白细胞介素-1受体相关激酶-1在Toll样受体（TLR）7和TLR9介导的干扰素-α诱导中起重要作用

在之前的研究中，我们发现IRF7与MyD88和TRAF6形成复合物以诱导IFN-α(28). 由于IRAK-1和IRAK-4与MyD88相关，我们研究了IRAK-1与IRAK-4是否参与IRF7复合物。我们首先通过共免疫沉淀实验分析了IRF7与IRAK-1或IRAK-4的相互作用。当用编码FLAG标记的IRF7和Myc-tagged IRAK-1或IRAK-4的质粒瞬时转染人类胚胎肾（HEK）293细胞时，FLAG–IRF7与表达Myc–IRAK-1而非Myc–IRAK-4的细胞中的抗Myc共沉淀(图1A） ●●●●。这表明IRAK-1而非IRAK-4与IRF7相互作用。我们进一步分析了IRAKs和IRF7在活细胞中的物理相互作用。我们用标记IRF7的黄色荧光蛋白（YFP）和标记IRAK-1或标记IRAK-4的青色荧光蛋白（CFP）转染HEK293细胞，然后通过反向荧光显微镜观察。与IRAK-4–CFP共表达时，IRF7–YFP在细胞质中广泛表达。相反，当与IRAK-1–CFP共表达时，IRF7–YFP在细胞质中以浓缩形式表达，IRAK-1-YFP位于细胞质中(图1B） ●●●●。当我们分析IRF7-YFP和IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP之间的物理相互作用时，我们在与IRAK-1合并的区域检测到来自IRF7的强荧光共振能量转移（FRET）信号，但没有检测到IRAK-4(图1B） ●●●●。当我们用IRF7-CFP和IRAK-1–YFP转染细胞时，我们还发现了相同的共定位和物理相互作用（未公布的数据）。我们通过流式细胞术测量FRET进一步证实了这一观察结果(28). 当用IRF7–YFP和IRAK-1–CFP或IRAK-4–CFP转染HEK293细胞时，只有表达IRF7和IRAK-1但不表达IRAK-4的细胞显示出强烈的FRET信号，这表明IRF7在活细胞的细胞质中直接与IRAK-1相互作用，但不与IRAK-4相互作用(图1B） ●●●●。反过来，当细胞被引入IRF7–CFP和IRAK-1–YFP时，也获得了类似的结果（未公布的数据）。

接下来，我们研究了IRF7的哪一部分负责与IRAK-1的相互作用。将Myc–IRAK-1与FLAG–IRF7或编码氨基酸1–285或1–237的FLAG–IR F7缺失突变体瞬时转染HEK293细胞。HEK293细胞中表达的FLAG–IRF7和FLAG–IRF7 1–285与抗Myc共沉淀，表明IRF7的238和285氨基酸之间的区域是与IRAK-1相互作用所必需的(图1C） ●●●●。先前显示IRF7的这一部分是与MyD88和TRAF6相互作用所必需的，这表明IRAK-1通过与这一部分的相互作用参与了复合体(28).

IRF7已被证明在病毒感染期间通过磷酸化COOH末端丝氨酸残基而被激活，并转位到细胞核中调节靶基因的表达，包括IFN-α(30). 因此，我们检测了IRAK-1的激酶活性是否是IRF7激活所必需的。用FlAG–IRF7和IRAK-1的Myc–IRAK-1或Myc–激酶阴性（KN）突变体转染HEK293细胞。然后在表达IRAK-1和IRAK-1 KN的细胞中与抗Myc共沉淀FLAG–IRF7(图2A） ●●●●。我们在表达Myc–IRAK-1的细胞中检测到FLAG–IRF7的缓慢迁移形式，但在共表达IRAK-1 KN的细胞中没有检测到，这表明IRAK-1通过其激酶活性诱导IRF7磷酸化(图2A） ●●●●。为了确定IRAK-1是否可以磷酸化IRF7的COOH末端，我们使用细菌表达的GST-IRF7作为底物进行体外激酶分析。IRAK-1、IRAK-1 KN、IRAK-4和IRAK-4 KN在HEK293细胞中表达，细胞裂解物用抗FlAG免疫沉淀。在IRAK-1的免疫沉淀物中发现GST–IRF7的磷酸化，但在IRAK-4中未发现(图2B） ●●●●。这些数据表明，IRAK-1在体外磷酸化IRF7，而不是IRAK-4。接下来我们测试了IRAK-1的激酶活性是否对IRF7的转录活性是必要的。在之前的工作中，我们通过共表达IRF7和MyD88显示了IFN-α启动子的协同激活(28). 然而，IRAK-1或IRAK-4与IRF7的过度表达均未导致HEK293细胞中IFN-α启动子的协同激活（未发表数据）。因此，我们将IRF7、MyD88和不同数量的IRAK-1 KN与携带IFN-α4启动子的报告质粒联合瞬时转染HEK293细胞。IRAK-1 KN以剂量依赖的方式抑制由MyD88和IRF7共表达诱导的IFN-α4启动子的激活，而IRAK-1 KN不抑制MyD88对NF-κB的激活。IRAK-1 KN的这种作用与仅包含COOH末端TRAF结构域（TRAF6C）的TRAF6截短突变形成鲜明对比，TRAF6作为显性阴性突变，干扰IFN-α4和NF-κB启动子的激活(图2C） ●●●●。这些数据表明IRAK-1在体外可以磷酸化IRF-7，IRAK-1的激酶活性对IRF7的转录活性是必需的，而对NF-κB的转录活性则不是必需的。

为了阐明IRAK-1在TLR-介导的IFN-α产生中的体内作用，我们通过使用来源于伊拉克-1^−/年老鼠。大量IFN-α的产生来自伊拉克-1^+/Y（Y）Flt3L–观察到BMDC对A/D型CpG ODN，D35的反应(31). 然而，干扰素-α的产生在伊拉克-1^−/年Flt3L–BMDC。相反，伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/Y（Y）Flt3L–BMDC对D35产生相似水平的TNF-α、IL-6和IL-12p40(图3A） ●●●●。此外，Northern blot分析显示，尽管IL-6 mRNA的诱导在伊拉克-1^−/年Flt3L–BMDCs，D35对IFN-α4mRNA的诱导也在伊拉克-1^−/年Flt3L–骨髓基质干细胞(图3B） ●●●●。

用Flt3L培养BM细胞可诱导两种pDC（B220⁺)和传统（B220⁻)跟单信用证(32). 虽然pDC是IFN-α产生的主要来源，但两种DC亚群都会产生前炎症细胞因子，如IL-12(4). 由于难以区分pDC中促炎细胞因子的诱导是否受损，我们进一步分析了B220中IFN-α和IL-12的产生⁺流式细胞术检测pDCs。Flt3L–BM–DC来自伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年用D35刺激小鼠，并用干扰素-α或IL-12抗体染色，同时用CD11c和B220染色。流式细胞术分析表明，D35诱导IFN-α的产生伊拉克-1^−/年B220型⁺与来自伊拉克-1^+/Y（Y）B220型⁺pDC。另一方面，IL-12的产生在伊拉克-1^−/年B220型⁺pDC(图3C） ●●●●。这些结果表明TLR9配体诱导的IFN-α生成在伊拉克-1^−/Y（Y）pDC。

ODN1668、K型或传统CpG ODN可刺激野生型Flt3L–BMDCs在0.01至0.1μM的低浓度下产生IFN-α(24)虽然最大诱导值小于D35刺激的DC。与A/D型CpG ODN的结果类似，对ODN1668应答的IFN-α的产生在伊拉克-1^−/年Flt3L–BMDC。然而，其他细胞因子的产生，如TNF-α、IL-6和IL-12 p40在伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年单元格(图4A） ●●●●。

由于TLR9配体诱导的IFN-α生成在伊拉克-1^−/年小鼠，我们还检测了TLR7介导的IFN-α诱导伊拉克-1^−/年老鼠。我们静脉注射伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年使用TLR7配体R-848的小鼠，并检测IFN-α的血清浓度。R-848注射后一小时内，伊拉克-1^+/Y（Y）小鼠的血清干扰素-α浓度增加，而血清干扰物-α水平在伊拉克-1^−/年老鼠。相反，IL-12p40的血清浓度在伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年小鼠(图4B） ●●●●。这些结果表明，IRAK-1也参与了TLR7介导的IFN-α的产生。

排除干扰素-α产生中固有缺陷的可能性伊拉克-1^−/−小鼠，我们将双链RNA，poly（I/C）转染到来源于伊拉克-1^+/Y（Y）小鼠并测量IFN-α的产生。伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年Flt3L–BMDC对poly（I/C）的反应产生了类似水平的IFN-α(图4C） ，表明了这一点伊拉克-1^−/年小鼠具有产生IFN-α的能力。因此，IRAK-1特别参与TLR7-和TLR9-介导的IFN-α的产生。

接下来我们研究了IRF7是否被TLR9配体激活伊拉克-1^−/年老鼠。我们刺激了来自伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年用抗IRF7或抗NF-κB、RelA免疫印迹分析核蛋白。在D35刺激后1 h，IRF7易位到细胞核，6 h时减少伊拉克-1^+/Y（Y）细胞。相反，IRF7未能在D35作用下进入细胞核伊拉克-1^−/年单元格(图5A） ●●●●。RelA在D35作用下转位到细胞核伊拉克-1^+/年和伊拉克-1^−/Y（Y）细胞，尽管在伊拉克-1^−/年(图5A） ●●●●。我们还通过免疫印迹分析分析了MAP激酶家族成员ERK1对D35的反应。ERK1的酪氨酸磷酸化在两者中都被诱导伊拉克-1^+/Y（Y）和伊拉克-1^−/年细胞，尽管磷酸化伊拉克-1^−/年细胞比伊拉克-1^+/Y（Y）单元格(图5B） ●●●●。这些结果表明，IRAK-1对IRF7的激活起着关键性的调节作用，并参与了对CpG ODN的应答而产生IFN-α。

IRAK-1最初被鉴定为IL-1治疗后IL-1R复合体中的激酶(16,17). 体外研究表明IRAK-1参与IL-1R–TLR信号的NF-κB活化(15). 体内研究使用伊拉克-1^−/−EFs证实IRAK-1对IL-1介导的IL-6的产生以及MAPK和NF-κB的激活至关重要(14,18). 然而，细胞因子的产生以及NF-κB的激活对TLR4配体、LPS的反应在伊拉克-1^−/−巨噬细胞(19)这表明IRAK-1在某些细胞类型对TLR配体的反应中是多余的。在本报告中，我们发现IRAK-1在pDC中的一种新功能。IRAK-1是TLR7和TLR9信号通路中IRF7激活所必需的调节因子。IRAK-1对于TLR9介导的NF-κB和MAP激酶激活以及pDC中促炎细胞因子的产生是不必要的。IRAK-1是激活IRF7途径诱导IFN-α产生的网关(图5C） ●●●●。

基于对IL-1R信号通路的研究，已经建立了一个解释IRAK-1激活机制的精细模型(15). 在配体刺激后，IRAK-1被招募到IL-1R，并与MyD88、IRAK-4和TRAF6形成复合物。提示IRAK-4位于IRAK-1的上游，并在IL-1R复合物中磷酸化IRAK-1。磷酸化触发IRAK-1自身激酶活性的诱导，导致多重磷酸化事件并增加其对TRAF6的亲和力(33,34). 因为据报道IRAK-1的激酶活性对下游NF-κB的激活是不必要的(35)激酶活性的确切作用尚不清楚。在pDC的TLR7和TLR9信号通路中，假设在配体刺激时形成类似的受体复合物。遗传学研究表明，MyD88和IRAK-4对IFN-α和炎症细胞因子的诱导都至关重要(29)表明这些分子并不决定信号的特异性。此外，IRAK-4不直接与IRF7结合，表明IRAK-4在信号传递中作用于IRAK-1的上游。总之，IRAK-4可能通过IRAK-1的磷酸化参与IRF7途径。

人们认为IRF7的活化也受其磷酸化调节(36,37). 先前的研究表明，两种IKK相关激酶，TANK-binding kinase 1（TBK1）和inducible IKK（IKK我)参与IRF7和IRF3的磷酸化(38,39).TBK1型^−/−细胞对TLR3和TLR4刺激不能产生I型IFN(40——43). 然而，我们发现来自TBK1或IKK缺陷小鼠的pDC中对CpG ODN产生IFN-α我与野生型细胞相比没有受损(28). 尽管使用缺乏TBK1和IKK的小鼠进行了进一步的研究我将需要排除冗余的可能性(44)更有可能认为其他激酶参与TLR7和TLR9信号传导。另一方面，据报道，IRF7被MAPK激酶4（MKK4）–c-Jun NH激活₂-末端激酶（JNK）通路对紫外线和化疗药物的反应，导致DNA损伤(45). 这些观察结果表明，IRF7的激活可能发生在MAPK级联的下游，以响应某些刺激。然而，MAPK对TLR9配体的激活在伊拉克-1^−/Y（Y）pDC，表明另一条途径负责IRF7的激活。

在本研究中，我们发现IRAK-1在体外磷酸化了IRF7，IRAK-1 KN的表达抑制了MyD88和IRF7共表达诱导的IFN-α4启动子的激活。这些数据表明IRAK-1可能是IRF7的激酶。然而，我们无法通过IRAK-1显示IRF7的内源性磷酸化，因为这些实验对于少量IRF7表达和刺激依赖性的IRAK-1降解来说在技术上是困难的。此外，以前的研究表明，将IRAK-1 KN引入IRAK-1缺陷的293细胞中可以重建对IL-1的责任(35). 因此，不能排除IRAK-1的激酶活性对IRF7活化是不必要的。需要进一步的研究来阐明IRAK-1的激酶活性对于使用表达IRAK-1 KN的pDC发挥其功能是否必要和充分。

总之，我们目前的研究表明，IRAK-1是pDC中TLR7-和TLR9-介导的IFN-α生成的关键调节因子。这些结果为IRAK-1成为特异性调节IFN-α生成的治疗靶点提供了可能，从而治疗病毒感染和自身免疫性疾病。

IFN-α4启动子结构和内皮白细胞粘附分子（ELAM）启动子结构已在前面描述过(28). FLAG–IRF7，IRF7和TRAF6c的一系列缺失突变如前所述(28). 编码融合蛋白IRF7-CFP、IRAK-1-CFP、IRAK-4-CFP和IRAK-4-YFP的质粒基本上如前所述构建(28). 通过PCR获得IRF7的COOH末端部分，并将其连接到pGEX-5X1载体（Amersham Biosciences）的EcoRI和SalI位点。编码IRAK-1和IRAK-4的cDNA片段通过PCR从人类脾脏cDNA文库（CLONTECH Laboratories，Inc.）中扩增，用适当的限制性内切酶消化，并插入pFLAG–CMV2（Sigma-Aldrich）或pCMV-Myc（CLONTECH Laboratory，Inc.）。为了产生人类IRAK-1（K239A）和IRAK-4（K213/214A）的激酶阴性突变体，按照制造商（Stratagene）的规定，使用QuickChange XL-site定向突变试剂盒进行定点突变。PCR获得的DNA片段序列经DNA测序证实。

伊拉克-1^−/年小鼠由J.A.Thomas博士提供（德克萨斯大学西南医学中心，德克萨斯州达拉斯；18）。

Flt3L–BMDC的制备如前所述(24). 如前所述制备CpG寡核苷酸（D35和ODN1668）(24). R-848由日本能源公司制药和生物技术实验室提供(9). Poly（I/C）购自Amersham Biosciences，Inc.。Anti-IRF7、Anti-ERK和Anti-phosphalated-ERK分别购自Zymed Laboratories和New England Biolabs，Inc。

HEK293电池（10⁶)在100毫米的培养皿上接种。12小时后，将总计6.0μg的不同质粒与Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染细胞。如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹分析(28).

如前所述，将HEK293细胞接种在胶原涂层的玻璃培养皿上进行成像(28). 简而言之，细胞在配备冷却CCD摄像头的倒置显微镜上成像，并由MetaMorph软件（Universal Imaging Corp.）控制。在HEK293细胞中表达了一对与YFP或CFP融合的蛋白。使用以下滤波器组对细胞进行成像：用于CFP图像的MX0420激发滤波器和BP470-490发射滤波器（Olympus），用于FRET图像的MX0420激发过滤器和535DF35发射滤波器（欧米茄光学公司），以及510DF23激发过滤器（欧米加光学公司）以及用于YFP图像的560DF15发射滤波器（Omega Optical，Inc.）。在整个实验过程中使用了XF2052二向色反射镜（Omega Optical，Inc.）。CFP和FRET图像的曝光时间为200毫秒，YFP图像为100毫秒。数据采集后，测量CFP、FRET和YFP的平均强度，并通过由FRET分量组成的FRET滤波器组计算荧光强度（“校正”FRET、FRET^C类). 如前所述减去非FRET成分(28). 对于我们的实验条件，我们使用了以下方程式：FRET^C类=FRET−（0.34×CFP）−（0.02×YFP）。

为了流式细胞术分析FRET，将如上所述转染CFP和/或YFP融合蛋白的HEK293细胞重新悬浮在293表达介质（Invitrogen）中，并测量YFP（激发：488 nm；发射：530 nm）、CFP（激发：407 nm；发射：510 nm）、FRET（激发：40.7 nm；释放：535 nm）使用FAC aria（Becton Dickinson）和BD FACSDiVa软件。FRET表示为CFP激发获得的YFP发射除以CFP激发得到的CFP发射。

HEK293细胞接种在24孔板（10⁵cells/well）瞬时转染100ng荧光素酶报告质粒和总计900ng的各种表达载体。然后，36小时后，用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量总细胞裂解物中的荧光素素酶活性。同时转染肾素荧光素酶报告基因（50ng）作为内部对照。

Flt3-BMDC（10⁶细胞/孔）用不同浓度的CpG寡核苷酸D35和ODN1668刺激24小时。根据制造商的说明（TNF-α和IL-12 p40的Genzyme、IL-6的研发和IFN-α的PBL生物实验室），用ELISA测定培养上清液中TNF-β、IL-6、IL-12 p 40和IFN-β的浓度。用ELISA法测定血清细胞因子IFN-α和IL-12 p40的浓度。

200万个HEK-293细胞接种在一个60毫米直径的培养皿中。24小时后，使用制造商规定的Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染细胞，共转染5.0μg空质粒或指示质粒（2.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-1或IRAK-1，4.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-4或IRAK-4 KN）。转染36 h后收集细胞，进行裂解，然后用蛋白G–Sepharose和1.0μG抗FLAG M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich）进行免疫沉淀，并旋转12 h。用裂解缓冲液洗涤珠子四次，用激酶分析缓冲液洗涤另外三次（20 mM Hepes，pH 7.5，20 mM MgCl₂，3 mM氯化锰₂和10 mMβ-甘油磷酸）。免疫沉淀剂与2.0μg GST-IRF7和10 mCi[γ-³²P] ATP（Amersham Biosciences）在30°C下保持30分钟。通过添加Laemmli样品缓冲液停止激酶反应，并在4~20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离。凝胶被扣留、干燥并暴露于X射线胶片。

对于细胞内IFN-α和IL-12p40染色，用3μM D35处理Flt3L-DC并培养5 h。再添加高尔基球蛋白（BD Biosciences）3 h，收集细胞并固定在多聚甲醛中。使用大鼠抗鼠IFN-α（克隆F18，Hycult Biotechnology b.v.，克隆RMMA-1；PBL Biomedical Laboratories）、生物素化鼠抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch Laborators）和链霉亲和素APC（BD Biosciences）的混合物在含皂苷的缓冲液中进行IFN-α染色；46). 使用抗IL-12-PE（BD Biosciences）在含皂苷的缓冲液中对IL-12进行染色。随后用抗CD11c-FITC（克隆HL3）和抗B220–cychrome（克隆RA3-6B2）对细胞进行染色，并在FACSCalibur（BD Biosciences）上进行分析。

我们感谢James A.Thomas博士伊拉克-1^-/年老鼠。我们感谢H.Tomizawa为FRET分析提供R-848和K.Terai和S.Tanaka（BD Biosciences）。我们还感谢N.Kitagaki的技术援助和M.Hashimoto的秘书协助。

这项工作得到了特别协调基金、教育、文化、体育、科学和技术部以及日本青年科学促进会研究金的资助。

作者没有相互冲突的经济利益。