新2，Ilp8年增加了电子海图¹采样，同时泥,Prosβ5R2和Prosβ4R2在29°C下显著下调，但在允许温度下没有下调（图第7页和补充图S7B). 尽管主要的表达U snRNA在影像组织中呈上升趋势电子海图¹在限制温度下，与相应的对照样品相比，这些变化都不显著(w个¹¹¹⁸29°C时）(补充图S7C).

基因表达的显著变化伴随着由切叶机算法(51)（图第8页和补充数据集S4). 我们确定了所有已知类型的剪接事件的改变，包括外显子跳过（ES），以及选择性的5′和3′剪接位点选择(补充图S7D和补充数据集S4)提示pre-mRNA剪接的系统性失调。有趣的是，这些错误剪接的基因并没有表现出对特定功能类别的富集。对选定候选人的独立RT-PCR证实了错误拼接事件电子海图包括外显子跳跃在内的缺失dre4型，编码促进染色质转录（FACT）复合物的染色质调节器（图8B类)以及内含子保留和剪接位点选择的变化过氧化物酶3(聚乙烯3)，这对过氧化物酶体的生物生成至关重要（图8摄氏度). 综上所述，这些结果表明，Ecd功能障碍导致基因表达和剪接畸变的全基因组变化，这与Ecd在控制U5 snRNP生物发生中的更普遍作用一致（图第8天).

讨论

多细胞生物在发育和成年过程中基因表达的动态调控需要高效准确的剪接机制。为了产生功能性剪接体，单个snRNP经历了一个严格控制时间和空间的逐步组装过程。在这项研究中，我们结合了功能遗传学、蛋白质组学和基因组学方法，将进化保守的蛋白质Ecd定义为U5 snRNP组装的关键介质，该介质保护核心剪接因子Prp8向形成snRNP颗粒的Sm蛋白环的递送（图第8天). 相比之下电子海图缺失会损害Prp8的稳定性和U5-snRNP的生物发生，导致基因表达和剪接的全基因组改变。

Ecd最初是通过隔离条件电子海图¹突变等位基因果蝇属(32,59). 而蜕皮缺陷和发育停滞电子海图¹纯合子突变幼虫被认为是由于主要类固醇激素蜕皮激素的系统性缺乏，利用遗传嵌合体进行的功能实验坚定地确立了Ecd对细胞生存的细胞自主需求(22,27和本研究）。最近在苍蝇和哺乳动物细胞中进行的一些研究进一步强调了Ecd的细胞内在作用，这些研究报告了Ecd与剪接机制蛋白的相互作用，特别是U5 snRNP的成分，以及与RNP组装相关的HSP90-R2TP/PFDL共同伴侣蛋白(19,22,24,26). 与Ecd在前mRNA剪接中的拟议作用一致，我们现在证明，像Prp8一样(60)Ecd功能在动物发育之后仍然至关重要，以维持组织功能和成年期的体内平衡。

我们的实验果蝇属S2细胞和幼虫组织体内揭示了Prp8蛋白总水平的降低是电子海图这表明，通过与Ecd Prp8结合，Prp8可能会稳定下来，并受到保护，免受不希望的相互作用。有趣的是，有报道称程序性下调所选snRNP蛋白以避免其聚集和蛋白毒性(19,61–63). 例如，PRMT5复合亚单位的敲除有助于Sm蛋白环在U snRNA导致Sm蛋白暂时积压，随后在HeLa细胞中溶酶体降解(61).

Prp8看护者的功能最近被指定为Hsp90-R2TP/PFDL共同伴侣复合物(19,25,26). 由于Hsp90的化学抑制导致哺乳动物培养细胞中Prp8蛋白水平降低，有人提出R2TP结合可以稳定未组装形式的Prp8，使其在细胞质中形成新的U5 snRNP(19). 有趣的是，Ecd和其他蛋白质，包括ZNHIT2和TSSC4，被鉴定为HeLa细胞中R2TP复合物和Prp8的假定相互作用物(19,64)ZNHIT2被强调为R2TP复合体和Prp8之间的桥接因子(23). 在这里，我们证明了Ecd与R2TP复合物的相互作用在果蝇属与哺乳动物细胞一样果蝇属Ecd到PIH1D1至少部分依赖于DSDD/DEDD基序，而与Pontin/RUVBL1的相互作用不受Ser/Glu被Ala取代的影响。然而，基因拯救实验提供了功能证据，证明Ecd•R2TP组合不是必需的体内虽然R2TP绑定受到影响，但Ecd^三重A突变蛋白完全恢复了电子海图影像盘细胞缺乏。相反，截断的Ecd^Δ34与Pontin、PIH1D1和Prp8相互作用不受影响的蛋白质(22以及这项研究），未能挽救。事实上^Δ34突变蛋白保留了与Prp8结合并可能保护其免受降解的能力，这强烈表明在电子海图缺陷细胞(电子海图¹,电子海图^RNA干扰)代表了一个表型特征，但本身并不是导致细胞活性丧失的原因。有趣的是，我们的无偏见蛋白质组学方法将SmD3确定为Ecd的新结合伙伴，并证明了Ecd蛋白C末端部分在介导这种相互作用中的关键作用。因此，基于这些发现，我们提出，Ecd的主要作用是充当核心U5 snRNP颗粒内Prp8亚组件和SmD3之间的适配器，而不是Prp8和R2TP复合体之间的适配器。我们进一步认为，Ecd有助于Prp8的稳定，它们的协同结合促进了与SmD3的有效相互作用，而它们对U5 snRNA赋予U5 snRNP组件特异性。重要的是，我们的数据与所描述的R2TP/PRFD及其辅因子TSSC4和ZNHIT2在系留和屏蔽Prp8中的作用没有冲突(19,23). 值得注意的是，果蝇属TSSC4正交，由编码果蝇属CG6674存在于Ecd相互作用组中。然而，TSSC4绑定到Ecd^重量和突变型Ecd^Δ34蛋白质没有差异。很容易推测，Ecd和R2TP可能会合作稳定Prp8在条件或组织中，这需要更高的U5 snRNP产量。Prp8-相关蛋白和R2TP复合体之间的这种多价相互作用可以提供稳健性，同时在没有任何一种适配器的情况下确保Prp8的最小稳定。

SmD3和Prp8之间的相互作用在缺乏Ecd的细胞中显著减弱，这与其在引导Prp8形成U5 snRNP方面的作用一致。此外，SmD3沉淀的所有其他U5 snRNP特异性蛋白，包括Brr2、Snu114、Holn1、snRNP40和DDX23的数量都较低。这些结果支持这样的观点，即Ecd促进U5 snRNP组装，而其丢失导致无法完全成熟的“无活性”U5 snRNA中间产物。考虑到Prp8的多结构域结构，以及它与U5 snRNA(65)，很容易推测Prp8是一个中心枢纽，它与核心U5 RNP结合，先于其他U5特异蛋白的细胞质和核负载(66). 或者，U5蛋白可能相互依赖，它们的稳定整合可以以协调的方式组织起来(62). Prp8是否作为种子促进其他U5特异性蛋白的结合是一个有趣的问题，有待进一步研究。有趣的是，除了与剪接机制相关的蛋白质的富集外，SmD3相互作用组还揭示了与核糖体生物发生、翻译和极细胞发育相关的因子的过度表达。这些数据与一份关于极性颗粒中存在非标准SmD3复合物的报告相一致果蝇属SmD3引导正确定位的卵母细胞奥斯卡mRNA可能独立于其在剪接中的作用(67). Sm蛋白和核糖体之间的串扰已在细菌、苍蝇以及哺乳动物细胞中被报道(68–70).

最后，成熟U5 snRNPs的细胞剥夺与电子海图缺乏幼虫。基于差异表达基因中特定GO类别的丰富性，我们提出异常基因表达是由于剪接体缺乏引起的，这会影响转录和前mRNA处理，但也反映了缺乏Ecd的不同细胞所产生的适应性应激反应。与DNA损伤和修复反应相关的基因上调和过度表达，包括11英里和Ku80型人类的苍蝇直系亲属XRCC5型以及错误拼接dre4型是一种保守组蛋白伴侣FACT复合物的成分，通过促进核小体的分解和组装促进转录(71)尤其值得注意的是，人们对异常的前mRNA处理和基因组不稳定性之间的联系机制越来越感兴趣，包括高度诱变DNA的形成：称为R-Loops的RNA杂交和DNA复制应激(72–76). 特定转录本是否对电子海图丢失、是什么使它们容易发生错误拼接，以及所谓的Ecd在维持基因组完整性方面的作用，这些都是未来有待解决的有趣问题。

数据可用性

原始和处理的下一代测序和质谱蛋白质组数据可在以下数据库中获得：

RNA-Seq数据：基因表达综合数据库(RRID：SCR_007303)GSE149056标准(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE149056). UCSC基因组浏览器会话的链接：https://genome-euro.ucsc.edu/s/dstankov/erkelenz_transcriptome_ecd1

质谱蛋白质组数据：Ecd蛋白相互作用组的蛋白质组变化（PXD）PXD019838果蝇属S2细胞和SmD3蛋白的PXD019761在翅膀想象盘中相互作用。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

致谢

S.E.和M.U.构思并设计了实验。T.B.生成了电子海图^Δ功能缺失等位基因和Ecd转基因股票。J.M.、T.B.、D.S.和M.U.在果蝇属肠。D.S.和M.U.进行并分析了克隆MARCM实验。S.E.进行了所有蛋白质组、生物化学和分子实验，分析并可视化了数据。阿拉斯加州。C.和M.U.收集并制备RNA-seq样品。D.S.和V.B.进行了基因表达和剪接分析。N.H.G.提供了剪接分析方面的建议。M.U.和N.H.G.监督研究并获得资金。M.U和S.E.撰写了手稿。所有作者都对手稿进行了审阅和评论。

我们感谢布卢明顿果蝇属由NIH拨款P40OD018537（BDSC，美国印第安纳州布卢明顿）、苏黎世ORFeome项目（瑞士苏黎世FlyORF）、果蝇属由NIH拨款2P40OD010949（DGRC，美国印第安纳州布卢明顿）支持的基因组资源中心，维也纳果蝇属资源中心（VDRC，奥地利维也纳）、苍蝇设施（剑桥大学遗传学系）、发育研究杂交瘤库（DSHB，爱荷华州爱荷华市，美国）和Manolis Pasparakis实验室（遗传研究所/CECAD科隆），用于苍蝇种群、质粒抗体和试剂。我们感谢Nils Teuscher、Paula Sauer、Agnieska Sokol和Thomas Schertel在寿命实验、质粒克隆和肠道测量方面提供的卓越技术援助和帮助。我们感谢弗拉基米尔·贝内斯（Vladimir Benes）和EMBL基因组学核心设施对mRNA进行测序，感谢CECAD/CMMC蛋白质组设施对质谱测量和分析。我们感谢加博尔·索尔达斯对手稿的讨论和评论。

资金

Fritz Thyssen基金会[10.15.1.022MN转M.U]；德国研究基金会（DFG）【GE 2014/6-2至N.H.G.，GE 2014/7-1至N.H.G；EXC 2030–390661388】。开放存取费用的资金来源：科隆大学。

利益冲突声明。未声明。

参考文献