补体因子H和猿猴病毒40以不同的构象结合GM1神经节苷脂

摘要

哺乳动物细胞表面装饰着各种聚糖链，这些聚糖链协调发育和防御，并被病原体利用来附着和进入细胞。虽然糖苷键原则上是灵活的，但给定聚糖样品的构象空间受到其整体化学结构施加的空间和静电限制。在这里，我们展示了GM1神经节苷脂（一种分支的单唾液酸化五糖，用作各种蛋白质的配体）的聚糖部分如何在与不同凝集素的相互作用中经历差异构象选择。使用STD NMR和X射线结晶学，我们发现先天性免疫调节因子H（FH）结合一个先前未报道的GM1构象，该构象与其他具有结构特征的GM1结合凝集素（如猿病毒40（SV40）衣壳）的GM1绑定位点不兼容。显式溶剂中游离聚糖在10μs时间尺度上的分子动力学模拟表明，FH结合构象仍然对应于吉布斯自由能图中的最小值。与SV40识别的GM1构象相反，FH结合的GM1构型与不良NOE约束有关，解释了它是如何逃逸的¹H–¹过去的H NOE限制建模，强调了聚糖结构整体表示的必要性。

引言

神经节苷脂是一种唾液酸化的鞘糖脂，分布于质膜的外叶，在那里调节发育过程，特别是神经系统细胞的发育过程(高里奥1986;Coskun等人，2011年). 由于神经节苷脂位于细胞表面，因此被病毒和细菌毒素利用以附着和进入细胞。GM1神经节苷脂是霍乱弧菌和大肠杆菌毒素和猿猴病毒40（SV40）(Eidels等人，1983年;Tsai等人，2003年). GM1还介导血清蛋白补体因子H（FH）识别后补体系统的下调(Okada等人，1982年;Michalek等人，1988年). 补体系统是先天免疫的一个分支，传统上分为三条途径，其中一条是所谓的替代途径（AP），需要对宿主细胞进行永久性主动下调。FH通过促进AP C3转化酶（C3bBb）的分解和为C3b的蛋白水解切割提供辅因子活性来介导这种调节。碳水化合物宿主标志物，即糖胺聚糖和唾液酸化聚糖，将FH吸引到健康宿主细胞。与SV40不同，SV40对GM1聚糖具有窄特异性(Tsai等人，2003年;Campanero-Rodes等人，2007年)，FH结合几种唾液酸化神经节苷脂和可溶性聚糖(Okada等人，1982年;Michalek等人，1988年;Blaum等人，2015年).

之前，我们解决了与GM3-三糖Neu5Acα2–3Galβ1–4Glc（随后表示为“GM3聚糖”，GM3_克) (Blaum等人.2015). GM1五糖（GM1_克)可以描述为GM3_克三糖加上一个额外的Galβ1–3GalNAc分支，或者由一个乳糖（3Galβ1-4Glc）茎组成，两个臂（分别由Neu5Ac和Galβ1-3GalNAc组成）附着在乳糖Gal环上。与GM3相比，Galβ1-3 GalNAC分支被认为降低了GM1中GM3样茎的柔韧性(Acquotti等人，1990年;Brocca等人，1998年). 假设GalNAc NH和Neu5Ac羧基之间的氢键可以稳定GM1的单一构象(Acquotti等人，1990年;Scarsdale等人，1990年;德马科和伍兹2009). GM1的几种结构_克与蛋白质的复合物已被报道(Merritt等人，1997年,1998;Neu等人，2008年;Feng等人，2010年;Bian等人，2011年;Holmner等人，2011年;Ng等人2013)然而，所有这些都显示了与GM3不同的类GM3茎的构象_克FH-GM3中的构象_克复杂，与FH绑定不兼容。具体而言，这些GM1复合物中Neu5Ac环的取向将导致FH和GM1中Galβ1–3GalNAc分支之间的冲突（图1). 然而，FH能够识别GM3和GM1(Okada等人，1982年;Michalek等人，1988年;Blaum等人.2015). 我们结合饱和转移差（STD）核磁共振、晶体学和微秒MD模拟研究了这一明显的矛盾。我们的结果表明，蛋白结合和游离GM1中至少存在Neu5Acα2–3Gal糖苷键的两种不同构象。在未结合聚糖的吉布斯自由能图中发现了这种糖苷键的两个极小值。由于FH和SV40主要衣壳蛋白VP1各自只识别两种构象中的一种，因此不同的蛋白质会差异地选择对应于这些最小值的构象。FH结合构象中的相互距离相对较大，因此相关的GM1构象在¹H–¹游离GM1的H NOESY光谱和NOE限制模型，强调了互补技术充分描述聚糖3D结构的必要性。

结果

SV40和FH识别溶液中不同的GM1表位

与GM1结合的SV40主要衣壳蛋白VP1的高分辨率晶体结构_克代表目前沉积的GM1_克蛋白质数据库（PDB）中的结构，是用于比较的有用的GM1复合结构(Neu等人，2008年). SV40 VP1-GM1的STD核磁共振谱_克复合物表现出五个GM1吡喃糖环中的每一个的共振（图2)最突出的是Neu5Ac，最少的是Glc。未观察到SV40 VP1到GM3的饱和转移_克（未显示），表明GM1中的Galβ1–3GalNAc分支对相互作用是必要的。这一观察结果与聚糖微阵列数据一致(Neu等人，2008年)和SV40 VP1-GM1_克Galβ1–3GalNAc和Neu5Ac分支而非乳糖茎与VP1进行特定相互作用的晶体结构(Neu等人，2008年). 相反，FH与GM1配合物的STD NMR谱_克明显不同（图2). 从SV40谱中更强的H2和H4共振判断，终端Gal几乎没有从FH接收到饱和。GalNAc甲基和H4也从SV40 VP1获得比FH更多的饱和转移。另一方面，Neu5Ac甘油链和甲基以及中心Gal（H3，H4）和还原端Glc（H1，H2）环在两个STD光谱中都可见。光谱表明，FH识别的GM1表位小于SV40 VP1结合的表位。与SV40不同，FH很容易与GM3结合_克和饱和转移到GM3的所有三个环_克已观察到(Blaum等人.2015). 这两种蛋白质均未与代表GM1非唾液酸化臂的Galβ1–3GalNAc二糖结合_克（未显示）。这些观察结果表明，与SV40 VP1相比，FH的GM1结合表位仅由GM3样臂组成。FH-GM3的结构比较_克与GM1复合物_克-然而，PDB中含有复合物表明，GM1中的GM3亚结构必须采用新的构象才能与FH结合(Merritt等人，1997年,1998;Neu等人，2008年;Feng等人，2010年;Bian等人，2011年;Holmner等人，2011年;Ng等人，2013年)（图1).

FH以先前未发现的构象结合GM1

为了解决FH如何与GM3和GM1结合的问题，我们制备了FH（FH19-20）和C3b硫酯结构域（C3b-TED）的两个C端结构域的共晶体(Morgan等人，2011年)用GM1浸泡晶体_克（有关晶体表，请参见补充数据，表SI). FH19-20/TED共晶体的每个晶体不对称单元具有三条蛋白质链（因此有三个聚糖结合位点），以前发现适合用GM3浸泡_克(Blaum等人.2015). 就像GM3三糖，GM1_克与FH的C末端结构域（结构域20）结合，其总体外观由于突出的横向凸起而与保守的补体控制蛋白（CCP）折叠有些偏离，其中一个凸起包含Neu5Ac结合位点。在FH19–20/C3b TED/GM1中_克水晶只有一份GM1_克每个不对称单元对所有五个环（链E）都有很好的解析密度。在其中一条FH19-20链（链F）中，除非还原端Gal外，所有GM1环都可以信心十足地建模，只有Neu5Acα2–3Gal二糖在链D中建模。链D和F中的某些环缺乏良好的密度，可能是因为缺乏晶体接触，而晶体接触稳定了那些不受FH相互作用限制的糖苷键的单构象。然而，Neu5Acα2–3Gal二糖在所有三个GM1中采用几乎相同的构象_克非对称单元中的副本。晶体结构表明GM3_克GM1中的下部结构_克采用FH结合GM3的构象_克，与SV40结合构象有很大不同（图三,补充数据，表SII). 锚定GM1的氢键和盐桥网络_克与FH的相互作用也与GM3的相互作用相同_克FH残基在遗传上与一种罕见的遗传性肾病，即非典型溶血性尿毒症综合征有关，具有重要作用(Kavanagh等人，2013年;Blaum等人.2015). GM1的FH和SV40结合构象之间的最大差异_克是Neu5Acα2–3Gal糖苷键的方向，它采用高卢人-与FH（在每个不对称单元的所有三个独立链中）的复合物中的φ构象和反式-φ构象与SV40 VP1络合物。从Neu5Ac环（与SV40和FH相互作用的主要决定因素）来看，剩余的GM1四糖旋转约90°，导致GM1的整体拓扑结构发生显著变化（图三).

为了更容易区分GM1中的两个Neu5Acα2–3Gal构象，我们使用了一种符号，该符号考虑了Gal C3–O3键指向的Neu5Aic原子反式在这个符号中，Neu5Acα2–3Gal连接采用FH-GM1中的tC3构象_克复合物和与SV40 VP1和其他GM1复合物中的tC1构象_克-PDB中的复合物（图三). FH中观察到的tC3构象允许乳糖茎与色氨酸侧链（W1183）堆积，确保芳香环疏水性埋藏在非极性Gal B面下(Weis和Drickamer，1996年)以及有益的CH–π型相互作用（图三). 在其他GM1中观察到Gal残基掩埋色氨酸残基_克与霍乱和大肠杆菌毒素以及植物和人类半乳糖凝集素。在大多数这些络合物中，它是GM1中未支链的非还原端Gal_克经过堆叠的(Merritt等人，1997年,1998;Feng等人，2010年;Bian等人，2011年;Holmner等人，2011年;Ng等人，2013年). 在FH中，色氨酸残基对GM1的类GM3识别起着核心作用，因为它决定了与乳糖茎的相互作用。另一方面，Galβ1–3GalNAc臂不与FH发生任何相互作用，可以想象含有GM3-三糖茎的其他分支神经节苷脂也能与FH结合（图三). 这与SV40相反，其中Galβ1–3GalNAc分支是一个必要的结合行列式。

FH和SV40结合的GM1 Neu5Acα2–3Gal键的不同构象对应于吉布斯自由能图中的单独极小值

为了获得可能的GM1构象的补充信息，我们对自由GM1进行了计算分析_克在310 K显式溶剂中进行10µs MD模拟。糖苷键扭转角φ和ψ的吉布斯自由能表面图显示，GM1的Neu5Acα2–3Gal键的tC3和tC1构象_克定义两个具有非常相似能量（ΔE类=0.5千卡摩尔⁻¹)（图4). 如果K_d日对于络合物的形成，假设在1µM和1 mM之间（与通过STD NMR观察到的结果一致），两个GM1之间的自由能差异_克构象至少比络合物形成的自由能小一个数量级。免费GM1中的tC1:tC3种群分布_克310 K时为～70:30，tC1的最大寿命大于120 ns，这解释了为什么在小于100 ns的MD模拟中，tC1和tC3之间只发生很少或没有转换(补充数据，图S2). 用FH GM1对复合体进行MD模拟_克当绑定到SV40时，只填充了tC3构象和tC1（图4). 其他糖苷键的自由能表面在两种配合物之间没有显著差异(补充数据，图S1). 在游离聚糖中，一秒钟高卢人-φ型构象（我们命名中的tO6）对应于相对能量（ΔE类≈4.2千卡摩尔⁻¹，人口<1%）（图4). 我们不能排除这种构象可以在特定的生理环境中被GM1所采用。在GD1b中的（2–8）连接终端Neu5Ac中发现了tO6的示例_克与BK病毒主要衣壳蛋白结合(Neu等人，2013年)然而，该配合物的构象受晶体接触的影响。

讨论

我们的STD NMR和晶体学实验表明，FH和SV40 VP1识别两个不同的GM1_克构象是通过相互作用集实现的，这些相互作用集只与两个观测到的GM1构象中的一个构象兼容。在所有GM1中_克沉积在PDB中的复杂结构使Neu5Acα2–3Gal连杆采用反式-φ配置（tC1）（φ=C1–C2–O3–C3）(补充数据，表SII). 对于一些人(Merritt等人1997,1998;Neu等人2008;Holmner等人，2011年;Ng等人，2013年)但不是全部(Feng等人，2010年;Bian等人，2011年)在这些结构中，Neu5Ac环是蛋白质-聚糖相互作用的重要决定因素。这个高卢人-FH-GM1中观察到的φ（tC3）方向_克然而，GD1a六糖与腺病毒纤维球蛋白复合物中的GM1-like Neu5Acα2–3Gal分支采用了复合物(Nilsson等人，2011年)和GT1b七糖与肉毒毒素复合物(Stenmark等人，2008年) (补充数据，表SII). 对于非支链聚糖，如GM3_克Neu5Acα2–3Gal连锁经历了更大的构象灵活性，因此tC1和tC3构象的相对布居数发生了改变(Brocca等人，2000年;德马科和伍兹2009). 这两种构象都由几个蛋白-GM3表示_克PDB中的蛋白质-3′唾液乳糖胺（Neu5Acα2–3Galβ1–4GlcNAc）复合物(补充数据，表SIII).

我们的发现与一项优雅的核磁共振和模型研究很好地一致，该研究使用两种顺磁性探针评估了磷脂双核中的未结合GM1构象(DeMarco等人，2010年). 该研究的作者注意到，对于Neu5Ac和末端Gal环质子，在水溶性顺磁探针存在的情况下，纵向弛豫速率的标准偏差实质上更大，表明这些环的构象异质性明显。这种异质性可能是tC1和tC3构象互换的结果。相比之下，其他NOE限制的分子模型研究报告称，GM1中的GalNAcβ1–4[Neu5Acα2–3]Gal三糖形成一个刚性核，并且只采用tC1构象(Acquotti等人1990;Brocca等人，1998年). 如何解释这种差异？在后面的研究中，选择了实验条件，使得水交换性羟基质子之间的NOE交叉峰可以作为空间限制(Acquotti等人，1990年;Brocca等人，1998年)与室温和水溶液相比，低温或有机溶剂可以改变tC1/tC3比值。此外，对于tC1（SV40结合）构象GM1，不可变质子之间可能存在更强的NOE约束，这是由于此类质子在聚糖中的相对稀疏分布和NOE的短程特性造成的。直接比较¹H–¹能量最小化的tC1和tC3构象中的H距离实际上表明，tC1构象更可能是¹H–¹H NOE支持建模，假设单个GM1_克存在构造（表我). 仅在Neu5Ac H3ax和Gal H3（2.2μl）以及Neu5Aic H8和Gal之间的tC1构象中观察到特别强的NOE_b条H4（2.5奥）(Acquotti等人，1990年;Scarsdale等人，1990年;Brocca等人，1998年)（表我)并可能将NOE约束建模推向tC1构象。与tC1相比，预计不可变质子之间没有强NOE，这对于tC3构象来说是唯一的，因为它不具有<3º的质子间距，这表明它在¹H–¹H NOE实验（表我). 之前的一份报告指出，单个GM1_克构象不满足所有观察到的NOE限制。作者并没有确定另一个主要的构象，但认为这可能是由于几个小构象的存在，它们之间的距离特别小(Scarsdale等人，1990年). 另一份报告使用无限制的分子力学方法（随后对实验观察到的甘油侧链的优选构象进行构象过滤），发现此处描述的tC3构象的10-20%（研究中称为“B”）用GM1和GM2中存在的GM1型Neu5Aca（2–3）Gal臂在分支神经节苷脂头部组中取样(Brocca等人，2000年). 后一项研究的作者指出，迄今为止尚未观察到GM1的单个NOE交叉峰，该交叉峰可以证明tC3构象（Neu5Ac OH8和GalH3之间），并认为其可能处于NOE检测极限。在生物缓冲液中，不能观察到含有羟基的交叉峰，因为它们相互之间和溶剂（水）分子之间进行快速交换。Neu5AcH3ax和GalNAcH1或GalNAc甲基质子之间的NOE可能同样难以检测，因为质子间距离也为3.0–3.1º（表我)第二个糖苷键将这些质子分离，这使其更加复杂。因此，¹H–¹H–NOE限制似乎不足以准确描述中等复杂聚糖（如GM1）的构象空间。基于游离GM1剩余偶极耦合（RDCs）的核磁共振研究_克，与最近在纤维二糖上进行的类似(Bell等人，2013年)，可能通过实验识别这种聚糖的刚性和柔性部分。另一种有希望的方法是使用顺磁标签，可以测量顺磁诱导的伪接触位移和RDC(Erdélyi等人，2011年).

在膜环境中，GM3和GM1中的还原端Glc环与神经节苷脂脂质锚直接相连，并且更容易接触脂溶性化合物而非水溶性化合物(DeMarco等人，2010年). 我们的晶体结构以及在基于双细胞的分析中观察到GM1抑制补体AP(Okada等人，1982年;Michalek等人，1988年)因此提示FH与内皮细胞膜的接近程度较高。在这种情况下，应该注意到，含有Neu5Ac结合位点的FH C末端结构域包含大量的碱性氨基酸，导致理论上的p我第9.6页。在膜环境中，这些赖氨酸和精氨酸残基可用于补偿脂质双层磷酸基团的负电荷。

我们的发现证明了不同的蛋白质是如何识别GM1聚糖部分的不同构象的，GM1是一种重要的神经节苷脂，其构象多样性迄今被低估。据报道，其他复杂聚糖如唾液酸路易斯的构象选择^x(库克等人，1994年;Schefler等人，1995年;Haselhorst等人，2001年)它是蛋白质-聚糖识别中的一个主要结构决定因素，拓宽了聚糖的结构信息，对凝集素的特异性起着重要作用。事实上，FH和SV40选择性地（且仅限于）结合到不同的GM1构象，这使得FH可以同时识别GM3和GM1-tC3（以及可能的其他相关聚糖），而SV40则不能。因此，聚糖的构象灵活性为蛋白质-聚糖识别过程增加了一层复杂性，这可能有助于复杂生物体中此类识别过程的微调。本报告进一步强调了将结构生物学的互补方法结合起来的必要性，以便充分描述复杂聚糖的构象空间，可以通过核磁共振和晶体学验证的MD模拟生成的结构系综来更准确地描述复杂聚糖。

材料和方法

蛋白质和GM1聚糖

用于核磁共振实验的全长FH购自Complement Technology，Inc.。用于晶体学的FH19-20和C3b TED结构体在毕赤酵母和大肠杆菌分别是。这两种蛋白质的表达和纯化在其他地方有描述(Herbert等人，2006年;Morgan等人，2011年). GM1聚糖购自Elicityl。

核磁共振波谱

使用3 mm管（200µL样品体积）和配备室温探头的Bruker AVII-600光谱仪在288 K下记录核磁共振谱。使用TOPSPIN 3.0（Bruker）处理光谱。含有2 mM GM1的样品_克和11µM全长FH或30µM SV40 VP1（单体浓度）。在核磁共振实验之前，蛋白质被缓冲交换为20 mM磷酸钾，pH 7.4，150 mM氯化钠₂O.A 2 mM GM1型_克使用不含蛋白质的样品验证在STD脉冲程序的非共振辐照步骤中没有直接激发聚糖。此样本还用于分配GM1_克¹H和¹³基于一系列1D TOCSY和COSY光谱的C共振以及¹³C自然丰度¹H、，¹³C HSQC光谱。发布的GM1作业_克我们自己分配的相关聚糖用于验证GM1_克转让(Houliston等人，2009年;Neu等人，2012年;Reiss等人，2012年). 非共振和共振辐照频率分别设置为-30和7.3 ppm。使用57 Hz的辐照功率，使用50 ms高斯脉冲进行选择性激发，总饱和时间为2 s。总松弛延迟设置为3 s。为了抑制残余蛋白质信号，在采集之前使用强度为3.2 kHz的50 ms连续波自旋锁脉冲。总共记录了512次扫描。总共收集了8000个点，并在傅里叶变换之前将光谱与高斯窗函数相乘。光谱参考298 K，使用α-d日-Glc异聚质子作为内标物(Nicholson等人，1995年).

结晶学

如前所述，FH19-20和C3b TED的共晶体在20°C下通过吊滴蒸汽扩散生长(Morgan等人，2011年). 将晶体转移到40 mM GM1聚糖浸泡液中，该浸泡液由1µL 400 mM储备液（在20 mM Tris–HCl中，pH 7.0，50 mM NaCl）和9µL贮存液[0.1 M Tris-HCl，pH 9.0，8%（w/v）PEG 8 K]制备而成，并在浸泡液中保留20 min，然后用20%（v/v）逐步进行低温保护在液氮中闪速冷冻之前，储液罐溶液中的甘油。在瑞士维利根瑞士光源的X06DA光束线上采集了3600张0.1°/帧的衍射图像，并用XDS进行了处理(卡布施2010). pdb搜索引擎和糖结合数据库(Nakahara等人2008)用于获得GM1的全面概述_克-pdb中含有络合物。

模型建筑

FH19–20/C3b TED/GM3_克复杂(Blaum等人.2015)用于对REFMAC公司(Murshudov等人，1997年). 水分子被移除，GM1聚糖被手动放置在差异图中，模型在COOT中经历了几个实际空间细化周期(埃姆斯利和考坦2004)并使用REFMAC公司、ProSMART(Nicholls等人，2012年)和菲尼克斯(Adams等人，2010年). 使用MolProbity评估模型质量(Davis等人，2007年).

分子动力学

使用AMBER 12的tLEaP模块构建求解的GM1的拓扑文件(Case等人，2012年)和GLYCAM06构建块(Kirschner等人，2008年). 将氯化钠离子添加到大约0.1 M的浓度。在1 ns平衡后，使用AMBER PMEMD软件的GPU加速版本，在NVIDIA GeForce GTX 680 GPU上，在310 K的恒温和1 atm的恒压下对GM1的动力学进行采样，累计10µs（2×5µs）(Salomon-Ferrer等人，2013年). 使用粒子网格Ewald算法包括长范围静电，并使用TIP3P作为水模型。每10 ps记录一次结构快照。生产率为~165 ns/天（4952个原子），导致轨迹的总计算时间为85 GPU天。在310 K下对FH/GM1络合物（报道的晶体结构E链）和SV40/GM1复合物（PDB代码3BWR）进行了并行MD模拟。FH/GM2络合物的产生时间为220 ns（17 ns/天），SV40/GM2复合物的生成时间为120 ns（12 ns/天。SV40/GM1复合物被模拟为具有三个被GM1占据的位点的五聚体，这意味着GM1键被采样累积360ns。使用构象分析工具分析分子动力学轨迹(www.md-simulations.de/CAT/). 根据方程式Δ计算自由能图G=-RT在(第页/第页_最大). 有关详细信息，请参阅Frank等人（2007）.

PDB加入代码

FH19-20/C3b TED/GM1的原子坐标和结构因子_克复合体已提交给PDB（加入代码4ZH1）。

基金

这项工作得到了德国研究委员会（DFG，#BL 1294/2-1，至B.S.B.）和Tübingen fortüne大学医院项目（#2186-0-0，至B.S.B.）的支持。

利益冲突声明

未声明。

缩写

AP，替代途径；补体控制蛋白；FH，系数H；PDB，蛋白质数据库；STD，饱和传递差；SV40，猿猴病毒40。

致谢

作者感谢爱丁堡大学的杜珊·乌林、安德鲁·赫伯特和保罗·巴洛以及丹佛科罗拉多大学的乔纳森·汉南分别提供重组FH19-20和C3b TED。我们还感谢伦科·斯普兰格斯（Remco Sprangers）、位于图宾根的马克斯·皮安克发育生物学研究所（Max PIanck Institute for Developmental Biology in Tübingen）在核磁共振波谱采集方面的协助，以及瑞士光源束线研究所（Paul Scherrer Institution，Villigen，Switzerland）在X射线数据采集方面的帮助，以及罗伯特·尼科尔斯（Robert Nicholls）（英国剑桥市分子生物学获取有关使用ProSMART的建议。

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