神经和星形胶质细胞功能障碍与胚胎成纤维细胞分化恩杜夫斯4^飞/飞鼠标

线粒体疾病是一种罕见疾病的集合，每种疾病都以线粒体功能障碍为特征，估计每5000名活产婴儿中就有一例受到影响[1]. 这种疾病的表现形式多种多样，可能涉及任何组织、任何严重程度和任何年龄[2]. 然而，通常情况下，会涉及到表现出高能量需求的代谢活性更强的组织，尤其是大脑[三,4]. 该病的遗传基础也很复杂，包括OXPHOS（氧化磷酸化）系统在内的100多个功能线粒体所需的基因发生了致病性突变[4,5]. 虽然疾病相关OXPHOS基因的突变与广泛的经典线粒体疾病有关，但其中最常见的是LS（Leigh综合征）[4].

LS是一种进行性神经退行性疾病，患者表现出广泛的神经系统症状，包括共济失调、呼吸异常、视神经萎缩、发育迟缓、听力障碍和癫痫[6–8]. 病理学上，该病的特征是基底节、丘脑或脑干对称性双侧病变，血液和/或脑脊液中乳酸增加，神经胶质增生和神经元脱髓鞘[6–8]. 虽然LS的大体生化和临床表现特征明确，但从感兴趣的神经区域获取新鲜患者样本的困难限制了我们在细胞水平上对生化特征的理解。

为此，最近产生了一些原发性线粒体功能障碍的动物和细胞模型系统（在[9,10])，包括恩杜夫斯4^飞/飞和恩杜夫斯4缺少OXPHOS CI（复合物I）亚单位NDUFS4的KO（敲除）小鼠[11,12]. 与LS患者一样，NDUFS4缺陷小鼠出现双侧脑干高强度损伤[13,14]. 小鼠也表现出与LS患者相似的临床表现[11–14]. 此外，大脑特异性恩杜夫斯4KO小鼠在生化和表型上与整个动物KO几乎没有区别，证实了该病的神经基础及其临床特征[13]. 由于NDUFS4缺陷小鼠重述了LS的许多共同特征，这些小鼠提供了机会来研究线粒体系统和动力学在神经环境中是如何受到影响的。

到目前为止，NDUFS4缺乏小鼠的全脑制剂分析[12,13]发现，像NDUFS4缺陷患者和小鼠成纤维细胞[15,16]，CI结构和功能被破坏。在每个系统中，CI在BN-PAGE（蓝色原生-PAGE）上形成≈830 kDa的致残复合体。此外，发现CI缺陷影响了分离的脑线粒体中CI依赖性ATP的合成[12]. 也有证据表明NDUFS4缺乏小鼠嗅球中的蛋白质受到氧化损伤，嗅球是受疾病影响的大脑区域之一[13]. 考虑到NDUFS4缺乏的患者和成年小鼠成纤维细胞产生的ROS（活性氧物种）数量增加，包括超氧化物（O₂^•−)和H₂O（运行）₂（过氧化氢）[17–19]. 因此，有理由预计，神经相关细胞类型中CI的破坏也会导致ROS的生成增加，从而促进神经病变。然而，在恩杜夫斯4KO小鼠初级中脑神经元₂^•−分离线粒体和H的生成₂O（运行）₂与对照组相比，整个细胞的产量正常[20,21].

因此，表征细胞类型特异性疾病机制，如活性氧动力学，将增加我们对LS疾病发病模式的了解。为此，我们试图从细胞中分离和表征初级等皮质星形胶质细胞和等皮质神经元恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}鼠标。尽管星形胶质细胞是哺乳动物大脑中最丰富的细胞类型[22,23]它们在线粒体疾病中的作用往往被忽视。星形胶质细胞通过诸如神经递质循环和细胞外钾同质化等过程与神经元进行代谢错综复杂的联系，以实现适当的细胞功能[23,24]. 此外，它们与LS患者和NDUFS4缺乏小鼠的疾病进展有关，激活的星形胶质细胞浸润到受影响的大脑区域是这两个系统的特征[7,13]. 同时，我们还研究了线粒体在恩杜夫斯4^飞/飞MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞），作为我们研究中非神经组织的对照细胞类型。我们对OXPHOS系统及其相关线粒体过程的研究恩杜夫斯4^飞/飞因此，星形胶质细胞、神经元和MEF提供了在细胞类型特异性水平上研究疾病机制的机会。

这个恩杜夫斯4^飞/飞小鼠是通过将B2 SINE（短间隔核元件）自发插入NADH脱氢酶（泛醌）Fe-S蛋白4（Ndufs4）如前所述的基因[12]，并在BALB/c背景下维护。根据默多克儿童研究所动物伦理委员会（A662）批准的协议，繁殖杂合小鼠以产生幼崽和胚胎。将小鼠置于12小时的光/暗循环中，并提供随意获得食物和水。

如前所述，分别从3-5日龄幼鼠和17-18日龄胚胎等皮质中分离出初级等皮质星形胶质细胞和等皮质神经元[25,26]. 简单地说，组织收集在不含镁的HBSS（Hanks缓冲盐水溶液）中²⁺和钙²⁺（Gibco），并在0.6%（w/v）胰蛋白酶和2.78 mM葡萄糖中消化[30分钟，37°C，5%（v/v）CO₂]. 在用含有100单位/ml DNAse I（Invitrogen）的1 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Invit罗gen）中和胰蛋白酶后，细胞被机械分离并在含有mg的HBSS中稀释²⁺和钙²⁺将分离的星形胶质细胞在含有25mM葡萄糖的DMEM（文本中缩写为“葡萄糖”培养基；Thermo-scientific）中稀释，并补充10%（v/v）FCS，并将其置于预涂有50μg/ml poly的烧瓶中D类-赖氨酸。在汇合处，将星形胶质细胞培养物在200 rpm、37°C下摇晃14-16 h，以去除污染细胞类型。分离的神经元在补充了B-27（Invitrogen）的NBM（神经基础培养基；Invitrogen）中稀释，292 mg/lL（左）-谷氨酰胺，并在烧瓶中镀上50μg/ml聚乙烯D类-赖氨酸或预先涂有50μg/ml聚乙烯的盖玻片D类-赖氨酸和10μg/ml层粘连蛋白。通过免疫细胞化学（补充材料和方法部分和补充图S1）评估神经元和星形胶质细胞培养物的纯度。

从受精后12.5-14.5天的胚胎中分离出初级MEF。切除头部和内脏器官后，对组织进行机械破坏，随后用0.125%胰蛋白酶消化（30分钟，37°C，5%CO₂). 然后，将细胞机械分离、造粒，并将其置于涂有0.1%明胶的培养瓶中的葡萄糖培养基中。

细胞保持在37°C和5%CO₂在加湿室中。所有细胞隔离缓冲液（HBSS）和培养基均含有60.3 mg/l青霉素和100 mg/l链霉素。线粒体DNA缺陷（ρ°）和对照（ρ⁺)鼠标LM（TK⁻)单元格[27]用50μg/ml尿苷维持在葡萄糖培养基（如上所述）上。如前所述，星形胶质细胞和MEF在含有5 mM半乳糖（文中缩写为“半乳糖”培养基；Gibco）的DMEM中交替培养，补充10%透析的FCS和292 mg/lL（左）-谷氨酰胺。

如前所述，从原代细胞中分离出线粒体[28].

如前所述，在30°C条件下，测定原代细胞培养物中CI和CS活性与总蛋白的关系[29]. 简单地说，细胞在缓冲液（200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、5 mM HEPES游离酸、1 mM EGTA、pH 7.2）中用Teflon-glass均质器和台式钻机以1000 rpm的速度进行均质。碎片在600时通过低速旋转被清除克对于CI活性测量，样品在含有辅酶Q的缓冲液中稀释₁在鱼藤酮存在或不存在的情况下，NADH、氰化钾和抗霉素A。在分光光度计中测量CI的活性，作为在340nm下3分钟内NADH氧化的鱼藤酮敏感速率。对于CS活性测量，样品在含有5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、草酰乙酸和乙酰辅酶A的缓冲液中稀释。用分光光度计在412 nm处监测3 min以上硫代硝基苯甲酸盐阴离子生成速率。

将原代细胞颗粒溶解在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液中[50 mM Tris/HCl、150 mM NaCl、1%（v/v）Triton X-100、1%（w/v）Na脱氧胆酸盐、0.1%（w/v）SDS、1 mM EDTA，pH至7.4]，在LDS（十二烷基硫酸锂）样品缓冲液（Invitrogen）中稀释，热变性（10分钟，60°C）并在10%Novex双三凝胶（Invitrogen）上分离。将凝胶转移到0.45μm PVDF膜（Millipore）上进行免疫修饰。用抗NDUFS4（MitoSciences，MS104）或抗SDHA（Molecular Probes，A-11142）探测膜。

将细胞颗粒溶解在1%洋地黄素或1%Triton X-100中，并使用BN-PAGE分离蛋白质复合物[30]. 简单地说，在4–10或4–13%BN-PAGE凝胶（Invitrogen）上，每个通道分离50–80μg全细胞裂解物。将凝胶转移到PVDF膜（Millipore）上进行免疫修饰。用针对CI亚单位NDUFA9的抗体探测膜[31]、CII亚单位SDHA（Invitrogen）或复合III亚单位Core1（Invit罗gen）。

如前所述，在原代细胞培养物和分离线粒体的技术副本中测量ATP合成速率[32]. 简言之，10μg细胞或2μg分离的线粒体在含有40–80μg/ml洋地黄素（仅限全细胞）和有/无抑制剂底物的ATP合成缓冲液中稀释10倍[琥珀酸（10 mM）；丙二酸（1 mM），谷氨酸（10 M M）；丙酮酸（10 m2）；苹果酸（10 m3）；鱼藤酮（2.5μM）]并在37°C下培养20分钟。用冰上的高氯酸停止反应，用氢氧化钾和MOPS中和反应。使用基于荧光素酶的分析（Roche，11699695001）在微孔板阅读器（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）中测定样品中的ATP浓度。速率报告为琥珀酸盐+鱼藤酮测量值的比率。

细胞培养在96个黑色板（2×10）中⁴原代星形胶质细胞和MEF的细胞/孔，5×10⁴ρ°和ρ的电池/孔⁺LM（油箱⁻)细胞），并用含有75 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM；Sigma）和2μg/ml Hoechst-33258（Sigma₂). 随后，在ΔΨ_米（线粒体膜电位）在至少三个孔中测定为TMRM与Hoechst荧光的比值（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。用CI抑制剂鱼藤酮（2.5μM）或原核FCCP（羰基氰化物）处理的细胞第页-三氟甲氧基苯腙）；西格玛；20μM）作为对照。

或者，ΔΨ_米通过显微镜在玻璃底培养皿（WPI，FD-35-100）中培养的细胞中测定。细胞在含镁的HBSS中培养²⁺和钙²⁺含37.5 nM TMRM（30分钟，37°C，5%CO₂). 在37°C的DeltaVision OMX V3成像系统（Applied Precision）上，使用TRITC（四甲基罗丹明β-异硫氰酸盐）过滤器组（带油浸物镜（Olympus，IX71），并配备CoolSNAP HQ）对细胞进行可视化²相机（光度学）。初始成像后，将20μM FCCP或2.5μM鱼藤酮添加到培养皿中，并重新捕获感兴趣的区域。对图像进行去卷积、裁剪和最大强度投影（Applied Precision，SoftWoRx v5.5）。在每盘培养皿中选择超过60个细胞的富含线粒体的核周区域，并在FCCP或鱼藤酮应用前后测定平均TMRM荧光。

细胞培养在96个黑色板（2×10）中⁴细胞/孔），并用含有10μg/ml DHE（二氢乙硫酸氢钠；Sigma）和2μg/ml Hoechst-33258（40分钟，37°C，5%CO）的培养基培养₂). 细胞在PBS中清洗₂^•−在至少三口井中测定的产量为DHE与Hoechst荧光的比值（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。用CI抑制剂鱼藤酮（2.5μM）处理的细胞作为对照。

H的比率₂O（运行）₂产量是按照前面描述的进行测量的[33]使用荧光探针Amplex Red在5μg分离的线粒体中添加底物和抑制剂组合，详见正文[琥珀酸（10 mM）；丙二酸（1 mM）、谷氨酸（10 M M）；丙酮酸（10 m2）；苹果酸（10 m3）；鱼藤酮（2.5μM）]。H（H）₂O（运行）₂在20分钟内对产量进行荧光测量（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。

如前所述，用50μM H处理细胞₂O（运行）₂在培养基中培养6h。用胰蛋白酶收集细胞，并稀释至2×10⁵annexin-V结合缓冲液中的细胞数/ml（10 mM Hepes，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl₂pH至7.4）。将500μl的等分试样与5μl膜联蛋白-V（Invitrogen）和1μg/ml PI（碘化丙啶，Sigma）在室温下共孵育10分钟，然后通过流式细胞仪（Becton Dickinson，LSR II流式细胞仪）和FITC-A和PI-488-695/40-A激光器进行分析。使用正向和侧向散射参数（De Novo，FCS express V4）区分活细胞和死细胞。健康细胞被认为是膜联蛋白V和PI双重阴性，凋亡细胞为膜联蛋白-V阳性，坏死细胞为膜连蛋白-V和PI双重阳性。选通策略如补充图S2（A）和S2（B）所示。

除非另有说明，误差条表示平均值的标准误差（S.E.M.）和P（P）值由双尾未配对生成t吨测试（GraphPad，PRISM V6.0b）并在≤0.05时报告。

未检测到NDUFS4亚单位恩杜夫斯4^飞/飞检查的原代细胞类型(图1A） 与NDUFS4在小鼠中的系统性破坏一致，并与之前关于所有研究组织的报告一致[12]. 培养并没有改变这一点恩杜夫斯4^飞/飞原代MEFs和星形胶质细胞在有利于OXPHOS系统（在半乳糖上）产生ATP的条件下。年CI活动严重受损恩杜夫斯4^飞/飞标准培养条件下的原代MEF（+/+的21%）、星形胶质细胞（+/+中的23%）和神经元（+/+里的42%）（葡萄糖培养）(图1B） ，类似于关于小鼠组织的报告[12]. 为了解释线粒体体积和/或数量的变化，CI活性被归一化为CS活性，而CS活性不受NDUFS4缺失的影响(图1C） ●●●●。值得注意的是，虽然CI相对于CS的活性在每个恩杜夫斯4^飞/飞细胞类型，神经元中相对于CS的CI活性低于星形胶质细胞和MEF(图1B） ●●●●。

结合之前从恩杜夫斯4^飞/飞老鼠[12]CI活性的组织特异性差异似乎不太可能是主要神经功能障碍的基础恩杜夫4^飞/飞鼠标。

接下来我们研究了CI在原代细胞系中的组装状态。与之前的报告一致，我们使用BN-PAGE观察到缺少NDUFS4的CI形成≈830 kDA的残缺组装中间产物（CI），当细胞溶解在Triton X-100中以分离单个OXPHOS复合物时，其数量会减少(图2A： +/+，奇数车道；恩杜夫斯4^飞/飞，甚至车道）[12,15,16,34]. 这与所有原代细胞的培养条件无关(图2A） ●●●●。此外，当恩杜夫斯4^飞/飞细胞颗粒溶解在温和的去污剂洋地黄中，以保持与其他OXPHOS复合物的超分子相互作用(图2B和2D： +/+，奇数车道；恩杜夫斯4^飞/飞超复合物以较小的分子量出现，对应于含有受损CI的超复合物。同样，这与所有原代细胞的培养条件无关(图2B和2D） ●●●●。

此外，成熟复合物III（CIII）的水平₂)在所有细胞和所有检测的培养条件下都是相似的(图2C） ●●●●。然而，大量的游离CIII₂超复合体中的非束缚态似乎增加了恩杜夫斯4^飞/飞单元格(图2D） 与含有残缺CI的超复杂物种丰度减少一致。

这些数据表明，CI本身和含有残缺CI的超复合体的组装在所有初级细胞中的洗涤剂溶解细胞颗粒中受到同样的破坏恩杜夫斯4^飞/飞细胞类型和培养条件。因此，这些数据并没有进一步揭示疾病组织特异性本质背后的机制，也没有表明MEF和星形胶质细胞对半乳糖的适应性变化，以应对细胞ATP生成对OXPHOS的更大依赖。

如上所述，所有患者的CI活性和装配均严重受损恩杜夫斯4^飞/飞研究了原始细胞类型。考虑到CI对IMM质子泵的整体性，可以预计这可能会影响ΔΨ_米此外，半乳糖培养细胞会增加对OXPHOS的依赖性，这可能会进一步影响ΔΨ_米尽管如此，在基础条件下，ΔΨ_米仅在年严重受损恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF(图3A和三B） 而在星形胶质细胞中表现正常(图3C和三D） 和神经元(图3E和三F） ●●●●。更具体地说，ΔΨ_米处于静止状态恩杜夫斯4^飞/飞葡萄糖培养基上的初级MEF去极化（电中性更强；图3A；75%的+/+），并在半乳糖培养基上出现进一步去极化(图3B类；+/+的60%）。作为对照实验，我们发现ΔΨ_米在应用CI抑制剂鱼藤酮或原核细胞FCCP后，在所有培养条件下，所有类型的细胞都同样去极化(图3A–三F） ●●●●。此外，使用不具备功能性OXPHOS系统的小鼠成纤维细胞ρ°细胞验证了方法学方法[27]. 在静止的ρ°单元中，ΔΨ_米当用两个平板阅读器测量时，明显去极化（补充图S3A；ρ的62%⁺)和显微镜（补充图S3B和S3C；ρ的48%⁺)与之前在类似细胞中的观察结果一致[35,36].

然而，初级MEF和星形胶质细胞对应用CV（复合V）抑制剂寡霉素的反应不同。抑制CV会阻止电子流回线粒体基质，从而导致ΔΨ的超极化（更负电性）_米当OXPHOS正在运行时。在葡萄糖培养基上培养的原代MEF中(图3A） ，寡霉素对ΔΨ无影响_米但它使ΔΨ超极化_米当细胞在半乳糖上培养时(图3B） ●●●●。相反，在原代星形胶质细胞中，ΔΨ_米不考虑培养基，应用寡霉素后去极化(图3C和三D） ●●●●。但这种现象并不是基因型特异性的，可以反映寡霉素对原代星形胶质细胞的毒性。

ΔΨ_米用于驱动许多线粒体过程。其中最关键的一个，被认为是线粒体的核心功能，是通过CV合成ATP[37]. 在这种情况下，我们试图确定透性化中CI依赖型ATP合成的最大容量恩杜夫斯4^飞/飞原代细胞在最佳底物条件下。这些测量是在洋地黄素渗透的情况下获得的恩杜夫4^飞/飞原代细胞具有CI依赖性底物谷氨酸+苹果酸或丙酮酸+苹果酸酯，有或没有CI抑制剂鱼藤酮。所有比率都是相对于用琥珀酸盐+鱼藤酮测定的CII依赖性比率得出的，因为这些比率不应受到CI缺乏的影响。重要的是，在CII-依赖型ATP合成率的基因型之间没有检测到统计上的显著差异(表1).

在恩杜夫4^飞/飞主要MEF，CI依赖的ATP合成速率与葡萄糖培养基上的对照几乎没有区别(图4A和4E；82–105%（+/+），但半乳糖降低(图4C；+/+的55–60%）。相反，在恩杜夫斯4^飞/飞谷氨酸+苹果酸降低了原代星形胶质细胞的CI依赖率(图4B、，4D和4F；67–79%（葡萄糖+/+）和77%（半乳糖+/+），但丙酮酸+苹果酸正常，与培养基无关(图4B、，4D和4F） ●●●●。在恩杜夫斯4^飞/飞所有CI依赖性底物都会降低初级神经元ATP合成速率(图4G；+/+的63–74%）。为了证实底物的特异性，我们确定在存在CI抑制剂鱼藤酮的情况下，ATP合成的CI依赖性速率几乎完全消除恩杜夫斯4^飞/飞所有培养条件下的原代细胞类型(图4A–4G） ●●●●。

我们还注意到渗透性初级神经元(图4G） 与渗透性MEF或星形胶质细胞相比，单用琥珀酸盐合成ATP的速率相对于琥珀酸+鱼藤酮的速率更低（<1）(图4A–4D） ●●●●。此外，该相对比率在+/+比恩杜夫斯4^飞/飞神经元(图4G；0.60对0.74）。此外，在+/+MEF和星形胶质细胞分离的线粒体中观察到<1的相对比率，但没有恩杜夫斯4^飞/飞单元格(图4E和4F） ●●●●。这些数据共同表明，RET（反向电子转移）可能发生在所有被检测的原代细胞类型中。术语RET描述了由CII产生的泛喹诺酮将电子提供给反向CI反应而不是正向CIII反应的过程[38]. RET被CI的鱼藤酮抑制所阻断。数据还表明，RET在恩杜夫斯4^飞/飞初级细胞，最突出的是神经元。这可能是因为CI缺陷阻断了CI的正向和反向电子传递。此外，这些观察结果表明，在我们的渗透性细胞中，少量不存在于孤立线粒体中的残余CI依赖性底物可能会人为地增加ATP合成的CII依赖性速率。事实上，虽然在没有提供底物的情况下，ATP合成的一般速率非常低（补充图S4A-S4G），但与分离的线粒体和神经元相比，在透化细胞中观察到的速率略高。作为对照，我们确定所有细胞类型中依赖CII的ATP合成速率对CII抑制剂丙二酸盐敏感（补充图S4A–S4G；相对于琥珀酸+鱼藤酮的速率<1）。

CI功能障碍不仅影响ΔΨ_米以及相关的ATP合成，但也可能与ROS生成增加有关。活性氧如果不被细胞迅速解毒，则有可能对细胞结构造成氧化损伤，包括DNA、蛋白质和脂质[39,40]. 因此，我们试图量化O的数量₂^•−生产单位：恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}原代MEF和星形胶质细胞在葡萄糖或半乳糖培养基上培养，使用O₂^•−特定探针DHE。此外，CI和CII-依赖H₂O（运行）₂使用Amplex Red对MEF分离的线粒体和生长在葡萄糖培养基上的星形胶质细胞的产量进行了测量。由于样品可用性的限制，我们无法进行O的可比测量₂^•−和H₂O（运行）₂生产恩杜夫斯4^飞/飞初级神经元。

与对照细胞相比，恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}主要MEF产生的O量增加₂^•−在葡萄糖培养基上休息(图5A；150%+/+），但不在半乳糖培养基上(图5B） ●●●●。相比之下，O的比率₂^•−静态生产恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞在任一葡萄糖上培养(图5D） 或半乳糖(图5E） 培养基和对照组无法区分。鱼藤酮治疗刺激O₂^•−在所有细胞类型中，与基因型或培养条件无关(图5A、，5B、，5D和5E） ●●●●。然而，鱼藤酮依赖性增加O₂^•−两者的产量均较低恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF(图5C） 和星形胶质细胞(图5F） 与+/+相比，不考虑文化媒体。

相反，H的比率₂O（运行）₂其产量相当于分离的线粒体中的对照恩杜夫斯4^飞/飞MEF公司(图5G） 和星形胶质细胞(图5H） 同时含有CI-（谷氨酸+苹果酸）和CII-依赖底物（琥珀酸）。此外，鱼藤酮诱导H₂O（运行）₂与CI相关的产量在+/+和恩杜夫斯4^飞/飞原发性MEF和星形胶质细胞(图5G和5H） ●●●●。但值得注意的是，H的CII依赖性比率₂O（运行）₂MEF和星形胶质细胞线粒体在与CI-抑制剂鱼藤酮孵育时的产量均低于未孵育的情况。此外，尽管不显著，但这一趋势在这两个领域似乎都更加明显恩杜夫4^飞/飞MEF和星形胶质细胞与对照组比较。这进一步表明RET在我们的原代细胞中发生，并且该过程在恩杜夫斯4^飞/飞细胞。

我们的结果表明线粒体功能的改变是细胞类型特异性的，因此在葡萄糖培养基上的标准培养条件下，恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}主MEF表现出减小的ΔΨ_米ROS生成增加，而星形胶质细胞和神经元的CI依赖性ATP合成能力降低。此外，恩杜夫斯4^飞/飞初级MEF（而非星形胶质细胞）对半乳糖的维持平均更敏感，ΔΨ的进一步去极化证明了这一点_米ATP合成相应下降。所有这些过程都有可能影响细胞死亡的启动[41]. 因此，我们检测了恩杜夫4^飞/飞原代细胞。这些调查表明恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF(图6A、，6C和6E） 但不是星形胶质细胞(图6B、，6D和6F） ，对细胞死亡更敏感（有关活细胞分析的统计数据，请参阅补充表S1）。然而，这种对细胞死亡敏感性的增加仅见于恩杜夫斯4^飞/飞在应用急性应激源H后，长时间使用半乳糖维持原发性MEF₂O（运行）₂分析时死亡细胞的百分比不仅增加了(图6A；1.8倍+/+），但进入坏死细胞死亡的活细胞百分比增加(图6E；13次+/+）。与…对比恩杜夫斯4^飞/飞初级MEF，恩杜夫斯4^飞/飞星形胶质细胞(图6B、，6D和6F） 在所有测试的培养条件下，与+/+相比，对细胞死亡的敏感性没有明显变化。

人们普遍认为，由于不同的细胞和组织类型使用不同的能量需求和代谢途径，OXPHOS突变可能导致细胞特异性效应[9,42]. 在这里，我们试图通过分析神经和非神经原代细胞类型的线粒体功能来进一步描述这一点恩杜夫斯4^飞/飞模拟LS方面的小鼠模型[12]. 同时，我们使用培养条件（半乳糖）强制恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF和星形胶质细胞较少依赖糖酵解ATP生成，更多依赖OXPHOS相关ATP生成，以强调任何潜在的线粒体缺陷。特别是星形胶质细胞已被证明对呼吸抑制有上调糖酵解的反应[43,44]. 本研究对来自同一OXPHOS缺乏动物模型的原代细胞、恩杜夫斯4^飞/飞鼠标。此外，它还包括对线粒体CI缺乏哺乳动物模型中星形胶质细胞的首次综合分析之一。

恩杜夫斯4^飞/飞MEF被选为对照非神经细胞类型，因为OXPHOS缺陷患者成纤维细胞是我们目前关于线粒体疾病细胞生物化学知识的来源[45]. 标准培养条件下的生化剖面恩杜夫斯4^飞/飞本研究中描述的主要MEF与在NDUFS4缺乏的人和小鼠成纤维细胞模型系统中进行的研究密切相关。值得注意的是，CI活性降低，CI组装受损，ΔΨ_米轻微去极化，ROS生成通常增加[15–17,46,47]. 这些数据表明，疾病的发病机制可能部分源于ΔΨ受损_米，对维持基本细胞功能至关重要，如ATP合成、线粒体蛋白输入、细胞钙²⁺同型性，最终细胞存活。此外，活性氧还与疾病进展有关，导致细胞结构氧化损伤。然而，由于LS主要是一种神经系统疾病，因此成纤维细胞不适合研究神经病理学的机制。

然后我们发现恩杜夫斯4^飞/飞初级MEF和神经相关的星形胶质细胞和神经元不同。也就是说，尽管有神经和非神经恩杜夫4^飞/飞初级细胞类型表现为CI活性降低和CI形成中断，对线粒体功能的影响不同。特别地，恩杜夫斯4^飞/飞初级星形胶质细胞和神经元的ΔΨ非常正常_米在标准培养条件下。尽管如此，我们的数据表明，CI-依赖型ATP合成速率恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞和神经元减少，与之前的脑研究类似恩杜夫斯4^飞/飞小鼠还报告CI依赖性ATP合成减少（+/+的65%）[12]. 这与恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF，可能指ΔΨ的维护_米作为自适应响应恩杜夫斯4^飞/飞神经细胞类型可以防止细胞死亡。这种反应可能是由于心血管活动的调节，可能是通过改变IF的水平₁调节蛋白[48]或复合体的反向作用[49,50]. 值得注意的是，虽然我们已经报道了ATP合成的最大速率，但ΔΨ_米在稳态条件下进行监测。此外，与其他类型的细胞相比，神经元本身可能对CI活性的破坏更为敏感，我们的结果表明，与星形胶质细胞和MEF相比，神经元相对于线粒体体积和/或数量而言，CI容量降低。

此外，虽然活性氧生成增加是NDUFS4缺陷患者和小鼠成纤维细胞的特征[17,46]，在我们的恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞，也不是之前描述的NDUFS4缺陷中脑神经元[20,21]. 先前的细胞研究表明CI抑制程度与ROS生成水平之间存在相关性[18,51]. 相反，我们观察到来自同一小鼠模型的不同细胞类型与相同CI抑制水平之间ROS生成的差异。这种差异可能部分归因于细胞抗氧化剂的不同水平，例如在神经元和星形胶质细胞中观察到的谷胱甘肽减少[52,53]. 这再次强调了在适当细胞中研究这些参数的致病相关性。同时，应该注意到恩杜夫4^飞/飞添加鱼藤酮后，初级MEF和星形胶质细胞的ROS生成量增加较小。这可能反映了对NDUFS4丢失和观察到的不稳定CI的适应在体外在这些细胞中，CI-缺乏细胞中ROS生成的基本速率比+/+细胞更接近最大速率。

尽管如此，在大脑中观察到氧化损伤恩杜夫斯4KO小鼠[13]. 虽然氧化损伤可能是导致疾病的主要因素，但活性氧的来源可能是受影响细胞类型的外部因素。卡瓦纳和哈丁[7]提示LS患者神经组织的氧化损伤是由pH值变化对神经血管系统的影响（高乳酸血症）介导的。此外，由于代谢活动的高速度，这些pH值的变化在大脑的局部水平上可能更加明显[7,54]. 结合哺乳动物大脑的高氧环境，条件可能有助于催化活性氧的形成，从而介导受影响大脑区域的氧化损伤[7]. 另外，脑中的氧化损伤可能是由胶质增生引起的，胶质增生是包括星形胶质细胞在内的活化胶质细胞的浸润。神经胶质增生是LS的一个特征[7,8]，也在恩杜夫斯4KO小鼠[13,14]. 这些活化的胶质细胞可能释放促炎细胞因子，进一步向受影响的大脑区域招募免疫细胞，产生活性氧爆发并导致氧化损伤[7,13,14,55]. 此外，星形胶质细胞的异常激活可能通过促进炎症、形成疤痕和阻止神经元轴突再生而导致组织损伤[55,56]. 事实上，在线粒体疾病的神经相关模型中观察到的ROS生成和氧化损伤之间几乎没有什么例外[9].

这项研究还发现证据表明，来自泛喹诺酮（QH）的电子₂)在CII处琥珀酸氧化生成的产物可以正向转移到CIII，反向转移到CI（RET）[38,57]. CII依赖型ATP合成速率的效率提高和H₂O（运行）₂当在CI抑制剂鱼藤酮存在下测量时，产量。值得注意的是，神经元的这种趋势似乎比原代MEF或星形胶质细胞更为明显，并且在恩杜夫斯4^飞/飞原代细胞与对照组相比。尽管RET诱导的氧化还原平衡变化或ROS生成可能影响细胞信号传导，但这种现象与疾病的生理相关性尚不清楚。因此，令人感兴趣的是，神经元的RET比率高于其他细胞。尽管如此，由于这些实验测量了最大活动率，它们可能没有反映出体内系统活动。此外，与体内CI衬底可能影响通过CI的正向电子传输的环境。

当用半乳糖代替葡萄糖生长时，以迫使氧磷依赖性呼吸，恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}原代MEF再次表型偏离星形胶质细胞。While期间恩杜夫斯4^飞/飞主MEF通过进一步去极化其ΔΨ来响应_米CI依赖型ATP合成能力相应降低，恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞的反应与在标准培养条件下维持时没有差异。此外，恩杜夫斯4^飞/飞半乳糖的初级MEF增加了细胞死亡的倾向，而恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞则不然。这表明恩杜夫斯4^飞/飞初级MEF的OXPHOS储备能力不足，无法适应半乳糖的维持。相反，恩杜夫4^飞/飞星形胶质细胞可能有更大的备用氧磷容量，或者能够更容易地降低其代谢需求，从而优先维持其ΔΨ_米然而，这种差异仅在急性应用H时才显著₂O（运行）₂，这可能再次表明了这两种细胞类型中抗氧化防御系统的潜在差异，而这两种类型的细胞在本研究中并未进行研究。

恩杜夫斯4^飞/飞初级神经细胞类型可能优先维持一些线粒体过程，例如ΔΨ_米过度ATP合成，以避免对细胞死亡敏感。这与LS患者所描述的相对神经元保留现象相一致，其特征是保留细胞死亡局部区域的神经元[7,8]. 同样，在CI缺乏患者中观察到月-日5/6ΔΨ_米在休息状态下升高了40%[53]但应用CV抑制剂寡霉素后病情恶化。此外，神经元还具有其他机制来逃避细胞死亡，例如对细胞色素的敏感性降低c（c）-介导的细胞凋亡[58].

考虑到CI-依赖型ATP合成能力恩杜夫斯4^飞/飞星形胶质细胞和神经元大大减少，这些细胞中的能量依赖过程，如产生动作电位的能力，可能会受到损害。同样，这可能会影响星形胶质细胞循环神经元释放的谷氨酰胺和钾作为神经递质的能力，维持血脑屏障并传播动作电位[23,24,56,59]. CI缺乏对星形胶质细胞循环神经元释放的神经递质的能力的影响尤为重要，因为这一过程可能占大脑能量预算的很大一部分，并且可能对ATP缺乏过敏[54].

我们共同证明了这一点恩杜夫斯4^飞/飞与星形胶质细胞和神经元相比，初级MEF对CI缺乏的反应不同，这可能反映出MEF来源的组织的代谢活性低于大脑。此外，在休息时对初级星形胶质细胞和神经元进行测量，尚待确定受刺激细胞中线粒体功能的强健程度。最终，这些结果强调了研究相关细胞和组织疾病机制的必要性，因为对不太相关的样本（如成纤维细胞）的研究可能会产生误导。

BN-页码

蓝色本机-PAGE

CI–简历

复合物I–复合物V

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个人简历

复数V

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二氢乙炔

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羰基氰化物第页-三氟甲氧基苯腙

H（H）₂O（运行）₂

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哈佛商学院

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小鼠胚胎成纤维细胞

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ROS公司

活性氧物种

ΔΨ_米

线粒体膜电位

以下作者对本研究的概念和设计做出了贡献：Matthew J.Bird；小南·W·维杰耶拉特纳；贾斯珀·C·科门；迈克尔·T·瑞安；David R.Thorburn；和Ann E.Frazier。数据的收集和/或汇编由Matthew J.Bird、Xiaonan W.Wijeyeratne、Adrienne Laskowski和Ann E.Frazier完成。Matthew J.Bird、Xiaonan W.Wijeyeratne、Michael T.Ryan、David R.Thorburn和Ann E.Frazier对数据进行了分析和解释。手稿由马修·J·伯德、贾斯珀·C·科曼、迈克尔·T·瑞恩、大卫·R·托本和安·E·弗雷泽撰写。

我们衷心感谢Tomris Mustafa（Florey神经科学和心理健康研究所）对神经元和星形胶质细胞培养程序的帮助，以及Ian Trounce（澳大利亚眼科研究中心）和Doug Wallace（美国费城儿童医院线粒体和表观基因组医学中心）为ρ°细胞的馈赠。我们还感谢Matthew Burton（澳大利亚默多克儿童研究所）在执行和分析流式细胞术和活细胞成像收集的数据方面提供的帮助。

作者的研究得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）的资助[资助号APP102222]和肌肉营养不良协会（MDA）的资助[资助号MDA113072]，这是NHMRC对David Thorburn的主要研究奖学金[资助号1022896]，Ann Frazier获得NHMRC职业发展奖[授予编号541920]，Matthew Bird获得澳大利亚研究生奖[授予号码APA2011]。澳大利亚线粒体疾病基金会和维多利亚政府的运营基础设施支持计划提供了额外支持。