Rho-GTP酶在细胞运动过程中控制极性、突起和粘附

将LY294002（Calbiochem）作为20 mM的储备溶液（1000×）在DMSO中制备并在−20°C下冷冻。PD98059，2-（2′-氨基-3′甲氧基黄酮）购自Calbiochem，并在DMSO中制备储备溶液（30 mM；500×），并在−20°C下冷冻。PD98059的有效性通过其抑制创伤诱导的磷酸化ERK激活的能力得到证实。将环己酰亚胺作为100 mg/ml的储备溶液（1000×）在二甲基亚砜中制备。肌球蛋白抑制剂2,3-丁二酮一肟（BDM；Sigma Chemical Co.）作为0.5 M的储备溶液在H中制备₂将O和添加到最终浓度为15 mM的溶液中，并在3 h后读取。通过BDM破坏应力纤维中肌球蛋白II组织的能力来评估BDM的有效性。p160ROCK抑制剂Y-27632(Uehata等人，1997年;Hirose等人，1998年)，在DMSO中制备为3 mM的储备溶液。Y-27632的有效性通过其破坏肌动蛋白应力纤维和局部粘连的能力进行评估。

初级REF细胞由Durward Lawson博士（英国伦敦大学学院）提供。细胞在37°C、10%CO、添加10%胎牛血清、链霉素和青霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长₂对第3代和第7代之间的次生细胞进行创伤诱导细胞迁移试验。

重组V14Rho（RhoA同种）、V12Rac（Rac1同种）、V2Cdc42（G25K同种）、C3转移酶、N17Rac、N17Cdc42和WASp（包含氨基酸201–321的Cdc42结合片段）表达为谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白大肠杆菌并在谷胱甘肽琼脂糖珠上纯化，基本上如赛尔夫和霍尔（1995）通过凝血酶裂解从小球中释放蛋白质，并在微注射缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，50 mM NaCl，5 mM MgCl）中透析₂0.1 mM DTT），并按要求进行浓缩。对于GTP-结合蛋白，活性蛋白浓度通过使用[^三H] 的GDP[^三H] 如上所述的GTP(赛尔夫和霍尔，1995年)。N17Cdc42对[^三H] 国内生产总值(赛尔夫和霍尔，1995年)因此，使用蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories）估算N17Cdc42的蛋白质浓度。用该方法还测定了C3转移酶和WASp片段的蛋白浓度。Ras的纯化中和抗体Y13-259是Hugh Paterson博士（英国伦敦Chester Beatty实验室）赠送的礼物。

伤口分析用REF以12×10的高密度播种⁴细胞在13mm玻璃盖玻片上，1d后细胞形成融合单层时受伤。伤口是通过将一根微注射针（断到其轴上并火焰抛光）刮过/穿过细胞单层造成的。伤口宽度始终在100至130μm之间，伤口愈合时间为5至6小时。细胞在损伤前用抑制剂预处理20分钟，如果是Y-27632，则预处理1小时。由于大多数伤口边缘细胞在受伤后立即聚集起来，因此很难注射，因此伤口留有1小时，以便细胞重新呼吸和促进微注射。将蛋白质与标记蛋白（FITC或德克萨斯红共轭赖氨酸右旋糖酐，浓度为2 mg/ml）一起注入细胞细胞质。按照文中所示的浓度微量注射重组蛋白。将中和抗Ras抗体Y13-259以8-9 mg/ml的浓度微量注射到PBSA中。将编码N17Rac1、N17Cdc42（G25K亚型）、WASp片段和V12HaRas的表达载体（pRK5-myc）以200μg/ml的浓度注射到细胞核中，并使用抗myc抗体（9E10）观察表达蛋白或者在Ras患者中使用大鼠单克隆抗体Y13-238。之前我们已经证明，至少90%的DNA注射细胞表达pRK5结构(Lamarche等人，1996年)细胞注射后30min内可检测到myc标记蛋白。

在每次实验中，在伤口形成后（用于抑制剂实验）、伤口形成后1小时（用于微注射实验）以及伤口边缘接触后立即修复对照伤口，并使用相位控制光学进行频繁观察。实验伤口在控制伤口愈合时修复。对于伤口闭合测量，如前所述，对细胞进行丝状肌动蛋白染色(Nobes and Hall，1995年)。简言之，将细胞固定在4%多聚甲醛/1%戊二醛/PBS中（为了保存细腻的肌动蛋白结构，如丝状伪足），在0.2%Triton X-100/PBS中渗透，用PBS中的硼氢化钠（0.5 mg/ml）封闭，并用PBS内的罗丹明结合的指骨苷（0.1μg/ml）染色。用于免疫染色的细胞用4%多聚甲醛/PBS固定，渗透，用硼氢化钠封闭，并在室温下与PBS中稀释的初级抗体孵育1h。如前所述，对细胞进行免疫染色以显示病毒素、磷酸酪氨酸和myc-tag(Nobes和Hall，1995年;Lamarche等人，1996年)。为了揭示c-fos，我们使用了1:100稀释的兔多克隆fos抗体（Oncogene Science Inc.），然后是FITC缀合的山羊抗兔（1:200；Pierce和Warriner）和FITC缀合的驴抗山羊三级层（1:200；Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.）。使用单克隆抗-MAP激酶检测双磷酸化ERK-1和-2，活化（Sigma Chemical Co.；M8159）并稀释1:50，然后是FITC缀合的山羊抗-小鼠（1:200；Pierce和Warriner）和FITC缀合的驴抗-山羊的第三层。使用亲和纯化的兔抗人血小板非肌肌球蛋白II抗体（Biomedical Technologies，Inc.）稀释至1:100，对细胞进行肌球蛋白Ⅱ染色。为了检测表达的Ras蛋白，使用0.1%皂苷/80 mM钾管（pH 6.8）/1 mM MgCl渗透细胞₂/5 mM EGTA 2分钟，然后用4%多聚甲醛固定，并用大鼠单克隆抗体Y13-238（切斯特比蒂实验室Mike Olson的礼物）孵育，然后用Cy3-结合驴抗鼠抗体孵育（Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.）。用与Ras表达载体共注入的生物素葡聚糖级联蓝色亲和素检测注入细胞。通过将盖玻片倒置到5μl移动贴装剂上安装盖玻片，该贴装剂含有第页-苯二胺（几格令/5ml）作为防臭剂。使用蔡司10×和20×空气透镜以及40×和63×1.4浸油透镜在蔡司公理光学显微镜上检查盖玻片。荧光图像记录在柯达T-MAX 400 ASA胶片上。

对对照伤口进行了半定量测量(t吨=0）和对照和抑制剂处理的伤口（在对照伤口闭合后）。在放大20倍的条件下，用罗丹明结合的卵磷脂对单个伤口的三个随机选择的区域（每个700μm长）进行染色。确定了平均伤口宽度（以微米为单位）（通过平均每30μm的宽度），并计算了平均伤口闭合百分比。

在微注射实验中，随机选择一个伤口区域，在伤口相对侧连续注射10-15个前沿细胞。由于不仅前排细胞参与伤口反应，我们还在伤口两侧的第2、3和4排注射细胞。对于微注射伤口，伤口宽度测量为微注射细胞之间的距离（伤口两侧），通过共射荧光葡聚糖或抗myc染色观察，因为一些未注射细胞通常在注入伤口的细胞之间爬行。在这种情况下，在约300–400μm的伤口长度上，每15μm进行一次测量。根据每次注射的平均值，计算伤口闭合百分比。

为了记录高尔基体在迁移的伤口边缘细胞中的位置，将较宽的伤口（～200μm宽）制作成单层REF，并在创伤后2、4和6小时固定细胞。如上所述，使用识别β-COP的大鼠单克隆抗体（23C）通过免疫标记定位高尔基体。免疫标记高尔基体在每个细胞中的位置记录如下Kupfer等人（1982年）伤口边缘细胞被分成三个以细胞核为中心的120°扇区，其中一个面向伤口边缘（见图。5A） ●●●●。高尔基体（即荧光图像的50%或更多）位于面向伤口的扇区内的细胞得分为阳性，每个时间点至少检查100个细胞。对于零时间点，给出了33.3%的细胞在前向扇区显示高尔基体的随机值。为了检测突变型GTPase对高尔基体再定位的影响，在创面形成后1 h，用编码myc标记的N17Rac、N17Cdc42、WASp和V12Cdc42的表达载体注射创面。当50%的细胞将高尔基体重新定位到前向扇区时，1小时后检测到表达的myc标记蛋白。5小时后固定细胞，记录创面边缘表达myc-tag的细胞高尔基体的位置。

将CCD摄像机和延时控制器（EOS Electronics）连接到蔡司倒置显微镜上。将注射或抑制剂处理过的细胞置于滑瓶中（分类号170920；Nunc）。显微镜图像以每60秒10帧的速度在Sony betacam录像机上采集。使用帧抓取器将单个帧从录像带传输到Macintosh计算机，并使用Adobe Photoshop进行处理。经过一段时间后，将细胞固定并染色，以鉴定微注射的细胞。

为了研究小GTP酶在成纤维细胞运动中的作用，在融合的单层原代REF上形成小的刮伤（图。1A） ●●●●。伤口宽度约为两到三个细胞（平均120μm），在5-6小时的时间内，细胞向前移动以填补缺口，而无需细胞分裂（图。1、B和D）。受伤反应迅速；在30min内，伤口边缘圆形和收缩的细胞重新排列，并将丝状伪足和跛足伸入开放空间。创伤后2小时，前排细胞明显形成极化形态，跛足和膜皱褶仅局限于细胞的前缘，而不是细胞的侧面或后缘，细胞与邻近细胞接触（图。1C） 。伤口边缘细胞保持相当紧密的包装（图。1C） 在检测过程中，钙粘附素抗体显示的粘附连接保持完整（数据未显示）。罗丹明结合的卵磷脂显示，单层中的所有细胞都含有丰富的应力纤维，但除此之外，前缘的细胞也有富含肌动蛋白的四肢和丝足延伸（图。1E） ●●●●。抗磷酸酪氨酸抗体显示所有细胞中都有拉长的局灶性粘连，前缘的细胞也有较小的局灶复合物，与跛足和丝状足密切相关（见图中的箭头）。1F） ●●●●。～5小时后，当对立细胞相互靠近时，延时电影摄影显示细胞皱褶在细胞与细胞接触的几分钟内停止（数据未显示）。

创伤导致创伤边缘和几行细胞中各种转录因子如c-fos和Egr-1快速诱导回到单层(Verrier等人，1986年;Martin and Nobes，1992年;Pawar等人，1995年)。我们观察到前缘4或5行细胞中c-fos上调（数据未显示）。然而，通过用环己酰亚胺（100μg/ml）预处理细胞来抑制蛋白质合成，对伤口闭合没有影响（伤口闭合百分比为90±3.6；对照=96±2.9%），我们得出结论，基因转录和蛋白质合成的变化不需要在短期分析中向前移动。

细胞运动通常与两种富含肌动蛋白结构的突起有关，这两种结构分别由Rac和Cdc42控制，即位于细胞前缘的跛足和丝状足，以及在瑞士3T3成纤维细胞中(Ridley等人，1992年;Kozma等人，1995年;Nobes and Hall，1995年)。为了确定Rac是否在创伤诱导的细胞运动中发挥作用，对伤口两侧的细胞斑块进行微注射显性负Rac（N17Rac）蛋白或编码N17Rac的表达载体。罗丹明结合的卵磷脂染色显示，Rac的抑制阻断了所有的跛足活动（图。2，将B与A进行比较）。细胞呈“扇形”，但仍能看到丝状伪足（图。2B、 箭头）。抑制Rac对细胞运动有严重影响（图。2、C和D）和定量分析（图。三)结果表明，注射N17Rac蛋白的细胞中伤口闭合被阻断了约80%，而注射N17Rac表达结构的细胞中细胞运动被抑制了98%。这些值的差异可能反映了N17Rac蛋白的不稳定性（半衰期～3小时；Ridley等人，1992年)。微量注射组分活性Rac蛋白（V12Rac）对细胞运动没有抑制作用（图。三)。我们得出结论，Rac在受伤时被激活，Rac活性对细胞运动至关重要。

为了确定Cdc42是否也在伤口闭合中发挥作用，在伤口对侧的细胞斑块中注射显性阴性Cdc42（N17Cdc42）蛋白或编码N17Cd42的表达载体。从图中可以看出。三抑制Cdc42导致50%的细胞运动抑制。微注射具有Cdc42靶蛋白WASp的Cdc42结合结构域的细胞导致类似水平的抑制（图。三)确认Cdc42是有效移动所必需的，但并非绝对必要。

为了研究Cdc42在伤口闭合过程中所起的作用，我们更仔细地观察了缺乏Cdc42活性的迁移细胞。图。4A显示了伤口边缘细胞的典型极化形态（用注射的荧光右旋糖酐观察），其褶皱活性仅限于前缘。相反，图。4B显示了Cdc42被抑制的伤口边缘细胞的形态。细胞极性完全丧失且突起，细胞周围可见跛足活动。组成活性Cdc42（V12Cdc42）蛋白的表达对细胞极性没有影响（图。4C） 或向前移动（图。三).

迁移细胞的极化形态还包括微管网络的重组和高尔基体在运动方向上的排列(Gotlieb等人，1981年,1983;Kupfer等人，1982年;Euteneuer和Schliwa，1992年;Bershadsky和Futerman，1994年)。尽管在REF伤口愈合试验期间未发现微管网络的重大重组（数据未显示），但诺可唑对微管的破坏确实抑制了伤口闭合60±6%(n个= 3). 另一方面，在分析过程中可以清楚地观察到高尔基体的重新排列。如图所示。5在实验过程中，高尔基体朝向运动方向的细胞百分比从33%（基本上是随机的）上升到>80%。虽然相对较长的时间过程表明，这种重新排列对运动来说并不必要，但它可能有助于运动，并且可以清楚地读出发展中的极化形态。为了确定细胞极性的这一方面是否需要Cdc42活性，在注射显性阴性Cdc42或WASp片段后，在伤口边缘细胞中测量高尔基体的重新定向。图。5（C–E）表明，抑制Cdc42完全阻止高尔基体重新排列。构成活性Cdc42（V12Cdc42）或显性负Rac（N17Rac）均不抑制创伤诱导的高尔基体再定向（图。5E） ●●●●。

在瑞士3T3成纤维细胞中，Rho对肌动蛋白应激纤维和局灶性粘连的形成和维持都是必需的(雷德利和霍尔，1992年;霍钦和霍尔，1995年)。REF单分子膜有丰富的应力纤维，在受伤后，活动边缘细胞继续显示许多肌动蛋白应力纤维朝向伤口和径向穿过细胞（图。6A） ●●●●。为了确定细胞运动是否需要这些结构，以65–75μg/ml的浓度向细胞微量注射Rho抑制剂C3转移酶。6在这种浓度的C3转移酶下，细胞缺乏所有可见的应力纤维和局灶性粘连，但它们继续正常伸展跛足和丝状足，伤口闭合（图。6D） ●●●●。

虽然伤口闭合不需要Rho活性，如应力纤维形成所示，但微量注射高四倍浓度（300μg/ml）的C3转移酶会导致底物粘附丧失和细胞严重回缩（数据未显示）在这些条件下，伤口闭合被显著抑制（80%抑制，见图。6D） ●●●●。因此，使用这种实验方法，我们无法评估肌动蛋白应激纤维/局部粘连的缺失是否可以增强细胞运动，因为C3转移酶抑制Rho至少有两种不同的作用。然而，通过阻断Rho，p160ROCK下游靶点之一的活性，可以更直接地抑制应力纤维和局部粘连(Uehata等人，1997年)，含化合物Y-27632。在20μM Y-27632的存在下，伤口边缘细胞含有少量肌动蛋白应力纤维（数据未显示），但仍附着在盖玻片上（图。6F） ●●●●。在这些分析条件下，伤口闭合速度显著增加～30%，如伤口边缘的位置所示（图。6F） 和缺失（图。6G） Y-27632。

最后，微量注射组分活性Rho蛋白（V14RhoA），该蛋白无法循环通过非活性GDP-结合状态，严重抑制伤口闭合（95%抑制；见图。6D） ●●●●。注射V14Ho不会明显增加伤口边缘细胞中肌动蛋白应力纤维的数量，尽管在某些情况下，应力纤维和局灶性粘连似乎比对照细胞更厚（数据未显示）。

我们得出的结论是，细胞运动不需要依赖Rho的应力纤维和局灶性粘附，但如前所述，维持细胞-基质粘附需要基本的Rho活性(Takaishi等人，1993年;Ridley等人，1995年;Santos等人，1997年)。此外，局部粘连和应力纤维在运动过程中必须进行动态翻转，这一要求会对运动速度产生抑制作用。

Ras被提议在调节局部粘连的周转中发挥作用(Schlaepfer和Hunter，1998年)。为了确定Ras在检测过程中是否被激活，用一种识别双重磷酸化ERK（Ras通路的下游靶点）的抗体观察受伤细胞。图。7显示ERK在受伤后（5分钟内）迅速激活，但水平下降至背景值1小时。有趣的是，ERK激活被视为比c-fos诱导更向后延伸（八排，而不是四排）。通过微量注射中和Ras抗体Y13-259（数据未显示）或与MEK抑制剂（PD98059）预孵育，可以阻断创伤诱导的ERK激活（图。7)表明Ras/MEK通路对创伤诱导的ERK激活的需求。

为了确定Ras是否是细胞运动所必需的，用中和Ras抗体Y13-259微注射伤口周围的细胞块(Furth等人，1982年)。抑制Ras对跛足前突没有影响（图。8A和B），也不影响电池极性（未显示数据）。然而，细胞运动受到80%的抑制（图。8G） ●●●●。通过延时视频显微镜对Ras被抑制的细胞进行的进一步分析显示，正常的前伸活动，但没有细胞净运动。然而，我们确实观察到Ras抑制细胞中的肌动蛋白应力纤维和局灶性粘连（图。8，A–D）似乎比对照细胞中的细胞更厚更大，类似于我们在注射组分活性Rho的细胞中观察到的情况。这些观察结果表明Ras与局部粘连和应力纤维周转之间可能存在联系。为了验证这一点，将细胞注射Ras抑制剂Y13-259，并与Rho抑制剂C3转移酶联合注射，或用p160ROCK抑制剂Y-27632处理。在这两种情况下，应力纤维和局部粘连都如预期的那样丢失（数据未显示），但现在细胞正常迁移导致伤口闭合（图。8G） ●●●●。

有趣的是，当V12Ras以相对较低的水平表达时，以及在微量注射表达构建物后的早期（2小时），我们使用抗Ras抗体Y13-238清楚地观察到Ras集中在局部粘附部位（见图。8图中的E和vinculin costain。8F） ●●●●。经过较长时间（6小时）后，V12Ras对细胞形态有显著影响，导致粘附丧失和细胞形态改变，这是典型的形态改变。

Ras调节许多信号级联，包括ERK-MAP激酶途径和一些但不是所有细胞中的PI3-激酶(Rodriguez-Viciana等人，1997年)。为了检查这两种活性是否可能与此处所示的Ras需求有关，我们使用了MEK抑制剂PD98059和PI3-激酶抑制剂LY294002。这两种抑制剂中的任何一种单独对伤口闭合的抑制作用都相对较弱（分别为25%和30%；见图。8H） 即使是联合用药，伤口闭合也仅被抑制约50%。我们得出结论，这两条下游途径都不可能解释伤口闭合期间的特定Ras需求。

通过对模型细胞系Swiss 3T3成纤维细胞的分析，确定了三种信号转导途径，它们负责控制肌动蛋白细胞骨架的组织，并且每种途径都由小GTPase Rho家族的一个成员调节（在里德利，1996年;Van Aelst和D’Souza-Schorey，1997年;霍尔，1998年)。Rho促进肌动蛋白-肌球蛋白收缩丝（应力纤维）和相关局灶黏附复合体的组装，Rac诱导形成突出的跛足结构(Ridley和Hall，1992年;Ridley等人，1992年)，而Cdc42触发丝状伪足形成(Kozma等人，1995年;Nobes and Hall，1995年)。由于丝状肌动蛋白结构的组装和分解驱动细胞运动、轴突引导、吞噬和胞质分裂，因此Rho GTPases很可能在控制这些基本生物过程中发挥关键作用。在这里，我们研究了Rho、Rac和Cdc42对细胞运动的个人贡献。

动物细胞通过沿着表面爬行来移动，这包括前缘的突出活动与细胞核和细胞体的向前运动的结合(劳芬伯格和霍维茨，1996年;Mitchison和Cramer，1996年)。细胞可以作为个体或群体移动，通常是成片的，在胚胎和成人中都可以发现这两种类型的移动。为了分析细胞如何协同运动，我们使用了体外伤口愈合试验。融合成纤维细胞单层中的单个细胞是不活动的，并且似乎Rac和Cdc42活性水平较低，因为只能看到少数零星的膜突起。另一方面，Rho似乎非常活跃，因为细胞显示出许多应力纤维和局部粘连。单分子膜的损伤会诱导前缘或前缘附近的细胞向前爬行以闭合间隙，在我们实验的5小时过程中，细胞会像一张纸一样协同移动，与相邻细胞保持紧密接触。

受伤最明显、最直接的影响是（在几分钟内）在前缘诱发动力活动、跛足和丝状突起以及膜皱褶。这与Rac和Cdc42的创伤诱导激活相一致，尽管从形式上讲，这些GTPase可能已经在单层中激活，但由于细胞-细胞接触而功能沉默。无论如何，微量注射带有Rac抑制剂的伤口边缘细胞可防止跛足形成和膜皱褶（丝状伪足仍可见），并且在实验过程中没有向前移动。其他人报告称，Rac是成纤维细胞对PDGF的趋化性所必需的(Anand-Apte等人，1997年)巨噬细胞朝向CSF-1(Allen等人，1998年)，用于肝细胞生长因子诱导的MDCK上皮细胞散射(Takaishi等人，1994年;Ridley等人，1995年)以及一些转移细胞的侵袭性移动(Habets等人，1994年;Michiels等人，1995年)。此外，Rac在果蝇属胚胎阻止了驱动背部闭合所需的肌动蛋白细胞骨架变化，这一过程涉及早期胚胎周围上皮细胞片的运动(Riesgo-Escovar等人，1996年;Glise和Noselli，1997年)。因此，Rac似乎是普遍需要的，以驱动细胞爬行，这与其在控制跛足病形成中的独特作用相一致。

受伤后看到的其他突出结构是丝状伪足，正如对瑞士3T3细胞的研究所预期的那样，这些结构可以通过伤口边缘细胞中Cdc42的抑制而完全阻断。然而，这只导致伤口部分封闭（～50%），似乎尽管Cdc42活性是有效细胞运动所必需的，但在本试验中，它并非绝对必要。然而，对Cdc42被抑制的细胞进行更仔细的检查，可以发现这种蛋白具有非常有趣的作用。通常，伤口边缘的细胞形成形态极性，显示出清晰的前缘（有膜褶皱和丝足），但在其侧面或后部没有突起活动，在那里它们与相邻细胞接触。此外，迁移细胞将高尔基体极化至细胞核前方和迁移方向（另见Kupfer等人，1982年)布雷菲尔丁A直接或间接用诺可达唑破坏高尔基体（破坏微管）抑制定向细胞迁移(Bershadsky和Futerman，1994年)。我们观察到，伤口边缘细胞中Cdc42的抑制导致极性完全丧失；无论细胞与细胞之间是否存在接触，细胞都会在其周围突出跛足，高尔基体不会发生重新定向。我们得出结论，激活Rac不需要Cdc42，但需要通过产生极化信号将Rac活动限制在前沿。

这些观察结果指出了与酵母的一些有趣的类比酿酒酵母，其中Cdc42是细胞生长过程中形成芽所必需的(德鲁宾，1991年;德鲁宾和纳尔逊，1996年)。Cdc42失活导致肌动蛋白细胞骨架破坏，细胞极性和定向分泌丧失；因此，细胞生长变得各向同性(Adams等人，1990年)。这些结果与我们在伤口化验中观察到的结果具有惊人的相似性。然而，一个显著的差异是组成活性Cdc42的作用；在酵母中，这也会导致细胞极性的丧失(Ziman等人，1991年)但在伤口边缘细胞中，它对其极性没有明显影响。也许成纤维细胞单层中细胞-细胞接触的存在提供了额外的限制，在这方面，值得注意的是，显性阴性和组成性激活的Cdc42都阻止了定向细胞迁移，尽管其本身不是运动性的，趋化性试验中分离的巨噬细胞，以及与抗原呈递细胞相互作用后分离的T细胞中MTOC的重新定位(Stowers等人，1995年;Allen等人，1998年)。我们的观察表明，Cdc42活性和细胞-细胞接触之间存在一些有趣的相互作用。

Cdc42在多细胞生物中产生极性的机制尚不清楚，尽管在酵母中，Cdc42由Ras家族中的另一种小GTPase Bud1定向到芽位点。甚至还不清楚是否需要丝状伪足，或者它们是否是在确定极性后形成的。我们的实验表明Cdc42有两个极端作用：（a）它将突起（即Rac活性）和分泌（微管依赖性高尔基体重新定向）导向前缘；或（b）抑制细胞与细胞接触区域的突出活动。通过与酵母类比，我们支持第一种模型，但不能排除第二种模型。

收缩肌动蛋白-肌球蛋白丝存在于所有动物细胞中；在培养的成纤维细胞中，它们很容易被视为组织良好的束（应力纤维），在特定部位（局部粘连）与质膜相连(Jockusch等人，1995年;伯里奇和科尔扎诺夫斯卡·沃德尼卡，1996年;Burridge等人，1997年)。用于伤口愈合分析的REF具有丰富的应力纤维和局灶性粘连，甚至在创伤后的前缘细胞中也保持着这些纤维和局局长粘连。人们常说，这些结构可能会抑制运动(Couchman and Rees，1979年)，我们已经使用Y-27632化合物证实了这一点，Y-27632化合物是Rho效应器p160ROCK的抑制剂，介导肌动蛋白应力纤维组装(Leung等人，1996年;Amano等人，1997年;Ishizaki等人，1997年;Uehata等人，1997年)。Y-27632诱导肌动蛋白应力纤维和局部粘连的丢失（不明显影响细胞形状或附着），并导致细胞迁移率显著增加（30%）。有趣的是，肌球蛋白ATP酶抑制剂BDM也刺激肌动蛋白应激纤维的丢失，将细胞运动抑制了30%（数据未显示），这表明在本试验中，其他收缩性肌动蛋白-肌球蛋白丝可能在细胞运动中发挥一定作用。

几个小组已经确定Ras在细胞运动中的重要作用，包括在趋化性和伤口闭合试验中(Sosnowski等人，1993年;Fox等人，1994年;Kundra等人，1995年)。我们还发现，抑制Ras会阻止细胞运动，但我们也表明，通过抑制Rho或其效应蛋白p160ROCK，同时抑制局部粘附/应力纤维组装，可以完全恢复运动。该实验强烈表明，Ras调节局灶性粘连和应力纤维的周转，这显然是迁移细胞的一个重要特征(Izzard和Lochner，1976年;邓利维和库奇曼，1993年)。这可能至少以两种方式发生。首先，Ras可能调节Rho GTPase循环。由于Rho是形成局灶性粘连所必需的，它们的周转可能取决于Rho失活（即从Rho.GTP形成Rho.GDP），这可能由GTPase激活蛋白（GAP）控制。p120RasGAP是一个明显的候选分子，可以在两个GTPase之间提供链接，已知其存在于与p190RhoGAP（一种Rho活性GAP）的复合体中。事实上，NH的过度表达₂-p120RasGAP的末端非GAP区域导致应力纤维损失(Ellis等人，1990年;Settleman等人，1992年;McGlade等人，1993年;Ridley等人，1993年).

第二种可能性是Ras独立于Rho调节局灶性粘附周转。支持该模型的观察结果是，尽管p160ROCK抑制剂Y-27632在Ras抑制后恢复了细胞运动，但它并不恢复表达组成性活化Rho蛋白（V14Rho）的细胞的细胞运动（数据未显示）。然而，Ras调节局灶性粘连转换的机制尚不清楚。MEK或PI3-激酶（由Ras控制的两条下游通路）的抑制似乎只对运动产生轻微影响。这与之前的报告相反，这些报告表明PI3-激酶和MAP激酶途径对运动性很重要(Keely等人，1997年;Klemke等人，1997年)。此外，作为Ras介导信号靶点的黏着斑蝥复合物的成分也不清楚，尽管黏着斑激酶是一种被认为在其转换中起重要作用的分子(Ilic等人，1995年;Gilmore和Romer，1996年).

总之，我们已经证明Rac对于产生伤口愈合分析中向前运动所需的前缘突起至关重要。Cdc42活性对维持迁移细胞的极化表型至关重要，Rho是细胞粘附所必需的。Ras对促进移行过程中的局灶性粘连转换也至关重要。主要悬而未决的问题涉及介导这些GTP酶功能的生物化学途径的性质以及它们如何在时间和空间上协调。

我们感谢Toshio Hamasaki（Yoshitomi Pharmaceutical Industries，Ltd.，Japan）提供Y-27632化合物，Tina Bridges和Anne Ridley提供重组蛋白，Hugh Paterson提供Ras抗体，Colin Hopkins提供高尔基抗体，Durward Lawson提供初级REF细胞。我们感谢Paul Martin和Louise Cramer对手稿的批评性阅读，以及Colin Hopkins和Richard Lamb的有益讨论。

间隙

GTPase激活蛋白

裁判

大鼠胚胎成纤维细胞