转运蛋白齐聚：形式和功能

转运蛋白低聚物的形成已经通过一系列方法进行了研究，包括荧光共振能量转移（FRET）[1]，交联[2]，下拉[三]和免疫共沉淀[4]以及生物物理表征，例如使用尺寸隔离色谱-多角度光散射（SEC–MALS）[5]. 虽然这些方法有效地显示了转运蛋白低聚物的形成，但最近使用优势突变体和高分辨率结构研究的研究已经开始揭示低聚物在转运蛋白贩运、功能和功能调节中的确切作用。本综述使用了许多研究特别深入的转运体和转运体家族，简要概述了目前对转运体齐聚作用的理解。还有一些例子表明，高分辨率结构揭示了寡聚物排列中转运蛋白原聚体之间的界面形成了底物结合位点和转运通道。示例包括小型多药转运蛋白EmrE[6]和ABC运输车[7,8]. 在这些情况下，寡聚反应负责为底物结合和转运生成正确的结构。本次审查未涵盖这些运输公司。此外，我们没有包括寡聚化的唯一目的似乎是为了稳定的转运蛋白。

在真核生物中，转运体在通过COPII小泡运输之前在内质网（ER）中组装[9].对于一些膜蛋白来说，原生质体与正确的四元排列的结合似乎是这一贩运过程中的关键质量控制[10]. H似乎也是如此⁺尿酸-黄嘌呤同向转运体，UapA，来自巢状曲霉这需要将单个原单体正确结合成二聚体，以便有效地退出内质网并定位到质膜[5]. TM7中的突变似乎抑制或损害齐聚反应，阻止有效运输到膜并增加周转。UapA的最新结构（见下文）表明，TM7并不直接参与二聚体界面，但该区域的结构变化可能间接抑制二聚体的形成。据报道，寡聚化对一系列其他转运蛋白（尤其是神经递质钠转运体家族）正确转运至质膜的重要性（见下文）。然而，目前尚不清楚为什么低聚物需要在内质网中形成。最合理的解释是，低聚物的排列要求原单体正确折叠，低聚体的形成可能起到质量控制的作用，只允许处于完全折叠状态的蛋白质被运输。有趣的是，在UapA的情况下，TM7突变体与野生型（WT）UapA的共表达可以克服运输受损[5]这表明，至少在这种情况下，WT形式具有显著的积极影响。

此外，还描述了UapA的显性阴性突变体，其有效地运输到膜，但降低了共同表达的WT的运输活性，这强烈表明该转运蛋白也作为二聚体发挥作用(图1a，b) [11]. 一种热稳定形式的UapA的高分辨率结构被困在内层构象中，这进一步揭示了齐聚作用在转运功能中的作用[11]. UapA结晶为密切相关的二聚体(图1c、d)确认了早期的发现[5]. UapA中有许多关键残基参与底物选择性[12——14]. 结构显示，其中一个残基Arg481位于相对原聚体的结合位点附近，它可能充当最后一个检查点，允许有效吸收天然底物、黄嘌呤和尿酸，而不是其他相关分子。侧链的大小在这里可能很重要，因为突变到更小的Gly可以吸收腺嘌呤和次黄嘌呤，而这些底物不是由WT-UapA运输的(图1e、f) [11]. 虽然该结构突显了UapA原聚体在底物选择性方面的相互依赖性，但它并不能解释Q408E突变的主要负面影响。因此，显然还有其他方面的UapA原聚体串扰尚未阐明。有趣的是，在二聚体转运体的大多数晶体结构中，单个原聚体采用相似的构象。一个例外是CitS最近的结构，其中观察到不对称二聚体[15]. 在这种情况下，可以在单个低聚物中看到外向和向内的构象。虽然这种安排似乎是随机的，但很有意思的是，这种安排是否可能是运输周期的一个协调部分。用于结构测定的UapA结构是一个构象锁定突变体；然而，在WT形式中，两个原聚体可能采用不同的构象状态，如CitS所示。迄今为止，没有证据表明CitS二聚体对功能很重要。

UapA的整体结构与阴离子交换器1（AE1）的结构相似[16]. 先前的研究表明AE1形成二聚体[17]这在高分辨率构造中得到了证实。有趣的是，虽然UapA和AE1的作用机制可能非常相似，但二聚体的形成在这两种蛋白质中明显不同。在UapA的情况下，埋地界面为～6000º²，它主要涉及TMs 12、13之间的相互作用以及两个TMs与TM13之间的环路，特别是与相反的原聚体密切相关[11]. 相反，AE1二聚体中的埋藏界面在～1100℃时明显较小²只有TM6的细胞外端和TMs 5和6、6和7、12和13之间的环区参与二聚体的形成[16]. 然而，需要注意的是，相同的亚结构域，即所谓的门结构域，参与了两种蛋白质的二聚化。目前还没有数据支持二聚体在AE1功能中的作用。观察到的寡聚化的结构和功能差异很可能是蛋白质特异性的，即使对于以非常相似的方式运作的转运蛋白也是如此。UapA和AE1蛋白分别为向内和向外构象，这可能是观察到的一些差异的原因。值得注意的是，在钠质子反转运子NapA的情况下，二聚体界面在向内和向外构象的晶体结构中非常相似[18,19]，尽管尚不清楚二聚化是否对该蛋白的功能重要。尽管UapA和AE1二聚体界面之间的差异是由于在每种情况下使用的结晶条件不同和/或AE1结构缺少大的可溶性N末端区域这一事实造成的，但这仍然是可能的。

UapA二聚体的形成在很大程度上是由疏水相互作用介导的，这些疏水相互作用涉及NAT中不太保守的残基。细菌NAT（UraA）的结构被描述为单体，但晶体接触分析表明，原生质体之间存在相互作用。这些导致形成松散的UraA二聚体，并涉及UapA和AE1二聚体界面中所见的蛋白质的类似区域[20]. UraA的相互作用界面比UapA小得多，只涉及TM13的少量残基以及TMs 12和13之间的环[20]. UraA二聚体或NAT家族其他成员的功能意义尚待确定。

神经递质钠同转运体（NSS）家族转运蛋白的寡聚作用已被特别深入地研究。寡聚化已被证明对甘氨酸转运体GlyT2的有效膜转运非常重要[三]和GABA转运体1，GAT-1[21]. 也有许多研究揭示了低聚化在直接转运功能中的关键作用。人类多巴胺转运体（DAT）的显性阴性突变体已被证明降低了共同表达的WT转运体的功能，而对向质膜的转运没有任何影响[22]. 进一步的功能研究支持DAT寡聚体中单个原聚体之间的合作性或串扰[23]. 这种串扰的其他支持性证据来自对血清素转运体（SERT）与GAT-1融合蛋白的研究[24]. 5-羟色胺通过异寡聚体排列中的SERT，抑制GABA通过GAT-1的转运。此外，仅针对SERT的苯丙胺类似物的运输增加了GABA的出口[24]. 这些研究强烈暗示，一个原单体的活性可以影响相关分子的活性。

没有与NSS转运蛋白齐聚相关的明确结构基序。位于TM2的亮氨酸拉链基序被认为是两种DAT齐聚的关键[22]和GAT-1[21]. 几项研究表明GXXXG基序在整合膜蛋白二聚化中的重要性，其中位于跨膜α-螺旋同一侧的两个Gly残基使原聚体紧密堆积[25,26]NSS转运体的TM6中存在这样一个基序。SERT的TMs 11和12中建议了一个额外的低聚物相互作用位点[27].

有趣的是，尽管有大量证据表明DAT和SERT都存在低聚作用[28]到目前为止，晶体结构未能捕获低聚物形式[29——31]. 这可能是因为形成了相对弱关联的低聚物，无法承受结构研究所需的萃取和分离过程的严格性。SLC26家族成员单体形式的最近结构也突出了这一问题，其中寡聚物形式的损失被认为是洗涤剂处理的苛刻性质造成的[32]. 齐聚对SLC26的功能是否重要尚待观察。值得注意的是，所有可用的DAT和SERT结构都是在抗体片段复合物中获得的。抗体-转运体复合物的形成可能会破坏低聚物的相互作用。也许，使用单个原单体融合蛋白的方法可能有助于捕获NSS转运蛋白的寡聚状态。

DAT的单体结构[29,30]和SERT[31]发现Leu拉链基序和GXXXG基序都埋藏在蛋白质核心内，更可能在原单体的结构中发挥作用，而不是在调节齐聚作用中(图2a). 这两个区域中的任何一个发生突变都可能严重扭曲原聚体，使其无法再形成有效的低聚物。TMs 11和12都暴露在表面，它们可能在低聚物形成中起作用(图2a). 事实上，在SERT的结构中，TM12参与了晶体二聚体的形成[31]. 然而，这极不可能代表分子的生理排列，因为一个原聚体与另一个相比基本上是旋转的。这将把其中一个原生质体的可溶环区域放入膜中，这是一种极不可能的安排。TM12可能在与脂质的相互作用中发挥作用，因为在结构中，该蛋白区域与半琥珀酸胆固醇相关[31].

然而，细菌NSS同源物LeuT的二聚体结构是可用的，这表明二聚体是由TM12和TM9a以及来自第二细胞外环的残基介导的[33]. 然而，目前还没有证据表明LeuT具有低聚物的功能。

细菌渗透调节甜菜碱转运蛋白BetP（甜菜碱/胆碱/肉碱家族成员）的研究表明，该蛋白形成稳定的三聚体[34]. 转运体突变体的产生表明，尽管与WT三聚体相比，该蛋白的活性有所降低，但其作为单个原聚体仍具有转运活性[35]. 然而，单体形式不再对渗透压作出反应，这强烈表明三聚体是检测环境变化和激活转运体对这种变化作出反应的关键[35]. 最近的结构进一步强调了三聚体形成中的相互作用可能在与运输循环相关的构象变化中发挥作用[36]. BetP三聚体的两种功能似乎都受到单个原聚体之间形成的离子相互作用的调节[37] (图2b). 有趣的是，如CitS所示，BetP三聚体中的单个原聚体可以采用不同的构象[36].

糖转运蛋白负责单糖和双糖的摄取和分配。利用显性阴性突变体对植物SWEET转运蛋白进行的早期研究强调了寡聚化对功能的重要性[38]. 这些转运蛋白只包含7个跨膜结构域，因此人们认为寡聚化是形成功能性转运单元的关键。然而，同源三聚体甜味剂的最新结构拟南芥表明单个原体形成了易位通道[39]. 进一步的基于结构的研究表明，一个原单体的细胞外或细胞内闸门的功能性非活性突变对相关原单体功能产生了负面影响[39]. 一个原单体中缺乏构象变化可能会抑制相关分子的运动。这些发现强烈地表明，SWEET同源三聚体通过原生质体之间的协同作用发挥作用；然而，其确切的分子基础尚待揭示。

早期对细菌主要促进因子超家族（MFS）转运蛋白LacS的研究首次表明寡聚化可能在转运蛋白功能中发挥作用。生物物理分析表明LacS是一种二聚体[40]. 突变体非功能转运蛋白与功能转运蛋白形式的共表达表明质子依赖性转运所需二聚体的单个原聚体之间的合作[41].

人类质子偶联叶酸转运体的显性阳性突变体已被描述。WT转运体与突变体共表达，突变体有效地运输到膜，但具有转运活性，导致活性水平高于单独表达WT[1]. 事实上，观察到的活性水平与两种不同标记形式的WT转运体的共表达水平相似。这表明活性WT能够通过不同转运蛋白原体的直接结合恢复非活性突变体的转运活性，这是一种显性的积极作用[1].

对植物磷酸转运蛋白Pht1（另一个MFS成员）的研究发现了一个突变，其表达水平和定位与WT相似，但同时减少了寡聚化并增加了转运活性(五_最大值). 这些发现强烈表明，在这种情况下，齐聚作用起着调节作用[42].

还报道了植物硝酸盐转运蛋白NRT1.1的寡聚化依赖性调控，该转运蛋白可作为低亲和力或高亲和力转运系统[43]. NRT1.1的晶体结构显示了该蛋白的二聚体形式(图3) [44,45]. 突变研究表明，与未磷酸化形式相比，Thr101的磷酸化导致稳定性降低和运输活性增加[44]. Sun等人[45]他们进行了实验，表明Thr101的磷酸化诱导低亲和力二聚体分解为高亲和力原聚体(图3). 然而，另一个似是而非的理论是，磷酸化只会导致轻微的结构改变，从而改变亲和力[44]. 对这一理论的支持来自于相关单体肽转运蛋白中等效残基的磷酸模拟突变体的产生欧氏Shewanella oneidensis，佩普_所以这也降低了稳定性，增加了运输活动[44].

植物氨转运蛋白（AMT）是AMT/MEP/Rh转运蛋白家族的成员，也受磷酸化调控。与NRT1.1相比，AMT中C末端残基的磷酸化[46]导致转运体快速失活。最近的证据表明，这些蛋白质可以以同源或异源三聚体的形式存在。WT和一个含有磷酸化模拟氨基酸（Thr到Asp取代）的突变体的共同表达以显性负向方式减少铵的吸收，表明一个原聚体的磷酸化抑制相关非磷酸化原聚体活性[47,48]. Pht1、NRT1.1和AMT中的此类调节机制可能会使植物快速有效地适应不断变化的环境条件。

很明显，低聚是正确定位、功能和调节不同转运蛋白的关键。功能和结构研究的结合在深入了解寡聚物排列中转运蛋白原聚体功能性串扰的分子基础方面特别有效。然而，很明显，我们仅仅触及了许多生物和医学上重要的转运蛋白这一重要特征的确切作用的表面。

AE1型

阴离子交换器1

自动变速箱

铵转运蛋白

运输终端交货

多巴胺转运体

呃

内质网

FRET公司

荧光共振能量转移

服务贸易总协定1

GABA转运蛋白1

MFS公司

主要促进者超家族

国家税务局

核碱抗坏血酸转运体

NSS公司

神经递质钠转运体

SERT公司

血清素转运体

重量

野生型

这项工作得到了生物技术和生物科学研究理事会的支持[赠款BB/K017292/1]。

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

作者感谢Sotiris Amillis博士在生成图1.