两种不同的Vps34磷脂酰肌醇3-激酶复合物在自噬和羧肽酶Y分选中的作用酿酒酵母

酵母液泡相当于哺乳动物细胞的溶酶体，是各种水解酶进行大分子周转的主要场所。水解酶向液泡/溶酶体的转运途径在酵母和哺乳动物中都是相似的。在酵母中，新合成的空泡蛋白转移到内质网，随后穿过高尔基复合体。它们是从晚高尔基体的分泌蛋白中分离出来的，这似乎类似于哺乳动物的TGN。可溶的液泡水解酶，如羧肽酶Y（CPY），在到达液泡的过程中通过内体/旁室（PVC）。筛选分泌CPY的酵母菌株的基因筛选已经鉴定出50多株VPS公司（液泡蛋白分选）从晚期高尔基体到液泡正确靶向CPY所需的基因（综述见Horazdovsky等人，1995年).

Vps蛋白之一Vps34p是磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶的证明(Schu等人，1993年)已将注意力集中在脂质激酶参与囊泡转运。在其中视频处理34基因已被删除，该基因对37°C下的生长具有温度敏感性，并且在可溶性液泡水解酶的分类中存在缺陷(Robinson等人1988;Herman和Emr 1990年;Herman等人，1991a,赫尔曼等人1991b). 这个第15版突变体表现出与第34版突变体，表明Vps15p作用于空泡蛋白转运的同一步骤。随后的生化分析表明，Vps15p是一种与Vps34p相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶(Stack等人，1993年). Vps15p–Vps34p相互作用和Vps34p的PtdIns 3–激酶活性需要Vps15p蛋白激酶活性(Stack等人，1993年,Stack等人，1995年). 最近，研究表明，PtdIns 3激酶在蛋白质转运中的参与也延伸到哺乳动物系统。磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼和LY294002导致哺乳动物溶酶体蛋白靶向错误(Brown等人，1995年;戴维森1995)可能是由于哺乳动物Vps34p同源物的抑制。人类Vps34p同源物已被证明与Vps15p同源物p150有关(Volinia等人，1995年;Panaretou等人，1997年).

膜运输中对PtdIns 3激酶的需求并不局限于从晚期高尔基体/转化生长细胞核到液泡/溶酶体的蛋白质运输。最近的数据表明，PtdIns 3激酶在两种酵母中也需要进行自噬多形Hansenula polymorpha和人类细胞(Kiel等人，1999年;Petiot等人，2000年). 自噬是一个主要的真核生物过程，通过自噬，大量细胞质成分在液泡/溶酶体中降解（综述见邓恩1994). 为了应对饥饿，称为自噬体的双层膜结构非选择性地包裹了一部分细胞质，包括其驻留的细胞器，并将其靶向内含物降解的液泡/溶酶体(Baba等人，1994年). 在酵母中，几种自噬缺陷突变体(自动发电机组和自动)已被隔离(Tsukada和Ohsumi 1993年;Thumm等人，1994年). 大多数负责的基因都是新的，似乎在自噬和相关的细胞质-空泡靶向（Cvt）途径中具有特异性功能，该途径介导新合成的氨肽酶I（API）向空泡的转运(Harding等人，1996年). 然而，只有APG6型与VPS公司基因，第30页，因此CPY排序也需要(Seaman等人，1997年;Kametaka等人，1998年). Vps30p与另一种Apg蛋白Apg14p相互作用(Kametaka等人，1998年). 然而，奇怪的是亚太14国集团不影响CPY排序(Kametaka等人，1998年). 有人提出，Vps30p在自噬和CPY排序中具有两种不同的功能，并且只有自噬依赖于Apg14p。

在这项研究中，我们表明Vps34p至少形成两个多亚单位PtdIns 3-激酶复合物：均含有Vps15p和Vps30p，而Apg14p和Vps 38p各自是特定的。表型分析表明，含有Apg14p的复合物具有自噬功能，而含有Vps38p的复合体具有CPY分选功能。此外，表型观察表明存在其他PtdIns 3-激酶复合物。从这些结果来看，我们认为Vps34 PtdIns 3-激酶形成多个复合物，每个复合物都包含特定的调节亚单位，这些亚单位定义了该复合物参与的膜转运途径。

酿酒酵母使用的菌株列于表.本研究构建的酵母菌株来源于KA311A(Irie等人，1993年)，YPH499(Sikorski和Hieter 1989年)，或SEY6210(Robinson等人，1988年). Δ的构造vps30:：LEU2, Δapg14:：LEU2, Δvps34:：TRP1, Δ肽4:：URA3和Δ密码7:：LEU2如前所述执行(Kametaka等人，1998年;Herman和Emr 1990年;Kirisako等人，1999年;Noda等人，2000年). Δvps15：：TRP1和Δvps15:：HIS3细胞被构建来替换视频处理15基因与TRP1号机组标记器和HIS3型标记。Δvps38：：ADE2细胞被构建来替换20碱基BamHI-PstI区域视频处理38带有的基因ADE2型标记。细胞生长在YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）或含有营养补充剂的合成完整（SC）培养基中。对于氮饥饿，使用SD（-N）培养基（0.17%酵母氮基，2%葡萄糖，不含氨基酸和硫酸铵）。

pKHR1是一个大肠杆菌构建克隆载体以产生含NH的融合蛋白₂-终端His₆，Myc表位（EEQKLISEEDLLKR），带有凝血酶裂解位点（LVPRGS）。他的₆–从pTYE007扩增出Myc区域(Yoshihisa和Ito 1996)使用以下引物：5′-GGGAATTCATGAGAGGATCACATCACCATCACCACACA-3′和5′-GGAATTCGGACCACGACGGACACGTTTGCAGCAGTCTTCG-3′。用EcoRI消化得到的片段，并将其连接到pKK223-3（Amersham Pharmacia Biotech）的EcoSI位点，以生成pKHR1。

创造他的₆–Myc-tagged融合蛋白虚拟专用交换机30和亚太14国集团将基因克隆到pKHR1中，分别产生pKHR2和pKHR3。表达他的₆–Myc–Vps30p酵母，伊斯₆–Myc–VPS30从pKHR2克隆到pRS424(Christianson等人，1992年)生成pKHR25。表达他的₆–酵母中的Myc–Apg14p，伊斯₆–Myc–APG14从pKHR3克隆到pAUR112（TaKaRa）和pRS313(Sikorski和Hieter 1989年)以分别产生pKHR69和pKHR75。

为了创建COOH末端三重血凝素（HA）标记的Vps38p表达结构，首先构建了表达3xHA融合蛋白的载体质粒。从pTK110扩增3xHA表位(Kirisako等人，1999年)，使用以下引物：5′-TTTTTCGACTAGTTACCATACGATGTTCCTGACC-3′和5′-AAAACGAGCTCTTAAGCGTAATCTGGACCATGG-3′。该PCR片段用SpeI和SacI酶切，亚克隆到pRS313中，生成pKHR45。然后，视频处理38被亚克隆到pKHR45以创建Vps38p-3xHA结构pKHR65。

巴基斯坦卢比54(视频处理34)和pKHR55(视频处理15)包含2.9-kb Psp1406I-KpnI视频处理34基因组片段和4.8-kb ScaI-SnaBI视频处理15pRS316中的基因组片段。60千赫(vps34-N736K版)和pKHR59(vps15-E200R版)如前所述建造(Herman等人，1991a;Schu等人，1993年).

将含有pKHR25或pRS424的AKY76细胞的4升培养物转化为球状体，并在缓冲液A（50 mM Hepes-NaOH，pH 8.0，200 mM山梨醇，150 mM NaCl，1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇[2-ME]，蛋白酶抑制剂混合物[完全，无EDTA-；罗氏]）中通过渗透冲击和超声溶解。在1500下离心除去细胞碎片后克在5分钟内，通过添加五体积的缓冲液B（50 mM Hepes-NaOH，pH 8.0，1%Triton X-100，150 mM NaCl，1 mM PMSF，10 mM 2-ME）来溶解上清液。样品在100000下离心克30 min，将上清液应用于与缓冲液B平衡的Ni-NTA琼脂糖柱（5 ml）。用20 ml缓冲液B和60 ml缓冲液C（50 mM Hepes-NaOH，pH 8.0，0.1%Triton X-100，150 mM NaCl，25 mM咪唑，10 mM 2-ME）清洗柱并用25 ml缓冲液D洗脱（50 mM Hepes-NaOH，pH 8.0，0.1%Triton X-100，150 mM NaCl，10%甘油，250 mM咪唑，10 mM 2-ME）。然后将洗脱液与固定化亲和纯化的Vps30p抗体孵育。如前所述，使用二甲基吡米特将Vps30p抗体与蛋白A–Sepharose CL-4B珠偶联制备柱(Ungermann等人，1998年). 用30ml缓冲液E（10mM Hepes NaOH，pH 8.0，0.5%Triton X-100，150mM NaCl，10%甘油，0.1mM EDTA，10mM 2-ME）洗涤树脂。用10 ml 100 mM甘氨酸-HCl（pH 2.5）洗脱结合蛋白，用5%TCA沉淀，用冰镇丙酮洗涤，并悬浮在SDS样品缓冲液中（62.5 mM Tris-HCl，pH 6.8，2%SDS，10%甘油，5%2-ME，痕量溴酚蓝）。它们通过SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，并从凝胶中切除。蛋白质样品在凝胶基质中用胰蛋白酶消化。提取的肽混合物通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法进行分析。通过将肽质量图与数据库进行比较来鉴定蛋白质。

制备的球形体[³⁵S] 如前所述，蛋氨酸/半胱氨酸标记的细胞通过聚碳酸酯过滤器挤压溶解，该过滤器具有3μm孔(维达和格哈特1999)在缓冲液A中，并在缓冲液F中溶解（100 mM Hepes-NaOH，pH 8.0，1%Triton X-100，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1 mM PMSF）。然后将溶解的样品与抗体和蛋白A–Sepharose珠在4°C下孵育2 h。珠用缓冲液F洗涤三次。结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，用SDS-PAGE分离，然后用放射自显影检测。在未标记细胞的情况下，在1500℃离心去除细胞碎片后，在缓冲液A中先用渗透冲击法溶解球体，然后进行超声波处理克用1%Triton X-100溶解上清液5分钟。然后将样品与蛋白A偶联抗体孵育，并在4°C下孵育2 h。用缓冲液G（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，0.1%Triton X-100，10 mM 2-ME）清洗珠子。结合材料用100 mM甘氨酸-HCl洗脱，pH 2.5，用5%TCA沉淀，用冰镇丙酮洗涤，并悬浮在SDS样品缓冲液中。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移至硝化纤维素进行免疫印迹。针对His的抗-Vps34p抗血清₆–Myc–Vps34p融合蛋白，包含Vps34p（His）的345个氨基酸（97–441）₆–Myc–Vps34p[97–441]）。针对His提出了抗-Vps15p抗血清₆–Myc–Vps15p（222-768）或他的混合物₆–Myc–Vps15p（222-768）和他的₆–Myc–Vps15p（792-1189）。针对His的抗-Vps38p抗血清₆–Myc–Vps38p（53–293）或他的₆–Myc–Vps38p（53–439）。针对His提出抗-Apg14p抗血清₆–Myc–Apg14p（2–62和271–344）。针对表达为谷胱甘肽的重组全长Vps30p制备抗Vps30p抗血清秒-转移酶融合蛋白。

如前所述，通过脉冲追踪和免疫沉淀实验检测新合成的CPY的分泌(库珀和史蒂文斯1996). 如前所述进行免疫印迹(Shintani等人，1999年). Daniel J.Klinsky博士（密歇根大学，密歇根州安娜堡）提供了抗API的抗血清。

如前所述，将在YPD中生长的细胞转移到SD（-N）中4.5小时，并转化为球状体(Noda等人，2000年). 将球体悬浮在裂解缓冲液中（25 mM Pipes-KOH，pH 6.8，200 mM山梨醇）。将裂解物在500下离心5分钟克上清液在13000年被旋转克15分钟后，将颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中。然后用10 mg/ml蛋白酶K（含或不含1%Triton X-100）在冰上处理样品30分钟。

酵母球状体在缓冲液H（50 mM Hepes-NaOH，pH 7.5，200 mM山梨醇，150 mM NaCl，1 mM PMSF，10 mM 2-ME）中通过挤压通过具有3μm孔的聚碳酸酯过滤器进行溶解(维达和格哈特1999). 过滤废水在500℃下离心克5分钟以清除细胞碎片。随后在13000℃离心上清液（总量）克持续15分钟，生成低速颗粒（LSP）和低速上清液，然后在100000下进一步离心克1小时，生成高速颗粒（HSP）和高速上清液（HSS）。

酵母球状体在缓冲液I（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM PMSF，10 mM 2-ME，蛋白酶抑制剂混合物[完全，无EDTA]）中通过超声溶解。1500℃离心去除细胞碎片后克用1%Triton X-100溶解上清液5分钟。通过离心（100000克，30 min），并将可溶性样品加载到Ni-NTA琼脂糖柱上。用缓冲液J（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1%Triton X-100，150 mM NaCl，20 mM咪唑，10 mM 2-ME）清洗柱，并用缓冲液K（50 mM-Tris-HCl，pH 8.0，0.1%Traton X-100、150 mM氯化钠，250 mM咪唑啉，10 mM-ME）洗脱。

为了测量自噬活性，如前所述进行了ALP分析(Noda和Ohsumi 1998年). 如前所述进行PtdIns 3–激酶分析(Stack等人，1995年).

尽管Δ虚拟专用交换机30细胞自噬和CPY分选都有缺陷，Δapg14型细胞只有自噬缺陷(Kametaka等人，1998年). 此外，Apg14p的过度生产部分抑制了由apg6-1页突变，导致Vps30p的～50%COOH末端截短，但没有CPY转运缺陷(Kametaka等人，1998年). 这些结果促使我们假设Vps30p/Apg6p可能组成在不同过程中发挥作用的大蛋白复合物。为了验证这一点，我们首先检查了Vps30p是否与Apg14p以外的蛋白质相互作用。野生型或Δ虚拟专用交换机30用标记细胞[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸。从野生型或Δ制备的总裂解物虚拟专用交换机30用Triton X-100溶解细胞，并使用抗Vps30p抗体进行免疫沉淀。在野生型细胞的免疫沉淀物中，检测到许多蛋白带和Vps30p(图1A、 车道1）。它们大多是非特异性背景，因为它们也存在于Δ虚拟专用交换机30单元格(图1A、 车道2）。然而，三条带，称为p160、p90和p50，仅存在于野生型细胞的免疫沉淀物中，表明这些蛋白与Vps30p特异性相互作用。为了识别它们，我们构建了pKHR25，它携带伊斯₆——Myc公司——虚拟专用交换机30，一个编码Vps30p和附加NH的融合基因₂-终端His₆和Myc标签序列。pKHR25是一个表达His的多拷贝质粒（2μm₆–Myc–Vps30p的水平比染色体表达的Vps30p高30倍。用Triton X-100溶解由携带pKHR25的AKY76细胞制备的总裂解物，并将洗涤剂提取物加载到Ni-NTA琼脂糖柱上(图1B、 车道1-4）。通过与免疫亲和柱孵育，进一步纯化洗脱液，该免疫亲和色谱柱是通过将抗Vps30p抗体共价连接到蛋白A–Sepharose珠制备的(图1B、 车道5和6）。从色谱柱中洗脱出几个蛋白质以及His₆–Myc–Vps30p(图1B、 车道6）。区分与His特别互动的乐队₆–Myc–Vps30p来自非特异性背景结合，使用携带不表达His的质粒的AKY76裂解液重复相同的纯化程序₆–Myc–Vps30p。p90和p50而非p160在His纯化组分中特异存在₆–Myc–Vps30p表达细胞(图1C） ●●●●。从凝胶中切下p90和p50条带，在凝胶基质中用胰蛋白酶消化蛋白质样品。用基质辅助激光解吸/电离质谱法分析提取的肽混合物。肽质量图用于查询综合序列数据库，以进行明确的蛋白质鉴定。结果表明，p90和p50分别为Vps34p和Vps38p。Vps34p是一种PtdIns 3激酶，对液泡蛋白子集进行正确分类所需(Robinson等人，1988年;Herman和Emr 1990年). Vps38p参与CPY和突变体Pma1p靶向液泡(罗和张1997)，尽管它在这些过程中的确切作用尚不清楚。为了证实Vps34p和Vps38p确实与Vps30p相互作用，使用抗Vps30p抗体进行了联合免疫沉淀实验。免疫印迹显示，野生型酵母制备的免疫沉淀物中存在Vps30p、Vps34p和Vps38p(图1D、 车道1），但不在Δ中虚拟专用交换机30应变，应变(图1D、 通道2），表明Vps34p和Vps38p是通过与Vps30p的相互作用而专门沉淀的。如前所述，Apg14p也与Vps30p免疫共沉淀(图1D、 车道1）。丝氨酸/苏氨酸激酶Vps15p已被证明与Vps34p相互作用(Stack等人，1993年). 因此，Vps15p是p160的最佳候选基因。接下来，我们检查了使用抗Vps30p抗体获得的免疫沉淀物中是否存在Vps15p。使用抗Vps15p抗体的免疫印迹显示Vps15p也存在(图1D、 车道1）。这些结果表明，Vps30p与Apg14p、Vps15p、Vp34p和Vps38p形成复合物。到目前为止，Vps30p在自噬和CPY分选中的作用尚不清楚。我们在这里证明了Vps30p作为Vps34 PtdIns 3-激酶复合物的一个亚单位发挥作用。我们未能检测到Apg14p的原因图1A和图C可能是由于其丰度低（见下文）。我们无法在中检测到Vps15p图1C.Vps15p可能被非特定背景所掩盖，因为p160与非特定背景非常接近图1A.或者，由于Vps15p的不稳定性，在净化过程中其降解（见讨论）。

已知Vps15丝氨酸/苏氨酸激酶对Vps34p的激活至关重要(Stack等人，1993年). Vps30p、Apg14p或Vps38p的一个可能的作用是Vps34p的共激活剂。为了验证这一点，通过与PtdIns和[γ-³²P] ATP。在硅胶60板上通过TLC提取和分离脂质(Walsh等人，1991年). 野生型细胞产生由PtdIns 4激酶（如Stt4p和Pik1p）合成的PtdIns 4–磷酸盐和PtdIns3–磷酸盐[PtdIns（3）P](图2，车道1）。如前所示(Schu等人，1993年;Stack等人，1993年), Δ第34页细胞根本没有PtdIns 3激酶活性(图2，车道5）和Δ第15页细胞表现出极低但可检测到的PtdIns 3-激酶活性(图2，车道6）。Δ虚拟专用交换机30和Δ虚拟专用软件38细胞PtdIns 3激酶活性仅略有下降（约80%的野生型细胞）(图2，车道2和4）。Δapg14号机组细胞表现出与野生型细胞同等水平的PtdIns 3-激酶活性(图2，车道3）。这些结果表明，Vps30p、Apg14p和Vps38p对Vps34p的PtdIns 3-激酶活性不是必需的。

我们研究了这两种破坏的影响虚拟专用交换机30,亚太14国集团,视频处理38,视频处理34，或视频处理15在几个液泡转运途径上，包括CPY、蛋白酶A（PrA）、蛋白酶B（PrB）和API的转运，以及自噬。CPY、PrA和PrB的转运起始于内质网膜，在那里它们被转运到内质网腔，并通过高尔基体通过囊泡转运到液泡。API的传输与CPY、PrA和PrB的传输完全不同。API在细胞质中合成为一种形式（pAPI），并通过Cvt途径直接靶向液泡，然后在液泡中加工成成熟形式（mAPI）。Cvt途径使用与自噬途径相似的机制，大多数自噬突变体在Cvt通路中有缺陷(Harding等人，1996年;Scott等人，1996年;Baba等人，1997年). 首先，我们通过脉冲追踪和免疫沉淀实验检测了CPY的转运。用脉冲标记细胞[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸15分钟，28°C下追逐30分钟。然后将细胞转化为球状体，并分离为细胞内（I）和细胞外（E）级分，从中免疫沉淀CPY。野生型和Δapg14号机组细胞中，>95%的新合成CPY以成熟形式（mCPY）存在于细胞内(图3A、 车道1和3）。Δ虚拟专用交换机30, Δ虚拟专用软件38, Δ第34版和Δ第15页细胞错配并分泌了几乎所有CPY作为Golgi修饰的p2形式(图3A、 车道6、8、10和12）。这些结果表明，所有被检测的Vps蛋白（Vps15p、Vps34p、Vps38p和Vps30p/Apg6p），而不是Apg14p，都是正确分选CPY所必需的，如先前所报道的(Robinson等人，1988年;Herman和Emr 1990年;Herman等人，1991a;罗和张1997;Seaman等人，1997年;Kametaka等人，1998年). 免疫印迹法检测PrA、PrB和API的转运。Δ第15版和Δ第34版细胞聚集高尔基体形式的PrA（pPrA）和PrB（pPr B）(图3B和图C，车道4和5），如前所示(Robinson等人，1988年)表明这些细胞中PrA和PrB的分选严重受损。或者，单位为Δ虚拟专用软件38和Δ虚拟专用交换机30细胞，大多数PrA和PrB被发现为成熟形式（mPrA与mPrB），尽管也检测到非常低水平的前体形式(图3B和图C，车道2和6）。Δapg14号机组细胞表现出PrA和PrB的正常分选(图3B和图C，车道3）。API的运输在Δ中被完全抑制虚拟专用交换机30, Δapg14型, Δ第34版和Δ第15版单元格(图3D、 车道2-5），而Δ虚拟专用软件38细胞显示API的正常靶向性(图3D、 车道6）。接下来，我们使用ALP分析检测了自噬(Noda等人1995)监控ALP Pho8Δ60的自噬依赖性处理(Noda等人，1995年). 在野生型细胞中，ALP活性在饥饿反应中增加，而在Δ虚拟专用交换机30, Δapg14号机组, Δ第34版和Δ第15版细胞的升高受到严重抑制(图3E） ●●●●。Δ的ALP活性虚拟专用软件38细胞活性为野生型细胞的～70%。这些结果表明Δ虚拟专用交换机30, Δapg14号机组, Δ第34版和Δ第15版细胞在Cvt途径和自噬途径中都有缺陷，而在Δ虚拟专用软件38细胞这两条通路几乎完好无损。表总结了突变细胞中的这些转运活性。因此，我们可以将突变体分为4类。I类，包括Δ第15版和Δ第34版，表现出最严重的表型：所检测的所有液泡蛋白的运输都受到抑制，在28°C时生长缓慢，在37°C时停止。Δ虚拟专用交换机30（II类）在自噬/Cvt和CPY分类中都有缺陷。然而，Δapg14号机组（III级）和Δ第38页（IV类）仅在自噬/Cvt或CPY分类中有缺陷。这些结果表明，Vps30p、Apg14p和Vps38p可能具有调节作用，使Vps34 PtdIns 3-激酶发挥特定功能。

接下来，我们研究了Δ中自噬的缺陷第34版使用API保护试验，细胞处于融合点或自噬体形成点(Kim等人，1999年; 石原慎太郎，N.，T.野田佳彦，Y.Kamada，T.吉森，Y.Ohsumi，未出版材料）。在营养丰富的条件下，API通过Cvt途径运输到液泡中(Klinsky和Ohsumi 1999). 此外，由于API在饥饿条件下通过自噬体选择性地传递到液泡，因此API可以作为自噬小体货物的标记。Ypt7是一种rab家族GTPase，其突变体在自噬体或Cvt囊泡与液泡之间的融合中存在缺陷，并在细胞质中积累自噬体和Cvt囊泡(Kim等人，1999年;Kirisako等人，1999年). 我们已经证明，自噬体可以用13000克Δ离心密码7细胞（Ishihara，N.、T.Noda、Y.Kamada、T.Yoshimori和Y.Ohsumi，未出版材料）。Δ密码7和Δ第34版在饥饿条件下生长的细胞转化为球形体并渗透溶解。用低速离心法对裂解产物进行大致预处理，上清液在13000℃下旋转克将松散颗粒溶解在渗透稳定的缓冲液中15分钟，在有或无洗涤剂Triton X-100的情况下用蛋白酶K处理，并对API进行免疫印迹。如所示图3F、 单位Δ密码7细胞，存在蛋白酶K抗性API群体，并在Triton X-100存在下完全消化，表明自噬体在胞浆中积聚。相反，单位为Δ第34版因此，Vps34p是形成完整自噬体所必需的。

如上所示，不同的膜转运途径需要Apg14p和Vps38p。为了区分Apg14p和Vps38p是否构成一个在自噬/Cvt和CPY分选中都起作用的单一复合物，或者Apg14p和Vps38 p是否构成单独起作用的不同复合物，从野生型细胞制备的洗涤剂提取物要接受使用抗Apg14 p或抗Vps38抗体的联合免疫沉淀实验。然后使用抗Vps30p、抗Vps34p、抗-Vps15p、抗Apg14p和抗Vps38p抗体通过免疫印迹法观察免疫沉淀物(图4A） ●●●●。Vps30p和Vps34p均与各自的特异性抗体共同免疫沉淀(图4A、 车道1和2）。在抗Vps38p抗体的免疫沉淀物中检测到大量Vps15p(图4A、 车道2）。抗-Apg14p抗体沉淀出非常低但可检测到的Vps15p(图4A、 车道1）。Vps15p的低水平可能是由于细胞裂解物中Vps15p的不稳定性和含有Apg14p的复合物的低丰度所致（见下文）。然而，在使用抗Apg14p抗体获得的免疫沉淀物中根本无法检测到Vps38p(图4A、 车道1）。使用抗Vps38p抗体获得的免疫沉淀物也不含Apg14p(图4A、 车道2）。这些结果表明，Vps38p和Apg14p不存在于同一复合物中。尽管使用抗Apg14p抗体获得的免疫沉淀显示出比抗Vps38p抗体免疫沉淀低约10倍的活性，但这两种复合物都具有PtdIns 3激酶活性(图4B） ●●●●。

Vps38p和Apg14p构成不同复合物的观点也得到了一种独立的方法的支持，即使用NH的下拉分析₂最终融合了他的₆–Myc–Apg14p蛋白。从表达His的细胞制备的裂解物₆–Myc–Apg14p用Triton X-100溶解并用Ni-NTA琼脂糖培养。保留的蛋白质用咪唑洗脱并用SDS-PAGE分离，然后用抗Myc、抗Vps30p、抗Vp34p和抗Vps38p抗体进行免疫印迹(图4C） ●●●●。伊斯₆–用咪唑洗脱与Ni-NTA琼脂糖结合的Myc–Apg14p(图4C、 车道2）。洗脱部分中也发现Vps30p和Vps34p(图4C、 车道2）。Vps30p和Vps34p与Ni-NTA琼脂糖的结合依赖于His₆–Myc–Apg14p；对照实验表明，在没有His的情况下，在洗脱组分中没有检测到它们₆–Myc–Apg14p(图4C、 车道1）。同样，洗脱部分中未检测到Vps38p(图4C、 车道2）。这些结果证实了Apg14p和Vps38p存在于不同的配合物中。结合表型分析，这些结果导致了我们的结论，即含有Apg14p的复合体（Vps34p–Vps15p–Vps 30p–Apg14p）在自噬中起作用，而含有Vps38p的复合物（Vps34–Vps15–Vps30–Vps38）在CPY排序中起作用。此后，我们将前一个复合体称为复合体I，后一个复体称为复体II。

先前的研究表明，Vps15p直接磷酸化Vps34p(Stack等人，1993年). 这些蛋白质似乎构成复合物I和II的核心。为了解决复合物I和II的组织，使用抗Vps30p抗体的共免疫沉淀实验，如图1D、 在Δapg14号机组, Δ虚拟专用软件38, Δ第34版和Δ第15版细胞。与Apg14p和Vps38p组成单独复合物的结果一致，Vps30p和Apg14p之间的相互作用不受视频处理38(图5D、 车道2），并删除亚太14国集团不影响Vps30p–Vps38p相互作用(图5E、 车道1）。我们还通过免疫印迹法研究了各自缺失菌株中的细胞数量。与野生型细胞相比，Δ第38页(图6D、 车道4）或Δapg14号机组(图6E、 泳道3）细胞。在Δ第34版和Δ第15版单元格(图5E、 车道3和4；图6E、 车道5和6）。然而，Δ中未检测到Vps38p虚拟专用交换机30单元格(图6E、 车道2）。这些结果表明，Vps30p直接与Vps38p结合，保护Vps38p不被降解。相反，尽管Δ中同时存在Vps15p和Vps34p虚拟专用软件38单元格(图6B、 车道4；图6C、 通道4），在没有Vps38p的情况下，他们无法与Vps30p交互(图5B、 车道2；图5C、 车道2）。这些结果表明，Vps30p与Vps34p–Vps15p核心复合物之间的相互作用是间接的，并由Vps38p介导。在Δ中几乎未检测到Apg14p虚拟专用交换机30, Δ第34版和Δ第15版单元格(图6D、 车道2、5和6）。因此，减少的Apg14p与Vps30p在Δvps34单元格(图5D、 通道3），并且在Δ的免疫沉淀物中未检测到Apg14p第15版单元格(图5D、 车道4）。这些结果表明，Vps30p和Vps34p–Vps15p与Apg14p的直接结合可以通过阻碍对蛋白酶的识别位点（蛋白水解系统）或通过诱导Apg14p呈现紧密构象来保护Apg14p免受蛋白水解。删除亚太14国集团似乎不会影响Vps30p和Vps34p–Vps15p之间的相互作用(图5B、 车道1；图5C、 车道1），尽管删除了视频处理38给它带来了巨大的影响(图5B、 车道2；图5C、 车道2）。这些结果表明，复合物I在酵母细胞中的含量远低于复合物II。事实上，Apg14p的总量非常低（数据未显示）。

Stack等人，1995年据报道，Vps15激酶域突变体无法与Vps34p相互作用，这表明Vps15p的自磷酸化或Vps15p-介导的Vps34p磷酸化可能参与Vps15p~Vps34p-复合物的形成。或者，Vps34p PtdIns 3激酶域突变体能够以与野生型Vps34p无法区分的方式与Vps15p结合(Stack等人，1995年). 我们检测了Vps15激酶域突变体和Vps34 PtdIns 3-激酶域突变剂形成复合物I和II的能力。Vps15p的200位谷氨酸是蛋白激酶中高度保守的残基，其精氨酸突变消除了体内Vps15p的磷酸化，导致温度敏感性生长缺陷和CPY错配(Herman等人，1991a). Vps34p第736位的天冬酰胺是ATP结合和磷酸转移蛋白质催化环区（DXHXXN）的一部分(Knighton等人，1991年)并且在蛋白激酶和脂质激酶之间保守。N736K突变导致PtdIns 3-激酶活性急剧下降，空泡蛋白分选严重缺陷(Schu等人，1993年). 使用Δ第15版含有野生型或vps15-E200R版低拷贝质粒上的等位基因(图7，车道3和4）。激酶阴性的作用第15版突变体类似于视频处理15基因；用抗Vps30p抗体沉淀的Apg14p、Vps34p和Vps15-E200R的数量严重减少，但Vps38p没有减少(图7，车道4）。在没有Vps34p的情况下未检测到Vps15p(图6B、 车道5）。我们还发现，Vps15-E200R和Apg14p在vps15-E200R版单元格（未显示数据）。因此，Vps15p介导的Vps15p的自磷酸化或Vps34p的磷酸化可能是Vps15p和Vps34p之间的相互作用和Vps15p的稳定所必需的。此外，未与Vps15p结合的Vps34p或未磷酸化形式的Vps34与Vps30p并不复杂，也就是说，由于上述原因，不与Vps38p结合。相反，所有的相互作用在Δ中都是正常的第34版表达Vps34-N736K突变蛋白的菌株(图7，车道2）。这些结果表明，这些蛋白质-蛋白质相互作用不需要产生PtdIns（3）P。

尽管Vps30p没有明显的跨膜结构域或脂质修饰位点，但除了可溶性部分外，在膜部分也发现了Vps30p(Seaman等人，1997年). 膜相关的Vps30p可以被盐或尿素溶解(Seaman等人，1997年;Kametaka等人，1998年). Vps30p的膜结合可能由蛋白质-蛋白质相互作用介导，其中Vps15p、Vps34p、Vps 38p和Apg14p是假想膜锚的候选。因此，我们检测了Vps30p在这些突变细胞中的亚细胞位置。总细胞裂解物在13000和100000时通过连续离心分离克分为LSP、HSP和HSS组分。在野生型细胞中，大多数Vps30p存在于LSP（60%）和HSS（34%）中，而只有6%的Vps30p与HSP分离(图8A） ●●●●。在Δ中观察到Vps30p急剧转变为HSS分数虚拟专用软件38, Δ第34版和Δ第15版单元格(图8A） ●●●●。这些结果表明，Vps15p、Vps34p和Vps38p是Vps30p向膜募集所必需的。同样，Apg14p的缺失对Vps30p的亚细胞定位没有影响(图8A） 可能是因为复合物I丰度低。对照实验表明，ALP是一种液泡膜蛋白，主要定位于LSP组分(图8D） 在所有测试的突变体中，乙醇脱氢酶仅定位于HSS部分（数据未显示）。我们还检测了Vps38p的亚细胞分布。Vps38p在野生型细胞中的分布模式与Vps30p相似：在LSP、HSP和HSS中分别发现58%、8%和34%的Vps38p(图8B） ●●●●。我们无法确定Vps38p在Δ中的亚细胞位置虚拟专用交换机30因为在没有Vps30p的情况下几乎检测不到Vps38p（数据未显示；图6E、 车道2）。Δ中的图案没有改变apg14号机组单元格(图8B） ●●●●。在Δ中观察到Vps38p重新分布到HSS部分第34版和Δ第15版单元格(图8B） ●●●●。这些结果表明，Vps38p与Vps30p一起在Δ第34版和Δ第15版细胞。先前的研究表明，Vps34p存在于膜和可溶性组分中，Vps15p是Vps34p的膜结合所必需的(Stack等人，1993年). 在我们的检测条件下，大多数Vps34p存在于LSP（57%）和HSP（35%）中，只有8%的Vps34p存在于野生型细胞的HSS部分(图8C） ●●●●。在Δvps15细胞中，35%的Vps34p被释放到HSS组分中，而大约一半的Vps34在HSP组分中被检测到(图8C） ●●●●。Vps34p的分布在Δapg14号机组单元格(图8C） ●●●●。单位Δ第30页和Δ虚拟专用软件38观察到Vps34p向HSP和HSS部分转移(图8C） ●●●●。这些结果表明，复合物II位于LSP组分的膜上，复合物的破坏导致Vps34p重新分布到HSP膜和细胞质，Vps30p–Vps38p转移到细胞质。

自噬和CPY分选都需要Vps30p/Apg6p(Kametaka等人，1998年). 然而，Vps30p参与这些不同的膜转运途径的原因和方式尚不清楚。最近发现PtdIns 3激酶也在自噬中起作用(Kiel等人，1999年;Petiot等人，2000年)和蛋白质运输到液泡/溶酶体(Robinson等人，1988年;Herman和Emr 1990年;Brown等人，1995年;戴维森1995). 在此，我们提供证据证明Vps30p作为两种不同的大PtdIns 3-激酶复合物的亚单位发挥作用：复合物I和II。每个复合物包含一个特定的成分，Apg14p（复合物I）或Vps38p（复合物质II）以及三种常见的蛋白质Vps34p、Vps15p和Vps30p。其中一个复合物I组分的基因破坏导致自噬缺陷，而其中一个复杂物II组分的基因组破坏导致CPY的错误分类。这些结果表明，复合物I和II分别在自噬和CPY靶向中发挥作用。Vps10p是一种晚高尔基体跨膜蛋白，作为CPY的分选受体(Marcusson等人，1994年). 中的突变虚拟专用交换机30改变Vps10p的亚细胞分布，导致Vps10p从高尔基体转移到液泡膜(Seaman等人，1997年). 根据这些结果，Seaman等人，1997年提出Vps30p在Vps10p受体从内体/PVC再循环到晚期高尔基体所必需的步骤中发挥作用。然而，Vps30p（复合物II）仍有可能在含有Vps10p–CPY的囊泡的顺行运输中发挥作用。

在没有其他因素的情况下，Vps38p可以与Vps30p共同免疫沉淀(图5E） ●●●●。稳定Vps38p只需要Vps30p(图6E） ●●●●。这些结果表明，Vps38p直接与Vps30p结合(图9). 相反，尽管Δ中存在Vps15p和Vps34p虚拟专用软件38突变体(图6B和图C)，它们不能与Vps30p共沉淀(图5B和图C). 因此，在复合物II中，Vps30p和Vps34p–Vps15p核心之间的相互作用似乎不是直接的，而是由Vps38p介导的(图9). Apg14p在Δ虚拟专用交换机30, Δ第15版和Δ第34版细胞。这些结果表明，Vps30p和Vps15p–Vps34p都可能直接与Apg14p结合，并隐藏Apg14p中蛋白酶（蛋白水解酶系统）的识别位点，或诱导Apg14b采用蛋白酶抗性构象。因此，在配合物I和II中，Apg14p和Vps38p可以分别作为Vps30p和Vps 15p–Vps34p之间的连接器(图9). 然而，删除亚太14国集团似乎对Vps30p和Vps15p–Vps34p之间的相互作用没有影响(图5B和图C)以及Vps30p的亚细胞分布(图8A） 和Vps34p(图8C） ，而删除视频处理38对他们产生了巨大的影响(图5B和图C;图8A和图C). 这些结果表明，复合物I可能仅代表少量PtdIns 3-激酶。事实上，Apg14p的总细胞量很低；我们估计野生型酵母细胞中Apg14p的含量比Vps30p少约15倍（数据未显示）。此外，复合物I的PtdIns 3-激酶活性比复合物II低约10倍(图4B） ●●●●。因此，Apg14p缺失的影响可能被丰富的复合物II所掩盖。虽然Apg14p和Vps38p没有显著的序列相似性，但PairCoil(Berger等人，1995年)预测这两种蛋白质都有潜在的卷曲螺旋结构，经常介导蛋白质与蛋白质的相互作用。

为了获得关于Vps34 PtdIns 3-激酶复合物分子大小的信息，进行了凝胶过滤实验。当将裂解产物应用于Superose 6色谱柱时，Vps30p、Apg14p、Vps34p和Vps38p在对应于～550 kD的峰中协同作用（数据未显示）。然而，我们无法在任何组分中检测到Vps15p，因为Vps15p在细胞裂解物中有些不稳定，并逐渐被未知蛋白酶降解（数据未显示）。550-kD峰可能由配合物I和II的混合物组成，两者都缺乏Vps15p，即Vps30p–Apg14p–Vps34p和Vps30p–Vps38p–Vps 34p。虽然体外Vps15p的人工不稳定性使其无法精确估计络合物I和II的分子量，但它为络合物的形成提供了两个有价值的见解。首先，Apg14p和Vps38p连接器分子可以直接与Vps34p结合。在第15版激酶阴性突变体Vps34p未与Vps30p共免疫沉淀(图7); 也就是说，Vps34p不能与Vps38p结合，这表明结合需要磷酸化。从这些结果，再加上凝胶过滤的结果，我们得出了第二个结论：Apg14p–Vps34p和Vps38p–Vps 34p相互作用可能需要Vps34p的磷酸化，但不需要Vps15p的存在(图9). 一个有吸引力的假设是，Vps15p介导的磷酸化控制Vps34p与Vps38p和Apg14p的结合。

PtdIns（3）P的功能是什么？一种可能性是，PtdIns（3）P指定了不被分类到胞外缺省途径的囊泡。PtdIns（3）P结合蛋白可能在呈递PtdIns（3）P作为标记分子方面具有重要作用。FYVE结构域是富含半胱氨酸环基序的一个亚家族，已被证明直接与PtdIns（3）P结合(Burd和Emr 1998). 在酵母中酿酒酵母已知五种蛋白质具有FYVE结构域。其中之一Vac1p参与了晚期高尔基体衍生的囊泡与内体/PVC之间的融合(Peterson等人，1999年;Tall等人，1999年). 另一种含FYVE结构域的蛋白质Vps27p被归类为E类蛋白质(Raymond等人，1992年). 中的突变E级VPS基因导致液泡、内吞和晚高尔基体标记在放大的内体/PVC（E类隔室）中积聚(Raymond等人，1992年;Piper等人，1995年). Vps27p可能需要用于从内体/PVC向液泡输送蛋白质：多泡体形成和内体/PVC-高尔基体逆行运输。

或者，PtdIns（3）P可能在囊泡萌芽阶段的货物选择中发挥作用。在该模型中，货物蛋白与受体管腔结构域的结合通过构象变化传递信号，该构象变化促进受体与Vps15p蛋白激酶的结合和/或激活。Vps15p的激活导致Vps34 PtdIns 3-激酶的激活。Vps34p介导的PtdIns（3）P产生可能会招募在芽接中起作用的效应蛋白。在哺乳动物细胞中，PtdIns（3）P已被证明在接合器（AP-2和arrestin）并入质膜网格蛋白包被的小孔中发挥作用(盖达罗夫和基恩1999;Gaidarov等人，1999年). 因此，只有围绕货物受体复合体的脂质才能发芽，产生货物浓缩的小泡。PtdIns（3）P的高度负性极性头之间的斥力使膜弯曲成芽，从而产生驱动力，从而形成囊泡，这也是可能的。然而，沃特曼，一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，不抑制TGN衍生囊泡的形成，但减少哺乳动物细胞中这些囊泡的受体募集量(Gaffet等人，1997年). 这一观察结果与PtdIns（3）P是货物选择所必需的，但不是囊泡形成所必需的观点一致。在自噬和Cvt途径的情况下，复合物I可能作用于将自噬体/Cvt囊泡形成所必需的蛋白质加载到囊泡中，尽管尚不清楚自噬体/Cvt小泡的组成膜和蛋白质是否由囊泡提供。

有趣的是，Δ第15版和Δ第34版突变体具有超出Δ的额外表型虚拟专用交换机3037°C下PrA和PrB靶向突变损伤和生长缺陷。这些结果表明，一部分Vps34p–Vps15p络合物的功能独立于络合物I和II。高温下的生长缺陷可能是由内吞缺陷引起的，因为大多数内吞突变(结束)产生温度敏感生长缺陷，以及视频处理34与…等位基因结束12(Munn和Riezman 1994). 可以推测，Vps34p–Vps15p与未知因子形成额外的复合物，在晚期高尔基体向PVC/内体的顺行转运中发挥作用，以对PrA和PrB进行分类，并在内吞中发挥作用。使用细胞裂解物进行的PtdIns 3激酶分析表明虚拟专用交换机30或视频处理38仅导致PtdIns 3–激酶活性降低约20%亚太14国集团干扰物显示出与野生型细胞同等的PtdIns 3激酶活性(图2). 虽然假设的额外Vps34p–Vps15p复合物可能具有显著的PtdIns 3-激酶活性，但我们建议，Vps30p、Apg14p和Vps38p的作用不是激活Vps34p，而是赋予Vps34pPtdIns（3）P产生的功能和/或位置的特异性。与该建议一致，Vps30p或Vps38p的缺失导致一些Vps34p从LSP膜转移到HSP膜(图8C） ●●●●。需要进一步的工作来确定络合物I和II作用的确切隔室。

赤原昭夫得到了日本科学促进会（JSPS）青年科学家研究奖学金的支持。