埃博拉病毒核衣壳组装机制透视：1.8°分辨率埃博拉核蛋白核心结构域的晶体结构

摘要

埃博拉病毒（EBOV）是丝状病毒科家庭和引起严重人类传染病的高发病率和死亡率。EBOV是一种典型的负义单链RNA（−ssRNA）病毒，它具有核衣壳蛋白（NP），可促进基因组RNA的包被，与基因组RNA和聚合酶一起形成病毒核糖核蛋白复合物（RNP），在病毒增殖周期中起着最重要的作用。然而，EBOV RNP的形成机制尚不清楚。在这项工作中，我们解决了EBOV NP核心结构域的高分辨率结构_核心)具有一个N叶和C叶来钳制RNA结合沟，与其他被报道的由来自单核糖核酸订单。最引人注目的是，C叶表面的疏水囊被EBOV NP的α螺旋占据_核心它在丝状病毒科家庭。结合其他生化和生物物理证据，我们的结果为通过EBOV NP元件的流动性来理解EBOV RNP形成的潜在机制提供了巨大的潜力，并有助于开发针对EBOV RNA形成的抗病毒疗法。

介绍

丝状病毒家族成员，包括埃博拉病毒（EBOV）、马尔堡病毒（MARV）和洛维病毒（LLOV）（Kuhn等人。，2010)导致人类高致死性出血热，发病率和死亡率极高。EBOV通常出现在中非，但2014年在西非再次合并，导致全球范围的疫情蔓延。截至2015年4月，共报告25591例疑似病例和10602例死亡病例(http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/2014-west-africa/case-counts.html). 虽然已发现几种化学试剂、抗体和疫苗可抑制动物或人类的EBOV，但目前尚无高效的治疗药物可用于临床。

EBOV是一种典型的非片段负义单链RNA（−ssRNA）病毒（Muhlberger等人。，1999). EBOV的单链RNA基因组编码表面糖蛋白（GP）、一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、一个核衣壳蛋白（NP）以及病毒蛋白（VP）35、VP40、VP30和VP24（Muhlberger等人。，1999). 与其他−ssRNA病毒类似，EBOV的RNA基因组不能以裸露的形式存在，但必须被NP包裹，并与RdRp一起进一步形成核糖核蛋白（RNP）复合物（Sun等人。，2012; Zhou等人。，2013). 通过糖蛋白介导的膜融合进入细胞质后，RNP从病毒粒子中释放出来，作为模板，共包装的RdRp从RNP中的病毒基因组转录mRNAs。在病毒复制的后期，以RNP的形式产生互补阳性序列RNA（cRNA）。RNP作为复制的模板，以RNP的形式生成病毒基因组RNA，准备包装在病毒体内。在−ssRNA病毒的整个病毒复制周期中，基因组长度的病毒RNA（cRNA或病毒基因组RNA）仅以RNP的形式存在，RNP要么作为RNA合成的模板，要么包装在病毒中。因此，RNP的形成和正确功能对于−ssRNA病毒的增殖至关重要（Sun等人。，2012; Zhou等人。，2013; Ruigrok等人。，2011).

通过研究包括博尔纳病病毒（BDV）在内的非片段化−ssRNA病毒RNP，启动了−ssRNA病毒RNP的结构知识（Rudolph等人。，2003)，狂犬病病毒（Albertini等人。，2006)，水泡性口炎病毒（VSV）（Green等人。，2006)和呼吸道合胞病毒（RSV）（Tawar等人。，2009)最近对片段化−ssRNA病毒（包括沙粒病毒）的研究大大增强了这一知识（Hastie等人。，2011年a，b条; Qi等人。，2011)，布尼亚病毒（Dong等人。，2013; Ferron等人。，2011; 郭等人。，2012; Jiao等人。，2013; Li等人。，2013; Niu等人。，2013; 雷蒙德等人。，2010)和流感病毒（Ng等人。，2008; Ye等人。，2006; Arranz等人。，2013; Chenavas等人。，2013; Moeller等人。，2013). 此外，通过电子显微镜观察天然或真实RNP的进展，导致了在分子水平上理解RNP形成的动态过程。特别是，最近的结果清楚地表明，病毒NP可以直接用作抗病毒药物开发的靶点（Gerritz等人。，2011; Kao等人。，2010)因此，在传统抗病毒药物中发现具有抗耐药机制的新型抗病毒药物具有巨大潜力。最近在低温电子显微镜和层析成像方面的工作帮助我们可视化丝状病毒科病毒颗粒和核衣壳的形成（Bharat等人。，2012; Bharat等人。，2011). 然而，EBOV NP的结构细节和EBOV RNP形成的分子机制在很大程度上是未知的。唯一的结构信息是，最近的一项工作确定了EBOV NP的N端和C端域的边界，并解决了C端域跨越残基641–739的晶体结构（Dziubanska等人。，2014). 然而，EBOV NP的C末端结构域并没有暗示该区域的生物学功能。所有这些促使我们开始对EBOV NP进行生化和结构分析，以了解EBOV RNP的形成机制，并探索发现抗EBOV药物的潜在药物靶点。

结果

EBOV NP重组核心结构域的生化分析

先前的研究表明，EBOV NP的N末端截断导致NP-NP相互作用的功能丧失，EBOV-NP的第一个450氨基酸构成核心结构域，足以形成核衣壳样结构和病毒基因组复制（Watanabe等人。，2006). 然而，由于寡聚和沉淀的倾向，以前大多数以结构研究为目的的表达和纯化工作都失败了。为了筛选出适合EBOV NP核心结构域晶体学工作的最佳结构，我们生成了一系列截断和突变结构。即使在超高离子强度条件下，所有含有EBOV NP前30个氨基酸的结构物也会导致高度的齐聚和沉淀倾向。

表达量和生化特性最高的最佳构建物覆盖了EBOV NP（命名为NP）残基36–351的区域_核心下文）。此外，该区域不仅在不同的EBOV株中高度保守，而且在马尔堡病毒和洛维乌病毒中也高度保守，这两种病毒是丝状病毒科家庭。特别是，该区域被发现同时发挥RNA结合和NP低聚的功能，形成高阶RNP。因此，我们对该NP进行了进一步的晶体学和生物化学研究_核心区域。

由于结合RNA和寡聚是病毒编码NP的两个关键特征，我们进一步分析了EOBV NP的溶液性质_核心EBOV NP_核心表示为大肠杆菌并在生理条件下进行纯化。重组EBOV NP的保留体积_核心尺寸排除色谱中的蛋白质在16 mL时达到峰值（图。1A） 对应于35 kDa的分子量。SDS-PAGE分析表明，主峰包含一个EBOV NP预期大小的蛋白质_核心，而A₂₈₀/A类₂₆₀紫外线吸收比为1.6表明没有核酸与EBOV NP结合_核心（图。1A） ●●●●。这些结果表明，重组EBOV NP_核心在溶液中以单体状态存在，不含从表达宿主细胞获得的核酸。

EBOV NP的总体结构_核心

EBOV NP_核心成功结晶，随后使用单波长反常色散（SAD）方法确定晶体结构，并将其细化至1.8º的高分辨率，最终R（右）_工作19.2%(R（右）_自由的=22.3%）（表1).

在EBOV NP结构中_核心，在晶体不对称单元中观察到一个分子。进一步分析表明，分子内相互作用与晶体堆积有关，单体应为生物单元。EBOV NP的所有残留物_核心多肽被构建到最终模型中，除了三个短间隙（残基A123–S126、E139–T143、K257–R263）和一个覆盖A326–V334的环区域由于缺乏可解释的电子密度而无法追踪，这表明了它们的内在结构灵活性（图。1B） ●●●●。

EBOV NP的结构_核心提出了病毒NP家族中的一种新的蛋白质折叠，并显示了一个紧凑的结构，其尺寸约为53？？40？？75。EBOV NP公司_核心由两个相对独立的部分组成，一个N瓣（V36–R240）和一个C瓣（F241–E351）（图。1B和1C） ●●●●。这两个结构域都主要由α螺旋组成，其中N叶由十三个α螺旋和两个β链组成，C叶由七个α螺旋组成（图。1B和1D） ●●●●。与大多数病毒编码的NP类似，N和C叶钳制一个带高正电荷的凹槽来包裹病毒RNA。

EBOV NP的RNA结合沟_核心

A区₂₈₀/A类₂₆₀EBOV NP比率_核心约为1.6，表明在EBOV NP的表达和纯化过程中未发生RNA结合_核心（图。1A） ●●●●。在一致性方面，在EBOV NP表面没有观察到连续的核酸电子密度_核心。

然而，EBOV NP分子表面的高度带正电的口袋_核心协调对RNA结合位点的调查（图。2). EBOV NP结构中有两个正电荷区_核心一个大的和一个小的。主要的正电荷缝隙位于N瓣和C瓣的界面，其中K160、K171、R174和K248贡献了最基本的正电荷。另外一个次要的正电荷区域与主要缝隙相邻，由R205、K211和R298组成。已知带正电荷的残基（包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基）与核酸的核糖和磷酸部分相互作用，从而主导病毒NP的RNA包被过程（Albertini等人。，2006; Green等人。，2006; Hastie等人。，2011; 郭等人。，2012; Li等人。，2013; Ariza等人。，2013; 雷蒙德等人。，2012; Reguera等人。，2013). 与EBOV NP主槽的结构观察结果一致_核心，之前的工作已经证明，这些基本残基的缺失或丙氨酸残基的取代显著削弱了EBOV NP或EBOV复制的RNA结合亲和力（Muhlberger等人。，1999; Watanabe等人。，2006; Noda等人。，2010; Huang等人。，2002; Leung等人。，2015). 综上所述，这些结构和生物化学证据表明，EBOV NP的RNA结合沟位于N和C叶的界面，并证明了关键碱基残基对RNA结合和EBOV增殖的重要作用。

EBOV NP的结构比较_核心其他NP在单核糖核酸

DALI（Holm和Rosenstrom，2010)和SSM（Krissinel和Henrick，2004)分析显示EBOV NP_核心呈现出与由以下成员编码的病毒NP的结构相似性单核糖核酸订单，包括RSV（Tawar等人。，2009)、副流感病毒5型（PIV-5）（PDB代码：4XJN）和尼帕病毒（NiV）（Yabukarski等人。，2014)等。EBOV NP的校准_核心对于RSV NP结构，375个对齐残基的所有Cα原子的总平方根偏差（r.m.s.d.）为4.4º，而对于395个残基，与PIV5 NP的对齐的平方根偏差为4.2º，对于330个残基而言，NiV NP的平方根差为3.6º（图。三A） ●●●●。

不仅RSV、PIV-5和NiV的NP单核糖核酸尽管初级序列同源性较低，但NP显示出类似的拓扑结构。所有这些NP都包括一个N叶和一个C叶，用于钳制界面上的RNA结合位点。然而，病毒核蛋白所形成的RNP是可变的。最显著的区别是，在狂犬病病毒的NP-RNA颗粒的内侧发现了连续的核酸链（Albertini等人。，2006)和VSV（Green等人。，2006)但结合的RNA暴露在RSV的NP-RNA颗粒的外侧（Tawar等人。，2009)和PIV5 NP。根据EBOV NP的结构同源性_核心根据RSV和PIV5编码的NPs，我们推测EBOV NP的RNA结合位置应该采用相同的模式。值得注意的是，除了核心结构域之外，EBOV NP还包含一个非保守区域和一个近200氨基酸长度的C末端尾部，这表明EBOV NP可能具有RNA结合和寡聚以外的其他生物功能，以形成高序RNP。实际上，理解病毒编码的NP的一个突破是拉沙热病毒（LASV）（Hastie等人。，2011; Qi等人。，2011)和克里米亚-刚果出血热（CCHFV）（Guo等人。，2012)NP确实具有酶活性。这表明有必要进一步分析EBOV NP的延伸部分，以剖析其确切的生物学作用。

EBOV NP中的Helix-20_核心表示一个基本的疏水袋

−ssRNA RNP功能的关键步骤是NP释放封装的RNA并将RNA转移到RdRp的催化中心进行聚合酶反应。VSV最新作品（Green和Luo，2009)，NiV（Yabukarski等人。，2014)和沙粒病毒（Kranzusch和Whelan，2011)揭示了调节这一关键过程的几个关键协同因素或伴侣。例如，磷酸蛋白（P）被证明是VSV RNP形成的关键调节因子，P的C末端结构域主要与NP-RNA颗粒内VSV NP的C叶结合（Green和Luo，2009). 此外，在NiV NP-P复合物的结构中，来自P的肽被确定位于一个疏水缝隙，通过抑制病毒RNP的形成保护宿主细胞免受病毒复制（Yabukarski等人。，2014). 有趣的是，EBOV NP的叠加_核心与NiV NP-P复合表明存在类似的疏水囊（图。4A） ●●●●。该疏水囊位于EBOV NP的C叶上_核心，靠近RNA结合槽（图。4A） ●●●●。

在EBOV NP中_核心，疏水口袋由螺旋-14、螺旋-15和螺旋-19组成，许多疏水残基有助于形成该口袋，包括V247、V250、I254、L255、L264、A268、V273、V277、F280、L284、L287和L316（图。1D和4C） ●●●●。然而，NiV NP中的P蛋白占据了这个疏水口袋，而EBOV NP则被由N325到E351残基组成的螺旋-20调节_核心五种疏水残基，即V336、Y340、L343、A346和A347，稳定了螺旋-20与C叶疏水囊之间的相互作用。

接下来，我们研究了这种疏水囊在丝状病毒科家庭。五株埃博拉病毒（株扎伊尔，UniProt O72142；苏丹，UniProt Q5XX08；本迪布焦，UniProt B8XCM7；泰山森林，UniProt B8XCN6；和雷斯顿，UniProt Q8JPY1），五株马尔堡病毒（株安哥拉/2005，UniProt Q1PD53；Ozolin公司/1975，UniProt Q6UY69；波普/1967，UniProt P35263；拉文/1987，UniProt Q1PDD0；和穆索克/1980UniProt P27588）和一株Lloviu cuevavirus（株阿斯图里亚斯·巴特86/2003，UniProt G8EFI1）对齐（图。4D） ●●●●。构成囊袋的所有疏水残基在所有给定菌株中都具有高度保守性，这表明该科不同属RNP形成的保守结构，以及该疏水囊袋功能的关键重要性。

讨论

过去十年的结构研究导致了对−ssRNA病毒编码的NP的理解（Sun等人。，2012; Zhou等人。，2013). 虽然这些NP具有很大的变化，但它们的结构可以分为两个拓扑组。第一组包括大多数−ssRNA病毒NP，包括来自博尔纳病毒科家族（Rudolph等人。，2003)、VSV和狂犬病病毒疟原虫科家族（Albertini等人。，2006; Green等人。，2006)，来自的回复副粘病毒科家族（Tawar等人。，2009)，流感病毒来自正粘病毒科家族（Ye等人。，2006)裂谷热病毒(静脉病毒属）（Raymond等人。，2010)，和Bunyamwera病毒（BUNV）(布尼亚病毒属属）（Li等人。，2013)在布尼亚病毒科家庭。尽管它们的详细结构不同，但I类NP具有一个通用的N和C叶，它们面对面形成正电荷缝隙，用于RNA结合，但使用不同的结构成分进行蛋白质间相互作用（Sun等人。，2012). II类NP包括LAFV(沙粒病毒科家族）（Hastie等人。，2011年a，b条; Qi等人。，2011)和CCHFV(奈罗病毒属，布尼亚病毒科（Guo等人。，2012). 尽管LAFV和CCHFV属于不同的病毒家族，并且发现它们的NP具有额外的生物学功能，但基因组包被的结构区域高度相似。根据结构拓扑，EBOV NP的结构_核心属于I类病毒NP。然而，EBOV NP从核心结构域延伸到末端，包括一个非保守区域和大约200个氨基酸长度的C末端次要结构域，这将EBOV NP与其他I类病毒NP区分开来。实际上丝状病毒科与具有高度相似性副粘病毒科家族中的前450个氨基酸，但对C末端区域显示出自己的特异性。该延伸部分的确切生物学功能值得进一步研究。

虽然已知NP是−ssRNA病毒在其增殖周期中编码的最稳定的蛋白质之一，但在多种病毒物种的不同阶段可以观察到显著的结构变化（Zhou等人。，2013). 最重要的结果是从静脉病毒编码的NP的结构中获得的。通过单体形式的变性/复性方法纯化的第一个RVFV NP显示出一种新的紧凑结构，该结构缺乏用于RNA结合的带正电缝隙，并且没有用于NP齐聚的突出部分（Raymond等人。，2010). 然而，Ferron等人在生理条件下使用了不同的纯化方法来解决RVFV NP的六聚体结构，该结构具有作为RNA-结合位点的高正电荷内周长（Ferron et al。，2011). 虽然通过不同纯化方法获得的两种结构的身体区域是相同的，但在N末端臂（N臂）处出现了显著的构象差异。N-臂的不同位置反映了RNP形成过程中的结构灵活性，其中单体结构可能代表低聚和与RNA结合之前的“等待”构象（Ferron等人。，2011). 随后，Raymond等人报道了RVFV和Toscana病毒的NP-RNA复合物的结构静脉病毒四聚体、五聚体和六聚体形式的属（图。三D） （雷蒙德等人。，2012). 这些结构证实，高度灵活的N臂介导了NP原生质体之间的接触，这是RNP形成的原因（Raymond等人。，2012). 这种单体构建块和低聚物形成过程中NP-NP相互作用的灵活性允许RVFV RNP堆积成具有更高结构和密度的病毒颗粒（Raymond等人。，2012). 所有这些结果表明，病毒NP的成分在病毒生命周期的不同阶段可能发生结构变化，以促进RNA结合或进一步寡聚形成RNP。Leung等人报告了一种EBOV NP结构复合物，该复合物含有一个来自VP35的肽，其分辨率为3.7。这两种EBOV NP结构可能是病毒生命周期中构象变化的另一个重要实例（图。5). 在EBOV NP结构中_核心仅在本研究中报道，螺旋-20向EBOV NP C叶界面上的疏水囊折叠并与之相互作用_核心形成一个紧凑的结构。相反，在EBOV NP的结构中_核心在与VP35肽的复合物中，Helix-20与Helix-21一起转移到EBOV NP C叶的另一侧_核心（Leung等人。，2015)（图。5B） ●●●●。因为EBOV VP35肽（NPBP，残基20-48）以高亲和力和特异性结合NP，抑制NP齐聚，并从NP-RNA复合物中释放RNA在体外，该结构可能代表RdRp中病毒RNA合成开始前的过渡状态。我们建议EBOV NP_核心我们报告的结构是EBOV NP从宿主核糖体转化后的原始状态，该核糖体保持在N⁰阶段，准备与新生RNA结合并形成RNP。

实际上，这种过渡状态与VSV复制中磷酸蛋白（P）的功能非常相似（Green和Luo，2009). P蛋白是VSV RNP的重要辅因子。在VSV RNP-like particle（NP-RNA complex）与P的C末端结构域复合物的结构中，P主要与核衣壳内两个相邻N蛋白的C末端叶结合，与RNA空腔的接近性表明，P蛋白结合影响VSV NP的RNA包被，并使L蛋白定向进入无NP的RNA-模板（Green和Luo，2009). 尽管VSV的P和EBOV的VP35-NPBP都可以调节NPs对RNA的包被，但它们之间仍存在显著差异。首先，尽管P蛋白与VSV RNP样颗粒结合，但VSV NP仍能与RNA结合，这表明P与NP的相互作用不能直接诱导VSV中RNA的释放。然而，EBOV VP35-NPBP可以直接竞争性地抑制RNA与EBOV NP的结合。此外，在P蛋白结合过程中，VSV中的NP组分没有明显的结构变化，但EBOV NP中的Helix-20随着VP35-NBP的相互作用而发生显著的重构。所有这些差异表明，从EBOV NP的原始状态到RNA合成前的过渡状态，可能存在其他几种结构。这需要进一步的结构和生物学验证，例如与RNA结合的EBOV核蛋白的复杂结构。

由于正确的RNP形成和功能是−ssRNA病毒复制、转录和组装的关键步骤，可以想象，阻断这一过程将为抗病毒药物的开发提供巨大潜力。在过去几年里，基于这一新的抗病毒策略，特别是针对流感病毒的抗病毒战略，取得了很大进展。通过一种化学遗传方法，Kao等人首次确定流感病毒NP是一种药物靶点（Kao等人。，2010). 他们报告称，核苷是一种小分子化合物，可触发聚集并抑制NP的核积累，在纳米中位数有效浓度（EC）下可抑制流感病毒的复制₅₀)（Kao等人。，2010). 在一项平行的研究中，Gerritz等人发现了一系列流感复制抑制剂，并表明它们通过与EC形成高阶NP低聚物来干扰NP依赖过程₅₀高达60 nmol/L（Gerritz等人。，2011). 值得注意的是，NP与这些抑制剂的代表性化合物的复合物结构表明，两个逆平行方向的抑制剂锁定了两个相邻的NP原聚体。这种意料之外的四元复合物通过配体诱导形成稳定的NP低聚物解释了病毒抑制作用（Gerritz等人。，2011). 这些结果累积证明，靶向病毒RNP的形成是开发小分子疗法的有效目标，以对抗针对表面蛋白的现有药物的病毒耐药性。在这里，我们报告了这项工作中一个独特的疏水口袋，它显示出在所有病毒中高度保守丝状病毒科因此，EBOV NP的结构不仅有助于了解由−ssRNA病毒编码的NP之间的结构和功能差异，而且有助于开发抗EBOV感染的抗病毒疗法。

材料和方法

蛋白质生产

基因扎伊尔埃博拉夫病毒将核蛋白（残基36-351）克隆到pET-21d表达载体中Nco公司我和Xho公司I位点遵循通用方案，引物序列为：正向，5′-CCCCATGGCTGTGTCGGCAAGAGTCATC-3′，反向，5′-CCCTCGAGCTCAGCTCAGGTGCCCTC-3′。通过测序验证插入物的准确性。

EBOV NP重组质粒_核心被转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）并以6×His标签的形式过度表达，在C末端融合蛋白。细胞在37°C下在含有100μg/mL氨苄西林的800 mL LB培养基中培养。一次OD₆₀₀达到0.6时，将培养物转移到16°C，并通过与0.25 mmol/L异丙基-β-D-1硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）再孵育18小时来诱导蛋白质。将收获的细胞重悬于裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.5）中并使用低温超高压电池破碎机（中国JNBIO）进行均质。以25000×克在4°C下放置30分钟以清除细胞碎片。然后将上清液两次加载到用裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA柱上。用60mL洗涤缓冲液（20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl、25mmol/L咪唑，pH 8.5）洗涤树脂四次，并用30mL补充有1mol/L咪唑的洗涤缓冲液洗脱。在Superdex-200（GE Healthcare）柱上进一步纯化该蛋白，该柱与含有20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L-NaCl、5 mmol/L-DTT、pH 8.5的缓冲液平衡。SDS-PAGE分析显示最终纯化的重组蛋白纯度超过95%。将单个主峰的馏分合并并浓缩至6 mg/mL进行结晶。纯化EBOV NP_核心根据SDS-PAGE分析，纯度>95%，且为A₂₈₀/A类₂₆₀比率为1.6。将纯化蛋白浓缩至10 mg/mL并在193 K下储存。

EBOV NP的硒代蛋氨酸（SeMet）衍生物_核心是在蛋氨酸辅助营养中产生的大肠杆菌菌株B834（DE3）在添加3%葡萄糖、30 mg/L L-硒代蛋氨酸和100μg/mL氨苄西林的最小培养基中生长。当OD₆₀₀达到0.6时，将培养物转移至16℃，再加入30 mg/L L-硒蛋氨酸。用0.25 mmol/L IPTG再孵育24 h，诱导产生蛋白质。SeMet取代EBOV NP_核心在与野生型蛋白相同的条件下纯化。

结晶

通过在16°C下筛选商用晶体筛选试剂盒（包括汉普顿研究公司的Index、crystal Screen、PEG/Ion、Salt/RX、Natrix、crystal-Screen Lite和crystal Screen cryoc），以96-well的格式进行初始结晶试验，使用孔液与蛋白质的1:1比例（5.5 mg/mL）。EBOV NP的小晶体_核心第一次出现在200 mmol/L柠檬酸铵（pH 7.0和20%）中一天后(w个/v（v）)PEG3350。

使用添加剂和洗涤剂筛网进行进一步优化（Hampton Research），最终优化结晶条件为200 mmol/L柠檬酸铵三元pH 7.5和18%(w个/v（v）)PEG3350。在16°C下，立方晶体在三天内生长到最终尺寸为40μm×40μm x 60μm。采集晶体并在含有30%的井液中进行保护(w个/v（v）)PEG3350并在100 K干燥氮气流中冷却，用于X射线数据采集。赛美特EBOV NP_核心晶体是在相同的条件下生长的。

X射线数据采集、处理和结构测定

所有晶体逐渐转移到含有相应沉淀剂溶液和5%的采集溶液中(v（v）/v（v）)甘油在液氮中快速冷冻储存。数据是在100 K低温条件下收集的。EBOV NP的硒代蛋氨酸SAD数据集_核心使用与SSRF（中国上海）光束线BL19U处Se峰值相对应的波长在2.4º处采集，另一个本地数据集在1.8º处收集。所有数据集均使用HKL-3000软件包进行处理（Minor等人。，2006). 这些晶体属于太空小组第2页₁2₁2带有单元格参数一=59.8Å，b条= 162.9 Å,c（c）=31.3奥，以及α=β=γ=90°。排除每种多肽的第一个硒，定位并精炼不对称单元中的7个硒原子中的6个，并通过使用PHENIX程序进行溶剂压平计算和大幅改进SAD数据相（Adams等人。，2002). 使用COOT（Emsley和Cowtan，2004)并在PHENIX中进一步精炼。使用程序MolProbity（Lovell等人。，2003). 表中总结了最终的细化统计数据1使用PyMOL（DeLano，2002).

接入码

坐标和结构因子已按照加入代码4Z9P存放在RCSB。提交人声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

我们非常感谢张荣光博士和中国SSRF BL19U的其他工作人员对衍射数据收集的帮助。这项工作得到了国家基础研究计划（973计划）（2014CB542800和2013CB911103）、国家重大科技专项“重大新药开发”（2013ZX09301306）、国家自然科学基金（31300606和81322023）的支持天津市自然科学基金（14JCQNJC10100）。

遵守道德准则

董世上、杨鹏、李国邦、刘保成、王文明、刘翔、夏伯兰、杨成、卢志勇、于过和饶子河声明，他们没有利益冲突。

本文不包含任何作者对人类或动物受试者进行的任何研究。

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