帕金被选择性地招募到受损的线粒体并促进其自噬

帕金森氏病是最常见的神经退行性运动障碍。尽管大多数病例是散发性的，但最近有几个基因与家族性帕金森病有关，而编码泛素连接酶Parkin的基因Park2的功能缺失突变是最常见的隐性原因(Kitada等人，1998年). 虽然Parkin功能与多种细胞功能有关，但对模型生物Parkin缺失的研究表明Parkin在维持线粒体功能和完整性方面可能具有保守作用(Abou-Sleiman等人，2006年;Hardy等人，2006年). 停车场-空黑腹果蝇表现出严重的表型，多巴胺能神经元丧失，精子发生中断，线粒体肿胀和紊乱，出现在间接飞行肌退化之前(Greene等人，2003年;Whitworth等人，2005年). 然而，Parkin如何影响线粒体功能和完整性尚不清楚。在这里，我们证明Parkin被选择性地招募到哺乳动物细胞中功能失调的线粒体中，并且在招募后，Parkin通过自噬体介导线粒体的吞噬及其随后的降解。

先前的研究得出了关于Parkin亚细胞定位的相互矛盾的结论，发现该蛋白存在于胞浆中或与ER或线粒体相关(Shimura等人，1999年;Darios等人，2003年;Kuroda等人，2006年). 我们使用PRK8单克隆抗体检测了内源性Parkin在HEK293细胞中的亚细胞定位，该细胞系表达相对较高水平的Parkin(Pawlyk等人，2003年). 与大多数研究一致，我们发现内源性Parkin主要位于胞浆中(图1、a和c). 然而，在一些细胞中，观察到Parkin和线粒体子集之间的共定位，线粒体较小且呈碎片状(图1 a).

最近，线粒体分裂与帕金的功能有关(邓等人，2008;Poole等人，2008年;Yang等人，2008)以及缺乏膜电位的小缺陷线粒体的自噬(Elmore等人，2001年;托尔科夫斯基等人，2002年;Twig等人，2008年). 为了测试线粒体去极化是否导致Parkin在线粒体上积聚，我们用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯肼（CCCP）处理HEK293细胞。在添加CCCP后的1小时内，内源性Parkin被招募到大多数细胞的线粒体中(图1b)并且在Western blots上增加了重膜颗粒的外观(图1c). 尽管大鼠皮层神经元培养物的膜颗粒中显示出比HEK293细胞更多的Parkin，但线粒体与CCCP的解耦联增加了膜颗粒中的水平(图1 d). YFP-Parkin在HeLa细胞中表达，其内源性Parkin表达很少或没有(Denison等人，2003年;Pawlyk等人，2003年)在99%以上的细胞中显示出胞浆分布。与HEK293细胞内的内源性Parkin一样，CCCP暴露诱导了YFP-Parkin从胞浆重新分布到线粒体(图1，e和f; 和视频1，可用）。ATP合酶抑制剂寡霉素的加入并没有抑制CCCP诱导的Parkin在线粒体上的积累（这降低了线粒体解偶联剂的ATP消耗；单独使用CCCP时为78.49±2.61%[平均值±SD]，而CCCP+寡霉素时为77.35±7.64%；图1，e和f). Western blot还显示，CCCP处理后，YFP-Parkin从胞浆重新分布到重膜颗粒(图1 g). 此外，YFP-Parkin被用于被百草枯农药破坏的去极化线粒体，百草枯被认为会增加复杂的I依赖性活性氧物种，并与帕金森综合征有关(图1小时、S1和S2，可用；Brooks等人，1999年;Cocheme和Murphy，2008年). 抗氧化剂未阻止CCCP诱导的招募N个-乙酰半胱氨酸，这表明Parkin易位不需要产生活性氧物种（图S1）。通过光漂白中的荧光损失（FLIP）检测线粒体去极化引起的Parkin线粒体易位。与未接触CCCP的HeLa细胞中的整个YFP-Parkin池相比，CCCP处理细胞中线粒体定位的YFP-Parkin在光漂白中耗竭的速度较慢，这表明YFP-Parkin对线粒体的亲和力在去极化后增加(图2，a–c).

表达部分冗余线粒体融合蛋白（Mfn）的基因Mfn1和Mfn2的双重敲除导致线粒体融合的慢性抑制，产生了碎片线粒体的异质群体，其中一些线粒体相对缺乏呼吸系统，膜电位较低(Chen等人，2005年). 如果Parkin募集是膜去极化的结果，那么Mfn1−/−、Mfn2−/–双敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的外源Parkin将被预测选择性地聚集在膜电位较低的线粒体上。野生型（WT）MEF显示Parkin阳性线粒体的细胞范围为1.99±2%，YFP-帕金与线粒体共定位于1.33±1.15%的Mfn1−/−细胞和3.33±1.15%Mfn2−/-细胞。然而，在Mfn1−/−、Mfn2−/–双敲除MEF中，YFP-Parkin在86.20±3.95%的细胞中与线粒体共定位(图2、d和e; 和图S2；Mfn1−/−、Mfn2−/–vs.WT（双尾）的P<0.001t吨测试]）。有趣的是，在Mfn1−/−、Mfn2−/–细胞中，Parkin被招募到单个细胞内线粒体的离散子集中(图2、d和f). 为了测试Parkin显示标记的线粒体是否降低了膜电位，我们在固定之前用MitoTracker红（一种潜在的线粒体染料）刺激细胞。线粒体MitoTracker染色较低的线粒体选择性积累YFP-Parkin(图2f). 为了量化这种关系，我们将这些细胞的线粒体体积数字分离为Parkin阳性集和Parkin阴性集，并测量每个细胞这些体积的平均MitoTracker强度。用YFP-Parkin标记的线粒体体积显示出相对于线粒体体积的平均MitoTracker强度低47%，而YFP-Parkin积累无法检测(图2 g; 487.00±81.5个任意单位[au]vs.258.3±61.7 au；P<0.001[双尾，成对t吨测试]，n个=9个单元格）。这些结果表明，Parkin可以被招募到细胞内的单个线粒体中，受损线粒体显示出比电化学活性线粒体更多的Parkin积累，这与Parkin选择性靶向受损线粒体的假设一致。

众所周知，线粒体去极化会导致其分裂成多个较小的细胞器(Legros等人，2002年)通过抑制细胞器融合(Meeusen等人，2004年). 最近的遗传学研究将Parkin活性与控制线粒体分裂和融合的基因产物联系起来(邓等人，2008;Poole等人，2008年;Yang等人，2008)这表明Parkin向线粒体募集可能是去极化诱导的碎片化的结果。为了验证这一假设，CCCP诱导线粒体断裂(图3 a)通过过度表达线粒体裂变蛋白动力相关蛋白1（Drp1；图3c;Smirnova等人，2001年). 尽管表达Drp1K38A的CCCP处理细胞中的线粒体未能断裂，但仍显示Parkin沿着延长的线粒体堆积(图3、c和d)这表明线粒体断裂对Parkin易位是不必要的。病毒线粒体相关凋亡抑制因子（vMIA）在HeLa细胞中的表达，可导致线粒体断裂，膜电位扰动最小(McCormick等人，2003年)，不会导致Parkin在线粒体上积聚(图3、b和d)这也表明线粒体本身的过度断裂不足以导致Parkin募集。

为了进一步评估帕金对去极化线粒体的影响，我们跟踪了线粒体形态和质量随时间的变化。在缺乏Parkin的HeLa细胞中，添加CCCP后60分钟内线粒体出现碎片，但在接下来的48小时内几乎没有其他形态变化(图4，a和b). 相反，在表达Parkin的细胞中，线粒体质量在12小时内显著减少(图4a). 有趣的是，到48小时时，通过使用三种独立的线粒体标记物Tom20、细胞色素的免疫细胞化学评估，在Parkin表达细胞中未检测到线粒体c（c）和TRAP1(图4b). 与线粒体清除相比，过氧化物酶体的数量没有明显减少(图4、c和g)这表明帕金选择性诱导了与CCCP治疗中线粒体特异定位相一致的线粒体吞噬。

在有无Parkin表达的CCCP处理48小时后，我们还通过透射电镜检查了HeLa细胞线粒体。CCCP处理后，对照HeLa细胞中有丰富的线粒体，尽管它们看起来支离破碎，嵴稀疏(图4 d). 然而，90%表达YFP-Parkin的HeLa细胞很少或没有可检测到的线粒体结构(图4，e和f; 0.074±0.21线粒体/μm²含Parkin的细胞质与0.62±0.06线粒体/μm²细胞质无Parkin；P＜0.001，n个=每个条件22个单元格）。此外，缺乏线粒体的表达Parkin的HeLa细胞的电子密度溶酶体结构显著增加(图4，e和f; 0.38±0.23溶酶体/μm²Parkin的细胞面积vs.0.06±0.08溶酶体/μm²细胞质无Parkin；P＜0.001，n个=每个条件22个单元格）。

为了进一步证实细胞失去了线粒体，我们检查了它们在葡萄糖培养基或半乳糖培养基中的生长情况，因为它们缺乏葡萄糖。72.8%的未检测到线粒体的细胞在葡萄糖培养基中能够存活4d，而在半乳糖培养基中存活4d的细胞为0%(图4小时). 相比之下，大多数接受CCCP治疗但缺乏Parkin的对照细胞保留了线粒体，并能在葡萄糖和半乳糖培养基中存活至少4天(图4小时). 这些结果提供了生物化学证据，表明表达Parkin的细胞在去极化后缺乏线粒体功能，这与它们被消除的情况一致。

哺乳动物细胞的先前研究(Elmore等人，2001年;Schweers等人，2007年;Sandoval等人，2008年;Twig等人，2008年)已经得出结论，去极化线粒体被自噬降解。为了测试Parkin是否调节这一过程，我们使用稳定转染GFP-LC3的HeLa细胞评估了线粒体去极化后自噬体标记物LC3和线粒体之间的共定位(Bampton等人，2005年). 在未转染的HeLa细胞中，CCCP暴露1小时后，线粒体和自噬体之间几乎没有共定位(图5 a，左）。然而，CCCP处理后，经mCherry-Parkin特异性转染的细胞中，LC3标记的结构包围着破碎的线粒体(图5 a（右）明显大于Parkin缺乏的HeLa细胞（10.55±6.06 vs.0.09±0.36 LC3包绕线粒体/细胞；双侧t吨经检验，P<0.001；图5 b). 与Parkin积聚在线粒体上以自噬为目的的结论一致，CCCP治疗后Parkin与LC3共定位(图5c)但不是在之前（未示出）。

为了实验测试Parkin是否通过自噬介导线粒体清除，我们检测了缺乏自噬途径关键成分的ATG5−/−MEF中Parkin的活性(Hara等人，2006年). 支持Parkin促进受损线粒体自噬降解的假设，缺乏ATG5的细胞在CCCP治疗后保留Parkin靶向线粒体(图5、d和e). 同样，溶酶体抑制剂巴非霉素和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤阻断了帕金诱导的HeLa细胞有丝分裂(图5f和S3，可用）。

我们已经证明Parkin被招募去极化线粒体，并且Parkin促进线粒体的自噬降解。线粒体自发去极化和光毒性后的去极化与哺乳动物细胞的有丝分裂有关(Kim等人，2007年;Twig等人，2008年). 虽然对哺乳动物细胞中调节这一过程的蛋白质知之甚少，但最近发现BNIP3L/NIX通过触发线粒体膜电位的丧失而促进网织红细胞中线粒体的降解(Schweers等人，2007年;Sandoval等人，2008年). 我们的发现通过确定Parkin作为线粒体去极化下游有丝分裂的介体，在线粒体膜去极化和自噬之间提供了一种新的分子联系。

我们不知道Parkin在体内调节线粒体保真度的程度。长寿细胞可能需要更好的线粒体质量控制，而不是分裂细胞群，从而通过清除缺陷细胞来大规模丢弃受损的线粒体。因此，某些细胞类型，如神经元和心肌细胞，可能需要比增殖细胞群更强有力的细胞内线粒体监测。此外，在不同细胞类型或同时在同一细胞中，替代因子在多大程度上促进线粒体去极化下游的有丝分裂尚不清楚。

在D.黑腹果蝇线粒体融合基因的敲除可以部分补偿Parkin表型的丢失，这表明Parkin通常会促进线粒体分裂(邓等人，2008;Poole等人，2008年;Yang等人，2008). 我们的数据支持帕金对线粒体融合和裂变缺陷的补偿方式不太直接的观点。线粒体断裂本身并不表示Parkin募集，但线粒体融合中的严重缺陷确实会在线粒体失去膜电位时触发Parkin向线粒体募集。此外，线粒体分裂似乎是有丝分裂的先决条件(Twig等人，2008年). 因此，过量的裂变可以通过促进有丝分裂来补偿苍蝇体内帕金的损失(邓等人，2008;Poole等人，2008年).

Parkin过度表达也被证明可以补偿Pink1在D.黑腹果蝇(Clark等人，2006年;Park等人，2006年). 我们的结果表明，Parkin可能通过靶向受损的Pink1缺陷线粒体进行降解来进行补偿。Pink1基因敲除导致HeLa细胞线粒体膜电位降低(Exner等人，2007年)这表明Parkin可以通过激活Pink1缺失导致的功能失调线粒体的自噬来维持线粒体的保真度。

最重要的是，我们的结果表明，Parkin活性的丧失可能导致功能失调的线粒体堆积，从而导致帕金森氏病中的神经元丢失，Parkins通常通过激活受损细胞器的自噬来检测线粒体活性并维持线粒体的保真度。

使用Flp-In系统（Invitrogen）稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞按照制造商的说明进行培养，并保存在300μg/ml潮霉素（Sigma-Aldrich）中。胚胎第18天分离大鼠皮层神经元，并在补充B-27、，我-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。所有细胞培养材料均取自Invitrogen，所有化学品均取自Sigma-Aldrich。除百草枯、，N个-乙酰半胱氨酸和3-甲基腺嘌呤，新鲜添加到培养基中。Mfn1−/−、Mfn2−/–和Mfn1-/−，Mfn2-/−双敲除MEF由D.C.Chan（加利福尼亚州帕萨迪纳市加利福尼亚理工学院）慷慨捐赠，ATG5−/-MEF由N.Mizushima（日本东京医科牙科大学）捐赠，Flp-In-HeLa细胞由V.V.捐赠。Lobanenkov（马里兰州罗克维尔国立卫生研究院）和稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞由A.Tolkovsky（英国剑桥大学）捐赠。

使用Fugene 6（Roche）转染或共转染接种在硼硅酸盐室载玻片（Thermo Fisher Scientific）中的培养细胞和YFP-Parkin、ECFP-Pargin、mCherry-Parkin、DsRed-Mito（Clontech Laboratories，Inc.）、pcDNA3.1（Invitrogen）、vMIA和/或Drp1K38A构建物。Parkin-myc是M.Cookson（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）赠送的礼物。用4%多聚甲醛转染PBS后12–24小时，细胞固定。用以下一级抗体对细胞进行染色：小鼠单克隆细胞色素c（c）（BD）、兔多克隆Tom20（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、小鼠单克隆Parkin PRK8（Santa Cruz Bintechnologies，Inc.），兔多克隆PMP70（Invitrogen）和/或小鼠单克隆TRAP1（Abcam）；并带有以下二级抗体：小鼠和/或兔Alexa 488、594和633（Invitrogen）。为了评估线粒体膜电位，在固定或成像之前，用50 nM MitoTracker red（Invitrogen）对细胞进行15分钟的脉冲处理、清洗并再培养10分钟。为了评估细胞代谢潜力，用Hoechst 33342（Invitrogen）对细胞核进行染色。

使用倒置显微镜（LSM510 Meta；Carl Zeiss，Inc.）在25°C和37°C分别使用63×/1.4油DIC Plan Apo物镜对FLIP分析中的固定细胞和活细胞进行成像。对于FLIP分析，占据细胞约八分之一的漂白感兴趣区域（ROI）位于胞浆中相对无线粒体的部分。细胞交替漂白（在75%功率和100%传输的条件下使用30-mW氩激光进行488 nm的150次迭代），并成像（在75%的功率和2%传输条件下488 nm）10分钟（在整个实验过程中约60个周期）。用488和594激光获得漂白前后的双通道图像，以评估漂白前后线粒体的位置。将直径分别为～1和5μm的圆形ROI放置在靶细胞的线粒体和胞浆上，并将10μm的ROI放置于对照细胞上。在35°C的活细胞成像系统（UltraView LCI；PerkinElmer）上用100×/1.45α-Plan-Fluro物镜对HeLa细胞中YFP-Parkin易位进行成像。

在Photoshop（Adobe）中调整图像对比度和亮度。使用MetaMorph（MDS分析技术）通过行扫描评估结肠化。为了分析细胞线粒体膜电位，每个图像中的线粒体体素（细胞色素c（c）通道阈值≥400au）分为Parkin阳性（YFP-Parkin通道阈值≥1100au）或Parkin阴性亚群，并使用Volocity软件（Improvision）测量每个体素的MitoTracker强度。对于每个细胞，计算Parkin阳性和Parkin阴性亚群的每体素平均MitoTracker强度。Parkin阳性和Parkin阴性亚群之间的平均MitoTracker强度差异通过配对计算t吨测试。

如前所述，在体外培养2 d，采集并分离稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞、HEK293细胞和大鼠皮层神经元(Karbowski等人，2007年). 样品在SDS-PAGE上运行，并用以下抗体进行免疫印迹：多克隆兔抗GFP（Invitrogen）、小鼠单克隆抗Parkin（PRK8）和小鼠单克隆抗体Porin 31HL（EMD）。

用FACS对转染YFP-Parkin 18 h的HeLa细胞进行YFP分选。分选后，99.7%的细胞含有可检测的YFP信号。过夜培养后，用10μM CCCP处理细胞48 h，在室温下用4%戊二醛在0.1 N碳酸钠中固定1 h，并使用标准方案进行电子显微镜处理。随机选择22个表达Parkin的细胞和22个未转染的细胞，通过透射电子显微镜（200CX；JEOL Ltd.）和数码相机系统（XR-100；Advanced Microscopy Technologies，Corp.）在8000倍放大率下成像。使用美国国立卫生研究院ImageJ计算每个细胞的细胞质面积。

图S1显示百草枯和CCCP后YFP-Parkin向线粒体的募集+N个-乙酰半胱氨酸。图S2显示了百草枯后ECFP-Parkin对Mfn1−/−和Mfn2−/–细胞的补充以及YFP-Parpin对HeLa细胞去极化线粒体的选择性补充。图S3显示3-甲基腺嘌呤和巴非霉素引起的有丝分裂阻滞。视频1描述了HeLa细胞中CCCP去极化后YFP-蛋白向线粒体的募集。

我们感谢C.Smith、T.-H.Tao-Cheng和M.Cleland在共焦显微镜和电子显微镜方面的帮助，感谢M.Cookson在Parkin-myc方面的帮助；D.C.Chan代表Mfn1−/−、Mfn2−/–、Mfn 1−/-和Mfn 2−/-MEF；ATG5−/−MEF的北水岛；V.V.Lobanenkov用于HeLa细胞中的Flp-In；和A.Tolkovsky用于稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞。

这项工作得到了美国国立卫生研究院内部项目和日本生物医学和行为研究者科学研究促进会（发给田中A.Tanaka）的支持。