蛋白酶依赖性与非依赖性癌细胞侵袭程序：三维变形虫运动的回顾

肿瘤转化后，癌细胞通过基质细胞外基质（ECM）浸润局部组织并启动转移程序，ECM由I型胶原交联网络支配，I型胶原是哺乳动物中发现的主要细胞外蛋白(Brown等人，2003年;Sabeh等人，2004年;Demou等人，2005年;Oldberg等人，2007年;Magzoub等人，2008年). 为了克服这种结构障碍，癌细胞被提议使用蛋白酶依赖性或蛋白酶依赖性入侵方案(Wolf等人，2003a,b,2007;Sabeh等人，2004年;Wilkinson等人，2005年;卡拉格等人，2006年;Wyckoff等人，2006年;Gaggioli等人，2007年;克罗夫特和奥尔森，2008年;Gadea等人，2008年;Li等人，2008年;Pinner和Sahai，2008年;Sanz-Moreno等人，2008年;Packard等人，2009年). 蛋白酶依赖性侵袭程序依赖基质金属蛋白酶（MMP）家族成员裂解阻碍胶原纤维(Sabeh等人，2004年;Fisher等人，2006年;Hotary等人，2006年;Itoh和Seiki，2006年;Li等人，2008年;Packard等人，2009年). 或者，据报道，胶原屏障的协商是以不依赖蛋白酶的方式进行的，即癌细胞利用基于肌动球蛋白的机械力来物理置换基质原纤维，同时协调地采用类似于在髓系细胞群中观察到的变形虫样细胞形状(Friedl和Wolf，2003年;Wolf等人，2003a,b,2007;Wilkinson等人，2005年;卡拉格等人，2006年;Wyckoff等人，2006年;Gadea等人，2008年;Pinner和Sahai，2008年;Sanz-Moreno等人，2008年). 事实上，在最近的临床试验中，MMP抑制剂未能阻止癌症进展，这表明蛋白酶诱导的侵袭机制可能与体内生理相关(Friedl和Wolf，2003年;Wilkinson等人，2005年;Sahai等人，2007年;Wolf等人，2007年). 然而，对蛋白酶依赖性、变形虫样癌细胞行为的描述主要来自于使用模型、三维（3D）ECM构建物的体外分析，这些构建物可能无法再现体内外天然I型胶原网络显示的关键结构特征(Sabeh等人，2004年;Demou等人，2005年;Hotary等人，2006年;Packard等人，2009年). 因此，在癌细胞通过间质屏障贩运过程中，蛋白酶依赖性和独立性侵袭方式的相对重要性仍然是一个备受争议的话题。

为了重建体内类环境以迁移癌细胞，将HT-1080纤维肉瘤细胞的多细胞球体嵌入天然I型胶原的3D凝胶中(Hotary等人，2003年;Sabeh等人，2004年;Li等人，2008年). HT-1080细胞随后激活组织无创程序，并以“星爆”模式渗入周围ECM(图1 A). 迁移的HT-1080细胞在这些条件下至少表达三种不同的I型胶原酶溶解系统：分泌型金属酶MMP-1和MMP-2，以及膜锚定型蛋白酶MT1-MMP(图1 B) (Sabeh等人，2004年;Li等人，2008年). MMP-1和MMP-2联合siRNA依赖性沉默后，HT-1080球体保持充分的侵袭活性(图1，A–C). 相反，MT1-MMP沉默在三维培养期间几乎阻止了所有侵袭性活动(图1 A). 然而，当用小鼠MT1-MMP表达载体电穿孔MT1-MMP-沉默的细胞时，侵袭性活动被挽救，小鼠MT1-MMP是一种逃避人类特异性MT1-MMPsiRNA靶向的同源物(图1、A和C). MT1-MMP沉默的MDA-MB-231乳腺癌细胞或富含乳腺癌干细胞的SUM-159细胞系也获得了类似的结果(图1，A和C) (Korkaya等人，2008年).

沉默MT1-MMP单独对癌细胞侵袭活性的影响与肽模拟MMP抑制剂（如BB-2516/marimastat）在先前报道的临床癌症试验中未能发挥有益作用形成对比(总体和Kleifeld，2006年). 然而，重要的是，大多数患者的峰值血浆浓度（即～10–40 ng/ml）(Sparano等人，2004年)低于3D分析中完全阻断MT1-MMP依赖性侵袭活性所需的浓度（即～500 ng/ml；图1D). 因此，基质金属蛋白酶抑制剂对癌症患者的姑息作用无效，这可能反映出药物浓度的要求高于临床环境中可达到的浓度，并不一定支持体内存在蛋白酶依赖性侵袭活动。

MT1-MMP沉默的HT-1080或MDA-MB-231细胞嵌入3D I型胶原凝胶后，无法采用侵袭性变形虫表型，这与最近使用相同细胞系的报道相矛盾(Wolf等人，2003a,b,2007;Demou等人，2005年;卡拉格等人，2006年). 然而，这些研究中使用的基质是由胃蛋白酶提取的I型胶原蛋白（例如，Vitrogen）重建而成的，这是一种蛋白水解过程，可去除位于天然胶原蛋白分子N端和C端的非螺旋端肽(图2 A) (Wolf等人，2003a,b,2007;Demou等人，2005年;卡拉格等人，2006年;Gadea等人，2008年;Sanz-Moreno等人，2008年). 这些胶原端肽在纤维生成中起着重要作用，并含有关键的赖氨酸残基，在赖氨酸氧化酶依赖的体内氧化后，赖氨酸残留物支持稳定凝胶结构所必需的分子间共价交联(Gelman等人，1979年;布伦南和戴维森，1980年;Eyre等人，1984年;Woodley等人，1991年;Christiansen等人，2000年;佐藤等人，2000年). 因此，用于体外检测的重组胶原蛋白凝胶的结构完整性可能会影响癌细胞显示蛋白酶依赖性变形虫活性的能力。

在与用于全长天然I型胶原蛋白的条件相同的条件下形成凝胶后，胃蛋白酶提取的胶原蛋白形成纤维网络，与通过SEM评估的端肽接触胶原蛋白获得的纤维网络无法区分(图2 B). 然而，尽管对照胶原蛋白凝胶不溶于高盐缓冲液，但由胃蛋白酶提取材料制备的胶原蛋白基质可快速溶解，这是交联胶原蛋白凝胶与非交联胶原蛋白胶各自的物理化学行为特征(Gelman等人，1979年). 嵌入胃蛋白酶提取的胶原凝胶中的HT-1080球体以单细胞方式渗透基质，侵入性前部显示出球形和细长形状细胞的混合(图2 B). 在24小时内，迁移的HT-1080细胞侵入胃蛋白酶提取凝胶，在全长I型胶原基质中需要72小时的潜伏期(图2 B与。图1 C). MT1-MMP沉默、添加泛特异性MMP抑制剂GM6001或包含蛋白酶抑制剂的广谱混合物(Wolf等人，2003a)抑制HT-1080或MDA-MB-231细胞侵袭(图2、B和C).

I型胶原末端肽可能通过影响原纤维形成过程的线性或横向阶段，或通过支持胶原交联形成来调节侵袭(Gelman等人，1979年;Woodley等人，1991年;Christiansen等人，2000年;佐藤等人，2000年). 由于体内形成的赖氨酰氧化酶催化的胶原交联物的一个子集是酸溶性的席夫碱加合物，因此可以从幼年动物的组织中以几乎纯的形式酸提取完整的胶原蛋白(图2 A) (Eyre等人，1984年). 在低pH值下，这些交联被可逆破坏，从而形成含醛的胶原蛋白分子，这些胶原蛋白分子可完全溶解于低离子强度的酸性缓冲液中(图2 A) (Eyre等人，1984年). 当胶原蛋白凝胶在中性pH下重组时，连接胶原蛋白束的希夫碱加合物会自发重组，但这种交联过程可以通过在凝胶形成之前化学还原醛基部分来阻止(图2 A) (Gelman等人，1979年). 当HT-1080细胞嵌入醛还原的I型胶原3D凝胶中时，细胞表现出胃蛋白酶提取的胶原凝胶中观察到的更快的浸润速度，MT1-MMP沉默或添加GM6001均未显著抑制HT-1080或MDA-MB-231的侵袭(图2、B和C). 由于从完整胶原蛋白和胃蛋白酶提取的胶原蛋白制备的胶原蛋白凝胶的孔径相似(Demou等人，2005年)，我们得出结论，只有当胶原凝胶网络中形成的结构孔不再被共价交联所稳定时，MT1-MMP才会独立入侵(Zaman等人，2006年).

天然I型胶原的重组凝胶为研究调节癌细胞行为的结构和机械特性提供了重要的见解，但体内组装的纤维网络的精确结构无法在体外完全复制(Christiansen等人，2000年;Raub等人，2007年,2008). 为了确定蛋白酶依赖性和独立性入侵程序在活组织中的相对作用，我们将MDA-MB-231乳腺癌细胞球体植入正常人乳腺的外植体中，并将复合物移植到活鸡绒毛尿囊膜上(Sabeh等人，2004年). 在这种异种移植模型中，乳腺内的癌细胞球体在72小时的培养期内迅速浸润周围组织(图3 A). 虽然MMP-1和MMP-2都可以在体内调节乳腺癌行为(Tester等人，2004年;Wyatt等人，2005年;Gupta等人，2007年)，串联沉默这两种蛋白酶不会影响MDA-MB-231或SUM-159的侵袭(图3 B). 相反，MT1-MMP敲除能有效抑制乳腺癌细胞浸润或降解周围乳腺组织的能力(图3，A和B). 通过在siRNA处理的MDA-MB-231或SUM-159细胞中表达小鼠MT1-MMP，可以逆转人特异性MT1-MMP-siRNA的抑制作用(图3，A和B). 因此，MT1-MMP不仅通过交联胶原的重组凝胶支持3D癌细胞侵袭，而且在乳腺的基质环境中也支持3D癌细胞侵袭。

在天然I型胶原的重组凝胶中，孔径限制为～1µm(Demou等人，2005年). 在我们的实验条件下，MT1-MMP抑制的球体进入胶原孔的运动活性受限于丝状结构或运动细胞碎片的延伸(Mayer等人，2004年). 因此，由胶原纤维间共价交联稳定的刚性孔隙网络对癌细胞的流动性构成了重要的结构限制。目前的证据表明，迁移的癌细胞通过刚性孔的能力有限，刚性孔的直径明显小于细胞核的直径，细胞核是细胞内最大、最刚性的细胞器(鲁托夫等人，2003年;Demou等人，2005年;鲁托夫和哈贝尔，2005年;Nakayama等人，2005年;Raeber等人，2005年,2007;Ehrbar等人，2007年;Wolf和Friedl，2008年). 由于胶原蛋白凝胶的微观结构会受到温度、pH值、离子强度、离子化学计量比和单体浓度的影响(Roeder等人，2002年;Raub等人，2007年,2008)实验条件的微小但显著的变化可能会影响不同实验室获得的结果。然而，在我们的标准体外条件下产生的纤维直径（通过SEM评估为～60 nm）与体内肿瘤部位沉积的纤维直径相似(Oldberg等人，2007年). 此外，在我们的体外条件下产生的孔隙大小与最近的证明一致，即在体内注射到富含I型胶原蛋白的组织中的100nm珠无法扩散到距离注射部位很远的地方(McKee等人，2006年;长野等人，2008). 虽然描述癌细胞变形虫活性的研究子集使用了酸提取的胶原蛋白，但胶原蛋白交联程度或孔径并未进行评估(Wyckoff等人，2006年). 撇开这些警告不谈，I型胶原在体外的自组装和在体内的细胞介导组装是机械上不同的过程(Raub等人，2007年,2008). 体内,胶原蛋白原纤维可以更大，包含多种其他ECM成分，并显示出独特的机械性能(Raub等人，2007年,2008). 因此，在使用重建的胶原基质解释体外分析数据时应谨慎。然而，植入人类乳腺外植体的乳腺癌细胞仍然依赖于MT1-MMP依赖性蛋白水解，这使我们得出结论，迁移到生理相关组织的癌细胞面临着与体外全长生成的细胞相似的基质屏障，I型胶原蛋白的共价交联纤维。

独立于癌细胞穿越间质屏障的机制，越来越多的关注也集中在报道的癌细胞在穿越基底膜时经历间质-动物体转变的能力上，基底膜是一种围绕或位于上皮细胞、肌肉、神经、，和内皮(Wang等人，2003年;Zaman等人，2006年;Gadea等人，2007年;Kitzing等人，2007年;Sahai，2007年;Wolf等人，2007年;Fackler和Grosse，2008年;Rowe和Weiss，2008年). 然而，关于蛋白酶依赖性、变形虫型跨基底膜转运的结论同样基于人工ECM复合物，如Matrigel，一种非共价交联的基底膜大分子提取物，其结构组织无法重现体内观察到的结果(Even-Ram和Yamada，2005年;Hotary等人，2006年;Rowe和Weiss，2008年;Sodek等人，2008年). 使用从小鼠或人类组织中回收的真实基底膜，癌细胞同样使用MT1-MMP活性来穿越这些交联屏障(Hotary等人，2006年).

最终，体内环境的复杂环境不太可能在体外完全复制。氧张力、pH值、接触指导、癌细胞-基质细胞串扰以及该微环境中的生长因子/细胞因子环境的变化可能导致肿瘤部位特有的癌细胞行为改变(Anderson等人，2006年;Provenzano等人，2008b;Doyle等人，2009年). 要分析体内蛋白酶依赖性和独立性贩运机制的相对作用，需要将复杂的4D活体显微镜技术与条件敲除模型相结合，和/或在植入人源化小鼠体内的人类癌细胞原代群体中选择性沉默MT-MMP家族成员乳腺(Proia和Kuperwasser，2006年). 尽管此类研究可能即将进行(Alexander等人，2008年;Kedrin等人，2008年)一位简化论者对体外肿瘤细胞侵袭建模的方法表明，当研究人员试图将当前的见解扩展到体内环境时，必须谨慎地看待经常假设的癌细胞间质-动物体转变的“给定”，即允许蛋白酶依赖性侵袭。事实上，当面对孔径不允许被动细胞运动的刚性结构屏障时，癌细胞似乎几乎完全依赖于MT1-MMP活性，可能还依赖于密切相关的膜锚定胶原酶MT2-MMP(Hotary等人，2000年,2006). 当然，一个“一刀切”的模型——即使MT1-MMP在肿瘤细胞侵袭中的主导作用——在应用于复杂的体内环境时也经得起时间的考验。毫无疑问，体内会存在这样的条件：癌细胞会利用肌动球蛋白产生的力来移动阻碍屏障，或改变其核尺寸，以“挤压”狭窄的毛孔。然而，随着MT-MMP家族成员在癌症侵袭、生长和系统性传播中的重要作用不断明确(Taniwaki等人，2007年;胡等，2008;Husemann等人，2008年;McGowan和Duffy，2008年;Szabova等人，2008年;Devy等人，2009年)仔细控制的体外和体内模型应能让我们对通过ECM控制癌细胞迁移的机制有新的见解。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（CA071699号拨款）和乳腺癌研究基金会的支持。