微管与病灶粘连的纳米靶向性

微管解聚时，细胞极性丢失或受损，表明微管和肌动蛋白细胞骨架在细胞极化过程中发生了串扰(瓦西里耶夫，1985年). 现在普遍认为，微管通过将信号以空间方式传递到肌动蛋白细胞骨架来发挥极化作用，但对信号的性质及其传递方式的看法是不同的(Geiger和Bershadsky，2001年;Wittmann和Waterman-Storer，2001年;冈德森，2002;Kaverina等人，2002a;Small等人，2002年). 传统荧光显微镜提出了一种可能的信号转导途径，它表明微管生长并形成粘附复合体，肌动蛋白细胞骨架在这里与底物结合(Kaverina等人，1998年). 此外，还发现微管的这种粘附位点靶向事件可能与粘附复合物的周转或粘附释放有关(Kaverina等人，1999年). 因此，有人提出，微管通过以空间调节的方式调节底物粘附的模式，赋予肌动蛋白细胞骨架极性(Kaverina等人，1999年). 为了直接评估靶向的空间保真度，我们利用了全内反射荧光显微镜（TIRFM）技术。^*

在TIRFM中(阿克塞尔罗德，1989年;Steyer和Almers，2001年;Toomre和Manstein，2001年)也称为倏逝波显微镜，激发光通常穿透反射表面上方<150 nm，非常适合研究生长基质附近发生的细胞过程，例如细胞粘附(Truskey等人，1992年)和胞吐(Steyer和Almers，2001年;Toomre和Manstein，2001年). 在图1，活细胞的图像显示转染了GFP-tubulin或-zyxin（一种粘附位点成分），后者是使用传统荧光显微镜获得的(图1、A和B)和TIRFM(图1、C和D); 为清晰起见，TIRFM图像以负对比度呈现。在TIRFM中，微管沿其长度显示出分级的荧光强度，生长尖端处最亮的荧光位于细胞边缘，表明微管向基质“向下倾斜”，进入倏逝波（<150nm）的指数增加照明区域。已知Zyxin存在于基底粘附部位，偶尔沿着较大的应力纤维束出现周期性标记(图1B） ；在TIRFM中，只观察到腹侧粘连部位(图1D） 这表明腹侧应力纤维主要位于消逝波激发区的上方。

为了突出微管朝向细胞表面的方向，图中显示了映射到彩虹查找表的假彩色图像图2A.请注意，正末端尖端在μm大小的节段上显示出相对明亮且恒定的强度，这表明它们“骑行”在背侧细胞皮层附近。TIRFM的优点是，当荧光强度在距离表面约1/e处降低时(阿克塞尔罗德，1989年)z轴位置的微小变化会使信号发生较大变化，并且可以沿z轴确定对象的相对甚至绝对位置。中的代表图像图2B表明，紧密接触通常沿XY平面从～5–20μm延伸，此处观察到的微管通常以相对较浅的角度接近表面（<5°）。值得注意的是，如所示图2B、 正端微管尖端接近衬底50nm以内。

微管动力学的活细胞TIRFM成像揭示了两个引人注目的现象。首先，在生长和收缩阶段，微管尖端与基底的距离存在一致性差异(图3，A和B;视频1和视频2，可用）。强度测量表明，消逝区内微管末端的收缩强度与生长端的收缩强度相当，为～45±12%（来自21个微管的数据，包括生长期和收缩期）。其次，在聚合过程中，微管通常沿着相同的路径向细胞边缘的公共点移动(图3C类；视频1和视频2). 事实上，观察到多达四个微管遵循相同的轨迹。这种现象与外围区域中可以引导微管聚合的结构元件的存在是一致的。或者，二级和三级微管可以沿着一级微管“背驮”。无论是哪种方式，这都表明主目标事件可以沿着公共路径为后续目标事件创建线索。TIRFM也在哺乳动物细胞（PtK2）中观察到类似的微管动力学和追踪（未发表的数据）。

微管和基质粘附之间的空间相互作用，首次使用传统显微镜进行描述(Kaverina等人，1998年)双色TIRFM生动地证实了这一点。在联合转染GFP-tubulin和DsRed-zyxin的细胞中，视频分析显示微管向底物的倾斜始终与粘附位点的靶向有关(图4A和视频3). 不同类型的目标事件的示例在图4（B和C）及随附视频(视频4和视频5). 通过每秒记录图像获取视频序列，总时间约为1–4分钟。在这样短的时间内，可以记录多个目标事件(图4A和视频3). 通过使用反色，在接近病灶粘连的过程中，微管和末端区域的高强度变得更加明显(图4A和视频3).

然而，这些不断增长的微管末端代表着“滑动”事件还是微管加末端的“新聚合”？微管聚合的动力学可以通过使用积累在微管生长尖端的特定荧光标记蛋白质进行独立评估(施罗德，2001;Schuyler和Pellman，2001年). 其中的几种蛋白质，包括CLIP-170，这是微管尖端蛋白质中首次描述的(Rickard和Kreis，1990年)当聚合停止时，从微管的正端分离(Perez等人，1999年). 在图5（A和B），视频帧显示了与DsRed-zyxin和GFP–CLIP-170共同转染的细胞；为了便于说明，GFP–CLIP-170标记的微管尖端的轨迹(Mimori-Kiyosue等人，2000年)如所示图5C代表单个微管(图5B、 铅笔箭头）。在双色共焦延时序列中(图5A） 和随附视频(视频6)CLIP-170与微管尖端在通往外周粘连的过程中保持联系，以酶蛋白为标志。这清楚地表明，靶向涉及微管聚合（而不是滑动）到粘附复合物中。双色TIRFM(图5、B和C;视频7)，GFP–CLIP-170标记再次显示，甚至可能比GFP微管蛋白更生动(图5D和视频8)微管聚合进入粘附焦点的路径包括追踪背表面150nm范围内的倏逝波激发区域内生长的微管尖端。

在早期的研究中，我们注意到微管可以特异性地靶向一组紧密间隔的粘连中的单个粘连位点(Kaverina等人，1998年,1999). TIRFM显示，这种靶向的高精度可能是限制微管和粘连之间的空间串扰所必需的，以允许调节单个粘连病灶的翻转。连续的微管可以沿着相同的轨迹进入粘附位点，这一事实与微管沿着另一种细胞骨架元件聚合的指导一致，该元件终止于粘附复合物。关于这可能如何发生的猜测已经在之前播出(Kaverina等人，1998年;Small和Kaverina，2003年)并且，在本研究结果的背景下，在图5E.最可能的导向途径是肌动蛋白，因为微管靶向也发生在缺乏中间丝的细胞中(Kaverina等人，1998年). 芽殖酵母的最新研究结果已经提出了一种可能的指导方法(Yin等人，2000年)其中微管直接聚合到芽中涉及肌球蛋白V同系物，该同系物位于微管尖端复合物中。这是一个很有吸引力的可能性，因为我们已经证明微管聚合是由肌动蛋白细胞骨架中压力的增加刺激的(Kaverina等人，2002b)这表明微管可能沿着处于张力下的肌动蛋白丝运动(图5E） ●●●●。微管尖端的肌球蛋白马达可以通过识别肌动蛋白细丝（其构象或组成在压力下发生改变），很容易在这一过程中充当机械传感器。或者，也可以同时使用另一个耦合组件(图5E、 盒装区）可能参与结合微管和肌动蛋白丝。已经描述了一些结合肌动蛋白和微管的蛋白质(加文，1997年)但这种交联剂是否存在于微管尖端仍有待证明，因为必须在微管尖端启动引导。进一步的研究旨在测试这些替代制导方案。

消逝波显微镜显示，聚合微管向下倾斜进入粘附位点，可以用微管与肌动蛋白轨道对接来解释，肌动蛋白轨迹会导致基质粘附位点(图5E） ●●●●。在同样的背景下，微管收缩时迅速从基底上提起可能反映了微管尖端从同一轨道上释放。提升与微管解聚相称，解聚伴随着尖端蛋白的损失，符合引导过程中微管尖端复合物的要求(图5E、 方框区域）。考虑到所涉及的相对尺寸，最能理解微管在纳米范围（约50 nm）内与粘附位点相互作用这一发现的重要性(图5E、 方框区域）。将焦点黏附物本身与底物隔开～15 nm，微管直径为24 nm，以及与微管+末端相关的一层蛋白质(施罗德，2001)微管尖端必须接近粘附位点，以允许分子相互作用的密切串扰。这种亲密关系也可能是在细胞皮层捕获微管和末端的基础，可能涉及动力蛋白-动力蛋白复合物(冈德森，2002). 微管和肌动蛋白细胞骨架之间的串扰牵涉到各种分子(Goode等人，2000年;Wittmann和Waterman-Storer，2001年;Kaverina等人，2002a;Krendel等人，2002年;Small和Kaverina，2003年)，但它们的相关角色仍有待定义。通过利用TIRFM方法以及揭示或修改候选分子和配合物动力学的探针，将有助于进一步了解这一现象。

金鱼鳍成纤维细胞（品系CAR，编号CCL71；美国型培养物收藏）在含有HBSS、非必需氨基酸和15%FBS的基础Eagle培养基中培养25°C。

为了表达GFP融合蛋白，使用了pEGFP-C2载体中的小鼠β-微管蛋白和pEGFP-N1载体中的人类酶蛋白。EGFP-酵素(Rottner等人，2001年)和EGFP-tubulin由Jurgen Wehland及其同事（Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung，Braunschweig，德国）提供。DsRed-zyxin是Anna Huttenlocher（威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星州麦迪逊）赠送的礼物，GFP–CLIP-170是Anna Akhamanova（荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学）捐赠的。

将CAR细胞的亚流单层培养物放置在30 mm的培养皿上进行转染。转染混合物的制备如下：将2μg DNA（每个构建体1μg）和12μl SuperFect脂质体感染剂（QIAGEN）混合在300μl无血清培养基中。在RT孵育30分钟后，再添加1.2 ml含有5%血清的培养基。细胞在该混合物中培养5小时，然后用正常培养基替换。24小时后，将细胞重新放置在20毫米#1玻璃盖玻片或蓝宝石盖玻片上(Toomre等人，2000年; 1mm厚×32mm直径；奥林巴斯）分别使用客观型和棱镜型设置进行TIRFM成像。在电镀后1-4天内使用细胞。

TIRFM成像是使用棱镜型和客观型TIRFM装置进行的；两者都产生了类似的结果。如前所述使用prism类型设置(Toomre等人，2000年)，但成像是在～25°C下进行的，这是鱼类成纤维细胞成像的最佳条件。简言之，使用了一个直立显微镜（Axiovert；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.），配备了一个60×1.25 NA的浸水透镜（Carl Zess-MicroImaging，Inc）。氪氩激光器的488 nm线以65°的入射角聚焦于半圆柱体，穿透深度（1/e）为～45 nm。数据采集频率通常为0.5–1 Hz。

目标型TIRFM系统的示意图如图S1所示。与其他物镜类型设置的不同之处在于，安装在物镜下方的两个小棱镜用于有效地将激光束耦合到透镜内外，并消除了二向色滤光片的需要。简而言之，使用4-W氩激光器（光谱物理）的488-nm线进行激发。激光通过声光调制器（ELS）耦合到单模488-nm光纤（点光源）中。在光纤出口处，使用安装在光学导轨上的两个消色差双透镜（f=25.4 mm和300 mm；Newport）对光束进行准直，并将其扩大到1.5 cm的直径。第三个消色光双透镜（f=500 mm；Newport）将光束聚焦到100×物镜的后焦面（NA 1.40，平面消色差；奥林巴斯）通过反射5毫米棱镜（OptoSigma）。光束以～65±1°的入射角离开透镜，计算出的穿透深度为165 nm。用发射滤光片（HQ 545/45；Chroma）过滤发射光，并用CCD摄像机（9.9×9.9-μm像素；SensiCam，PCO）检测。数据通常在0.5–1 Hz下采集，并由T.I.L.L.光子学硬件和软件控制。

简言之，多通道TIRFM系统由装有IX2-RFAEVA冷凝器的显微镜（型号IX2；Olympus）组成。将NA为1.65的100×物镜与高折射率浸没油（二碘甲烷；Sigma-Aldrich）和特殊的高NA盖玻片一起使用(n个= 1.788; 奥林巴斯光学组件）。滤光片立方体包含一个位于激发位置的488/10激光净化滤光片、一个FT 510二向色滤光片和一个LP 520发射滤光片。激励源是一个多线激光器（Innova 70C；相干），带有用于选线和快速快门的AOTF（声光调制器），使用kineFLEX光纤系统（点光源）耦合到显微镜。

在488 nm处进行激光激发，并使用带有595双色、515–565 BP和590 LP发射滤波器的分光器（MultiSpec；optical Insights）分离发射信号；红色和绿色图像在CCD摄像机上同时并排成像（MicroMAX 1024B；普林斯顿仪器公司）。采集图像，并使用MetaMorph将原始堆栈拆分为单个通道^®软件（Universal Imaging Corporation）。

使用TILLvisION软件（T.I.L.L.Photonics）、Microsoft Excel、Adobe Illustrator执行采集后处理^®、ImageJ和Adobe Photoshop^®使用TILLvisION软件对微管尖端进行分析，以沿着微管追踪荧光强度。将强度值导出到Microsoft Excel电子表格中，用于校正背景荧光、转换为相对z位置值和绘图。TIRFM计算按别处所述进行(阿克塞尔罗德，1989年;Toomre等人，2000年;Steyer和Almers，2001年).

图S1显示了TIRFM目标类型设置的示意图。视频1显示了TIRFM显示的微管和末端的动力学。这部电影伴奏图1C和图3，并显示了TIRFM成像的CAR细胞中GFP标记微管的概述。图像以相反的对比度显示。请注意，当微管尖端进入渐逝波时，（正末端）尖端显得更暗。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=2秒）。视频2与视频1除了回放速度更快，以突出几个微管沿同一路径移动的观察结果。（帧之间的时间=2 s）。视频3显示了靶向粘附部位的微管的TIRFM可视化。这部电影伴奏图4A和显示了双转染DsRed-zyxin和GFP-tubulin并通过TIRFM成像的CAR成纤维细胞的概述。对单色图像进行阈值化、分割，并将颜色映射到不同的强度（使用ImageJ软件），以更好地区分微管和粘连，并显示它们的相互作用。顶部显示倒置的RGB图像（zyxin，绿色；tubulin，红色），底部仅显示倒置黑白的GFP通道（微管）。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=2秒）。视频4和视频5显示单个微管靶向粘附部位。在用DsRed zyxin和GFP微管蛋白双重转染的CAR成纤维细胞中，TIRFM中靶向相互作用的个别实例如视频3。视频4和视频5分别对应于中所示的图像图4、B和C注意，序列突出了微管和末端向焦点粘连的倾斜。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=1s）。视频6显示了微管聚合到局部粘连的共焦图像。这部电影伴奏图5A和显示CAR成纤维细胞双转染DsRed-zyxin和GFP–CLIP-170，并通过共焦激光扫描显微镜获得（Radiance；Bio-Rad实验室）。GFP–CLIP-170（绿色）仅见于生长中的微管+末端，可被视为靶向局灶性粘连（红色）。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=2秒）。视频7显示双色TIRFM显示微管加末端聚合朝向和靶向局灶性粘连。这部电影伴奏图5B和显示了一个双重转染DsRed-zyxin和GFP–CLIP-170的CAR成纤维细胞，并通过TIRFM成像。CLIP-170标记的尖端的高荧光强度信号表明，它们与细胞皮层紧密接触，并向粘附部位移动。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=1s）。视频8显示了靶向粘附位点的微管的直接双色TIRFM可视化。这部电影伴奏图5D和显示了双重转染DsRed-zyxin（红色）和GFP-tubulin（绿色）的CAR成纤维细胞，同时通过TIRFM使用发射分离器设备（光学透视）成像。实际采样时间以秒为单位显示（帧之间的时间=1s）。

我们感谢Emmanuel Vignal在图5E.公司。

这项工作得到了奥地利科学基金会（P14007-BIO；J.V.Small）、路德维希癌症研究所（D.K.Toomre）、马克斯·普朗克学会和大众基金会（D.J.Manstein）的资助。