人牙周韧带源性干细胞促进视神经损伤后视网膜神经节细胞存活和轴突再生

A类抽象的

在发达国家，视神经病变是导致不可逆转失明和视力损害的主要原因，影响着全球8000多万人。虽然大多数视神经病变没有有效的治疗方法，但对视网膜神经节细胞（RGC）的保护和轴突再生有深入的研究。我们之前证明了人牙周韧带源性干细胞（PDLSCs）用于视网膜细胞置换的潜力。在这里，我们报道了人类PDLSC的神经保护作用，以改善视神经挤压（ONC）损伤后RGC变性并促进轴突再生。在体内ONC后，将人PDLSC玻璃体内注射到成年Fischer大鼠的玻璃体腔中，并在体外与视网膜移植体共培养。人PDLSCs在玻璃体腔中存活，即使在ONC后3周仍保留在RGC层。βIII-管蛋白和Gap43的免疫荧光分析表明，人PDLSC移植大鼠存活RGC和再生轴突的数量显著增加。体外共培养实验证实，PDLSCs可以提高视网膜外植体中RGC的存活率和轴突再生，而不会引起炎症反应。人类PDLSC的RGC保护机制是直接细胞间相互作用和脑源性神经营养因子分泌增加，但不促进内源性祖细胞再生。总之，我们的结果揭示了人类PDLSC的神经保护作用，通过在体内和体外强烈促进RGC存活和轴突再生，表明RGC对视神经病变的治疗潜力。

本研究表明，人牙周韧带源性干细胞（PDLSCs）可减少大鼠视神经损伤引起的视网膜神经节细胞（RGC）变性，促进轴突再生。在视网膜外植体培养模型中，人PDLSC还通过PDLSC-RGC的直接相互作用和人PDLSCs分泌的神经营养因子，提高RGC的存活率和幼稚体的生长。

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我介绍

视神经病变是一组严重的病理状况，导致不可逆的视觉损伤甚至失明。它们可能发生在创伤、青光眼、炎症、缺血或肿瘤压迫中。常见的病理学是视神经（ON）损伤后几天内成熟RGC凋亡，受损的轴突无法再生并延伸到损伤部位远端富含髓磷脂的环境中[1]。再生失败部分归因于视网膜固有再生能力低、髓磷脂相关抑制剂的存在、损伤部位瘢痕的形成[2,三]以及缺乏适当的营养支持[4]。然而，通过促进RGC生长和调节微环境，可以部分增强RGC再生。据报道，有多种方法可以促进RGC存活和轴突再生，包括补充神经营养因子[5,6]，抑制凋亡途径[7]，抵消与髓磷脂和胶质瘢痕形成相关的抑制信号[8]，删除铂族和社会保障3基因[9]以及联合治疗[10]。已经取得了暂时但有希望的效果，特别是促进损伤部位远端的轴突再生。

干细胞已被研究用于修复视神经病变[11]。不同的干细胞来源，包括胚胎干细胞、少突胶质前体细胞以及骨髓源性和脐血源性间充质干细胞（MSCs），已被评估其促进中枢和外周神经系统神经修复和再生的功效[12-15]。在不同类型的干细胞中，间充质干细胞可以调节受损宿主组织的可塑性，分泌神经营养和促进生存的生长因子，恢复突触递质的释放，融入现有的神经和突触网络，并重新建立功能性的传入和传出连接[16]。此外，MSCs还具有强大的免疫抑制特性，并抑制促炎细胞因子的释放[17]。来自多种来源的MSCs，包括大鼠和小鼠骨髓、脂肪组织、人绒毛膜板和大鼠牙髓，已被证明对on损伤后RGCs具有神经保护作用[18-21]表明MSCs在未来视神经病变中具有潜在的临床应用前景。

我们之前已经证明，来源于人牙周膜（PDL）的干细胞含有95%的MSCs和5%的神经嵴干细胞[22]。人PDL衍生干细胞（PDLSCs）具有细胞替换潜能，可以定向到视网膜谱系，尤其是具有电功能的RGCs[23,24]。除了转分化能力外，我们还旨在探索其神经修复潜力。在这里，我们假设人类PDLSC可以改善ON损伤后RGC变性并促进轴突再生。在本研究中，我们在体内外研究了人PDLSC对on挤压（ONC）后大鼠RGC存活和轴突再生的影响和机制。

M（M）材料和M（M）方法论

人类牙齿采集和PDLSC培养

在汕头大学医学院附属第二医院收集年轻人的恒牙。本研究方案经汕头大学医学院人类伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》的宗旨。获得了所有捐赠者的书面同意。捐赠者口腔卫生良好，无吸烟史，无头颈部放疗史，无牙周病或其他活动性口腔感染。除近视外，他们没有其他主要眼病。在拔牙过程中断裂的牙齿被排除在研究之外。

人类PDLSC系之前已建立并鉴定[22-24]。将其保存在1:1的Dulbecco改良Eagle's培养基/F-12培养基（DMEM/F12；Gibco BRL，Rockville，MD）中，补充10%热灭活胎牛血清（Gibco BREL）和1×青霉素-链霉素（P/s；Gibco-BRL）。本研究使用第3-5代细胞。

动物

本研究使用成年雄性Fischer 344（F344）大鼠（8-10周；200-250克）。动物处理符合NIH实验室动物护理和使用指南，所有手术程序均经汕头大学医学院动物伦理委员会批准。所有手术均在麻醉下进行，腹膜内注射氯胺酮（100 mg/ml）和甲苯噻嗪（20 mg/ml）的1:1混合物（1.5 ml/kg），以尽量减少痛苦。每个实验将5只大鼠分配到每个治疗组。

PDLSCs的制备和玻璃体内注射

麻醉后，使用预先拔出的玻璃吸管，通过眼球角巩膜缘后入路进行玻璃体内注射，避免损坏晶状体。针头在眼球内停留几秒钟后拔出以减少渗漏。5 × 10⁴在3µl盐水中制备细胞，用于每只眼睛的注射。

视神经挤压

ONC基于之前描述的程序[25,26]。简单地说，将F344大鼠麻醉，在左眼眶上方的皮肤上做一个1.0–1.2 cm的切口。在手术显微镜下分离眼外肌后暴露ON，用细剪刀纵向切开其硬脑膜。使用带角度的珠宝钳（Dumont#5；Roboz，Rockville，MD），将ON在眼球后1.5 mm处压碎5秒钟，以确保完整的轴切术，而不会损伤动脉。压榨现场出现的空地证实了ON受伤。皮肤切口用6/0缝合线缝合。患有ONC的动物被分配进行体内实验或视网膜移植培养以进行轴突再生。

视神经损伤后轴突再生的免疫荧光分析

Axon再生分析基于我们报告的方案[25,26]。简单地说，在ONC后3周，通过过量麻醉将大鼠处死，并灌注冷盐水和肝素，然后再灌注4%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）。将附着有ON节段的眼睛从结缔组织中分离出来，并在一夜之间进行后固定。从眼球中切下ONs并转移到30%蔗糖溶液中，在4°C下过夜。纵向冷冻切片（14µm）通过低温恒温器（Leica CM1850，Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL）获得，解冻安装在镀膜载玻片（Superfrost plus，Fisher，Pittsburgh，PA）上，并在−20°C下储存，直到进一步使用。

如前所述，通过免疫荧光分析观察再生轴突[25,26]。简言之，将ON切片与抗GAP43抗体（在5%驴血清和2%牛血清白蛋白中稀释1:2500）在4°C下孵育过夜。彻底清洗后，添加Alexa488-共轭抗羊二级抗体（1:500；分子探针，Eugene，OR），并在室温下培养2小时。清洗后，使用Vectashield安装介质（Vector Labs）覆盖荧光切片。ON切片在荧光显微镜下进行轴突定量检查。

视网膜全细胞随机切片的免疫荧光分析

对整个视网膜进行的免疫荧光分析与以前的报告类似[27]。整夜固定后，将视网膜从眼球中剥离，然后进行三次5分钟的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗。使用10%的正常山羊血清（NGS；Biodesign，Saco，ME）和0.2%的Triton X-100封闭并渗透视网膜1小时。然后将视网膜与针对成年RGC的抗神经元特异性βIII-管蛋白抗体（1:500；加利福尼亚州Emeryeille的COVANCE）在4°C下孵育过夜[27]。用PBS清洗视网膜（5分钟，共3次），然后用Cy3-结合二级抗体（1:400；Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）在4°C下孵育过夜。在PBS洗涤3次，每次5分钟后，用抗褪色固定介质（Dako Corporation，Carpintia，CA）固定视网膜，并在荧光显微镜下成像。为了确定每个视网膜中阳性细胞的数量，我们计算了30–50个视野（0.25×0.25 mm）中阳性细胞数量²每个）以网格交叉的模式在固定距离的每个视网膜上。测定每个视野中阳性细胞的平均密度，并将数字乘以视网膜面积得出总数量。比较不同组的数据[26].

玻璃体内注射后，通过使用抗人细胞核抗体（Millipore，Temecula，CA）的免疫荧光分析确定眼睛中PDL细胞的位置和形态，该抗体标记了冷冻切片中的所有人源细胞。简单地说，在固定2小时后，在30%蔗糖中冷冻保护过夜后，在鼻颞方向以16µm的厚度切割整个眼球。用PBS彻底清洗视网膜切片，并用10%NGS和0.2%Triton X-100封闭1小时，然后用抗人细胞核抗体（1:1000；日本大阪Wako Pure Chemical Industries）在4°C下培养过夜。然后在室温下培养Cy3-结合二级抗体（1:400）1小时。通过DAPI（1:2000；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）细胞核反染色确定视网膜中阳性染色的位置，以显示视网膜的细胞层。抗Iba1抗体染色检测PDLSC注射后视网膜小胶质细胞和浸润性巨噬细胞的变化。

视网膜移植物中RGC的存活培养

从完整眼球上解剖视网膜外植体用于RGC存活分析。将视网膜贴在RGC层向上的硝化纤维滤纸上，不切割和粘附基底，在37°C和5%CO的培养基中培养7天₂它们被分配到不同的培养条件。应用在PDLSC条件培养基中培养的视网膜来评估PDLSC分泌的因子在没有接触相互作用的情况下的影响。在共培养组中，视网膜要么从PDLSC中分离出来（非接触；视网膜安装在悬浮在培养基中的硝化纤维过滤器上，PDLSC附着在基质上），要么与PDLSC接触（PDLSC在添加培养基之前附着在视网膜上）。为了使PDLSCs在共培养系统中可视化，在共培养前用DiI（Invitrogen，Carlsbad，CA）标记PDLSCs 1小时。以神经基础-A培养基（Gibco-BRL）中培养的视网膜和B27补充剂（Gibco BRL）作为阴性对照。

视网膜外植体培养中神经突起的生长

据报道，由于没有ONC前体的视网膜神经突起生长能力低[8]，如前所述，在视网膜摘除前7天进行ONC预处理损伤[28]。首先用300µl聚赖氨酸（200µg/ml）涂覆培养板（24个孔），然后用300μl层粘连蛋白（HBSS中20µg/ml）涂覆。ONC后7天，处死动物，在HBSS中解剖视网膜。将视网膜安装在硝酸纤维素滤纸上，RGC层向上，然后将每个视网膜径向切成八块。将RGC层朝下置于涂层基底上，将每片视网膜培养在含有B27补充剂的Neurobasal-A培养基中（使用MCM检测巨噬细胞分泌因子的影响）。视网膜外植体在37°C和5%CO中培养7天₂然后对生长中的突起进行免疫荧光分析。

存活RGC和神经突起生长的免疫荧光分析

用于RGC存活和神经突起生长的视网膜外植体在4%多聚甲醛中固定2小时。用PBS彻底清洗外植体，并用10%NGS和0.2%Triton X-100封闭1小时，然后用抗βIII微管蛋白抗体（1:400）在4°C培养过夜。用PBS冲洗视网膜外植体，然后在室温下用FITC-结合二级抗体（1:400；Sigma-Aldrich）孵育2小时。在每次5分钟进行3次PBS清洗后，用硝化纤维过滤器将RGC存活分析用的视网膜外植体安装在带有防褪色安装介质的切片上（Dako Corporation），并在荧光显微镜下进行检查（日本尼康Eclipse 800i）。在每个区域（0.1×0.1 mm）计算存活RGC的数量²)显微镜中的网格。通过以相等的间隔水平和垂直移动网格来选择视野，并计算每个视网膜中的50个视野。测定每个视网膜中标记RGC的平均密度。为了观察神经突的生长，直接在倒置荧光显微镜下检查贴在每个细胞基质上的外植体（日本尼康Eclipse TE2000i）。对从外植体中生长出来的突起的数量进行计数。对每个视网膜外植体测量五个生长最长的神经突，得出平均值并表示为平均神经突长度。

人BDNF、CNTF、NGF和IGF-1分泌的测量

人类PDLSC（10⁵在无血清DMEM/F-12培养基中加入×1 B27补充剂和×1 P/S，以非接触方式与大鼠视网膜共培养3天。处理3天后，收集培养基，在4°C下以2000 rpm离心5分钟，以去除死细胞。根据制造商的协议，将上清液转移到一个新的试管中，以便使用商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（BDNF:ab212166；CNTF:ab99994；NGF:ab99986；IGF-1:ab211651；马萨诸塞州坎布里奇Abcam）同时测量BDNF、CNTF、NGF和IGF-1。简单地说，将50µl标准培养基或100µl培养基涂敷到相应的ELISA平板上，并培养2小时。清洗4次后，为了检测BDNF和IGF-1，将样品与100µl TMD底物培养10分钟，然后再培养100µl Stop溶液。对于CNTF和NGF检测，将样品与100µl的1×生物素化抗人CNTF检测抗体孵育1小时，然后将100µl的1×HRP-链霉亲和素溶液孵育45分钟。ELISA信号由100µl TMB一步法底物试剂培养30分钟和50µl Stop溶液形成。加入Stop溶液后，立即在450 nm处测量ELISA信号作为吸光度。每个样品重复3次。根据标准曲线计算BDNF、CNTF、NGF和IGF-1的浓度，并描述为ρg/ml（BDNF和IGF-I）或ng/ml（CNTF和NGF）。

基因表达分析

人神经营养因子基因的表达(BDNF公司,CNTF公司,IGF1级,GDNF公司,NGF公司,NTF3型,VEGFA（血管内皮生长因子）,FGF1型,FGF2组,TGFA公司,OCM公司、和LIF公司)以及大鼠视网膜前体标记物(第6页,Dcx公司,Six3合金、和神经科1)和成熟RGC标记(磅4f2)通过半定量PCR和Sybr Green PCR在PDLSC（10⁵24孔视网膜细胞）和共培养后的视网膜外植体。收集每个时间点的三个独立样本的PDLSC或视网膜外植体。用TRIzol（Invitrogen）提取总RNA，并用SuperScript III逆转录酶（Invit罗gen）将1µg总RNA逆转录成cDNA。通过半定量PCR（35个周期）或Sybr Green PCR（瑞士罗氏）和特定引物测定相对基因表达（支持信息表S1）。家政基因(GAPDH公司或Actb公司)用于归一化。计算每个样本的相对基因表达并表示为ΔCt（δCt），其中每个测试基因的Ct值减去看家基因的Ct值。数据表示为平均值±标准偏差。

统计分析

使用事后Tukey检验（用于多重检验校正）的单向方差分析来比较不同治疗组的平均值。所有统计分析均采用商用软件（IBM SPSS Statistics 22；SPSS Inc.，芝加哥，IL）进行。重要性定义为第页 < .5

R（右）结果

PDLSC的生存及其在后房的定位

玻璃体内注射后3周，在ONC眼的后段观察到存活的人PDLSC。大多数移植细胞保持成簇，位于视网膜和晶状体之间的玻璃体腔中（图。1A） ●●●●。一些移植细胞迁移到宿主视网膜（图。1A） 主要定位于神经纤维层和RGC层。很少有细胞迁移到内网状层和内核层。在ON头部，PDLSC沿着神经纤维迁移到层前区和层后区（图。1B、，1C） ●●●●。通过比较视网膜切片中人类核素标记的PDLSC和存活RGC的数量，计算存活PDLSC的数量。由于存活PDLSC的数量是RGC的10倍（297±23个细胞/mm）²)，估计一只眼睛中PDLSC的数量为297×58.6（mm²视网膜）×10=1.7×10⁵细胞。

PDLSCs促进视神经挤压后RGC存活

为了研究人PDLSCs对成年RGC存活和轴突再生的影响，在ONC后的同一天将PDLSCs注射到玻璃体腔。死亡的PDLSC也被注射到眼睛中作为对照。ONC术后三周，生理盐水对照组中βIII-管蛋白阳性存活RGC的平均数量（±SD）为149±34个/mm²（图。2A、，2D） ●●●●。on损伤后死亡的PDLSC对RGC存活率没有显著影响，存活的RGC数量为114±22个/mm²（图。2B、，2D） ●●●●。相反，移植活PDLSCs的大鼠存活RGCs的数量（297±23个细胞/mm²,第页 < .001; 图。2C、，2D） 比生理盐水对照组高1.99倍。βIII微管蛋白阳性细胞与RGC标记物Brn3a的共定位证实了RGC层中存活细胞的RGC身份（支持信息图S1）。

PDLSCs促进视神经损伤后轴突再生

轴突再生通过新的（Gap43阳性）轴突再生到压碎的ON的远端残端来评估。ONC后三周，在盐水注射组中，每段只能观察到少数轴突通过压碎部位（图。三A） ●●●●。我们估计，对于盐水注射大鼠，196±48个轴突/神经可延伸至距离挤压部位0.25 mm的远端ON，25±15个轴突或神经在0.5 mm处延伸（图。三C） ●●●●。死亡PDLSC组和盐水注射组之间没有显著差异，与RGC生存分析结果类似（图。三C） ●●●●。移植活PDLSC的大鼠轴突再生估计为573±79个轴突/神经，位于挤压部位远端0.25 mm处(第页 < .001）和129±27轴突/神经（0.5 mm）(第页 < .001; 图。三C） ，与盐水注射组相比，分别增加了2.92倍和5.16倍（图。三B） ●●●●。

人PDLSC移植后的巨噬细胞活化

玻璃体内注射可引起眼部炎症，反过来可促进RGC存活和轴突再生[27]。为了阐明人PDLSC注射后是否发生眼内炎症，通过Iba1抗体观察入侵的巨噬细胞。我们观察到浸润的Iba1阳性巨噬细胞与移植的人PDLSC并列（图。4，箭头）。因此，移植人PDLSC的大鼠炎症反应被激活。除了附着在视网膜神经纤维层和神经节细胞层的浸润性巨噬细胞外，Iba1抗体还标记了IPL中的局部小胶质细胞和分支形态的外丛状层，并伴有活动突起（图。4，箭头）。

PDLSCs促进RGC体外存活

为了描述人类PDLSC对RGC存活的影响，视网膜外植体与PDLSC分别共培养（分离，图。5E） 或与PDLSC接触（接触，图。5E） ●●●●。培养7天后，对照组（仅视网膜外植体）βIII-管蛋白阳性存活RGC的平均数量（±SD）为665±67个/mm²（图。5A） ●●●●。树突和轴突在大多数RGC中消失。只剩下圆形的细胞体，而神经纤维束则碎裂成碎片。相比之下，单独PDLSC共培养的RGC存活率显著提高1.45倍（958±111个细胞/mm²,第页 < .01; 图。5B） ●●●●。值得注意的是，在接触的PDLSC共培养中（图。5D、 在DiI预先标记的红色中，存活的RGC被保存了2.18倍（1515±119个细胞/mm²,第页 < .001，与对照组比较；图。5C、，5F） ，树突和轴突形态健康，神经纤维束粗而紧密。

PDLSCs促进神经母细胞体外生长

我们评估了PDLSC对有或无ONC前体的视网膜外植体中神经突起生长的影响。与之前的研究一致[8]，在没有ONC前体的对照组中，从视网膜移植物中没有观察到突起生长（图。6A） ●●●●。通过PDLSC共培养，即使没有ONC前体，也可以从视网膜外植体中观察到神经突起的生长（图。6B） ●●●●。PDLSC共培养的突起平均数量和长度为26.8±4.3个突起/外植体（图。6E、，第页 < .001）和0.92±0.27 mm（图。6F、，第页 < .001），与对照组相比。在用ONC前体进行视网膜外植体培养时，在对照组中可以观察到很少的神经突起从视网膜外植物中生长出来（图。6C） ，其生长突的平均数量和长度为8.6±3.8个突/外植体（图。6E） 长度为0.80±0.29 mm（图。6F） 分别是。类似地，人PDLSC强烈促进了ONC前体视网膜外植体培养中的神经突起生长（图。6D） 两者的数目（48.4±7.3个轴突/外植体；第页 < .001; 图。6E） 和长度（3.16±0.44 mm，第页 < .001; 图。6F） 分别为5.63倍和3.95倍。

视网膜共培养增强PDLSCs分泌BDNF

为了确定人类PDLSC保护RGC和神经突起再生的机制，我们研究了神经营养因子基因的表达(BDNF公司,CNTF公司,IGF1级,GDNF公司,NGF公司,NTF3型,VEGFA（血管内皮生长因子）,功能梯度1,FGF2组,TGFA公司,OCM公司、和LIF公司)与大鼠视网膜共培养3天后，在人PDLSC中。半定量PCR显示BDNF公司,CNTF公司,GDNF公司、和NTF3型基因在人类PDLSC中高度表达（图。7A） ，而没有或很少表达IGF1级,NGF公司,VEGFA（血管内皮生长因子）,功能梯度1,FGF2组,TGFA公司,OCM公司、和LIF公司检测到基因（数据未显示）。然而，根据Sybr green PCR分析，在PDLSC培养中，无论有无视网膜外植体共培养，四个高表达的神经营养因子基因都没有显示出一致的显著差异（图。7B） ●●●●。与基因表达结果类似，ELISA检测发现PDLSC培养基中分泌的BDNF和CNTF高表达（图。7C） 而在培养基中未检测到IGF-1和NGF蛋白（数据未显示）。此外，我们还发现了一个新现象，与未进行视网膜共培养的PDLSC相比，人PDLSC分泌的BDNF蛋白在PDLSC视网膜共培养组中显著增强2.29倍（样品1:392.81±16.19对171.60±90.85ρg/ml）和4.89倍（样本2:614.69±131.75对125.64±45.83ρg/ml）(第页 < .001). 相反，视网膜共培养不会影响人PDLSC分泌CNTF。我们的结果表明，受损的视网膜可以增强人PDLSCs的BDNF分泌，以促进RGC的存活。

PDLSCs不促进内源性视网膜前体细胞的形成

除了PDLSC的直接保护作用外，损伤后存活RGC数量的增加也可能是由于内源性视网膜前体细胞的再生。研究PDLSCs对内源性视网膜前体细胞、视网膜前体标记物基因表达的影响(第6页,Dcx公司,Six3合金、和神经科1)通过Sybr绿色PCR进行测定。与单纯视网膜移植组相比第6页,Dcx公司、和Six3合金在接触或非接触PDLSC共培养中，所有基因都减少了1.5倍以上(第页 < .05），但未观察到神经科1基因（图。8). 这表明与PDLSC共培养不会触发视网膜前体细胞的扩增。相反，成熟RGC标记的表达磅4f2PDLSC处理的视网膜中的基因比对照视网膜高10倍以上(第页 < .001），证实PDLSC可以提高RGC的存活率，如动物和培养实验所示。

D类讨论

在这项研究中，我们证明了PDLSCs玻璃体内移植可促进ONC大鼠模型中RGC的存活和轴突再生（图(2和三)). 我们还提出了一种机制，即人PDLSCs通过刺激BDNF分泌，对受损视网膜中的RGCs提供神经保护。我们的结果表明，人类PDL提供了一种干细胞来源，即PDLSC，具有保护ONC后RGC变性的能力，这意味着潜在的神经疾病神经保护治疗。

基于细胞的治疗已被深入研究。不同来源的不同类型细胞，包括雪旺细胞、成纤维细胞、嗅鞘细胞和骨髓单个核细胞，已被研究用于ON损伤后的神经修复[29-32]。这些细胞可以作为生物微型泵，释放营养因子，促进RGC存活和轴突再生。然而，它们通常无法生存很长一段时间。移植后14天，大多数移植的骨髓单个核细胞在玻璃体或视网膜中找不到[32]。干细胞具有自我更新和分化能力，可以为移植治疗ON损伤提供充足的细胞。来自成人神经组织的神经干细胞已被证明可以保护RGC免受死亡[13]。相反，来自人类PDL的干细胞很容易获得，并成为神经治疗的自体细胞来源[33]。人类PDLSC在本质上是多潜能的，可以被诱导分化为不同的谱系，包括神经元谱系[24]。在本研究中，我们在ONC大鼠模型中证明了PDLSC介导的RGC保护作用。我们在移植人PDLSC的小鼠中未观察到任何肿瘤形成，这表明可以在视神经病变患者中检测人PDLSCs，以保护RGCs免受死亡并促进轴突再生。

先前的研究表明，青光眼模型中的骨髓源性MSC或ONC模型中的牙髓源性干细胞在移植后可以存活3-5周[15,18]。然而，人脐带源MSC在无免疫抑制的情况下只能在大鼠玻璃体中存活1周，但在抑制炎症和免疫反应时至少能存活3周[34]。在我们的研究中，我们观察到，在整个研究期间，在玻璃体内注射后，人类PDLSC在受体眼睛内存活至少3周（图。1). 一只眼睛中PDLSC的估计数量为1.7×10⁵细胞，是注射细胞的三倍（5×10⁴单元格）。我们还观察到PDLSC中人核抗体的核周或细胞质染色，表明一些PDLSC在玻璃体内注射后变得不健康甚至死亡（图中箭头所示）。1B、，1C） 染色的核物质已经移到核周区域，甚至扩散到细胞质（支持信息图S2C，S2D）。PDLSC可能在眼睛中增殖，但其中一些在玻璃体内注射后死亡。此外，我们的研究没有应用任何免疫抑制治疗，我们观察到浸润性炎症细胞与PDLSC并置（图。4). 尚不清楚这些巨噬细胞是否努力清除注射的PDLSC，或者PDLSC是否与炎症细胞相互作用以抵抗移植排斥。然而，移植的PDLSC的长期存活率还需要进一步研究。此外，注射PDLSCs后巨噬细胞的激活可能有助于促进RGC存活和轴突再生，以及PDLSC的神经保护作用。然而，在体外视网膜外植体培养中，PDLSC单独对RGC存活和轴突再生具有神经保护作用，而不涉及浸润性巨噬细胞。

神经营养因子分泌是移植成体干细胞潜在的神经保护机制之一。先前对骨髓源性MSCs条件培养基的分泌组分析鉴定出25种人骨髓源性骨髓间充质干细胞分泌的蛋白[35]。其中10种，包括干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素11（IL-11）、LIF、IL-6、BDNF、血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）和PDGF-AB/BB，与成人皮肤成纤维细胞相比，在人骨髓源MSCs中富集。此外，在大鼠牙髓源性干细胞中报告了NGF、BDNF和NT-3的分泌[18]BDNF和GDNF是小鼠骨髓源MSC神经保护作用的重要调节因子[20]。在我们的研究中，我们发现BDNF公司,CNTF公司,GDNF公司、和NTF3型基因在人类PDLSC中高度表达，但在IGF1级,NGF公司,VEGFA（血管内皮生长因子）,功能梯度1,FGF2组,TGFA公司,OCM公司、和LIF公司基因（图。7A） ，表明与来自不同组织来源的MSC相比，人类PDLSC分泌神经营养因子的光谱不同[36]。值得注意的是，我们发现了人类成人干细胞的一种新的神经保护机制，即视网膜共培养可使人类PDLSC的BDNF分泌增加两倍以上（图。7C） ●●●●。宿主视网膜损伤刺激的这种正反馈如何增强人类PDLSC的BDNF分泌需要进一步研究。

除了神经营养因子的神经保护作用外，晶状体损伤或巨噬细胞激活引起的炎症也可以增强RGC存活和轴突再生[25,26]。虽然PDLSCs可以发挥免疫调节作用，但我们推测异种移植人PDLSCs引发的炎症细胞募集可能发挥神经保护作用。为了排除炎症细胞的影响，我们采用体外共培养系统来验证PDLSC在不招募巨噬细胞的情况下的直接神经保护作用。正如预期的那样，在视网膜外植体培养中，PDLSC本身可以显著促进RGC存活和神经突起生长（图(5和6)). 当PDLSC与视网膜外植体接触时，这种神经保护作用甚至可以增强。这表明PDLSC的直接细胞接触是一种可能的神经保护机制。

除了神经营养因子外，RGC变性还可以通过内源性干细胞再生进行补偿。然而，在与PDLSC共培养的视网膜外植体中，我们没有观察到视网膜前体标记物的表达显著增加（图。8). 这表明RGC变性的拯救作用直接由PDLSC的神经保护作用介导，而不是通过促进内源性视网膜再生。

C类结论

总之，我们发现PDLSCs可以在体内外增强RGC存活和轴突再生。我们还确定了直接细胞接触和通过来自宿主视网膜的正反馈增加BDNF分泌，而不是内源性视网膜前体细胞扩张，作为增强PDLSC神经保护作用的机制。应进一步研究PDLSC移植对视神经病变患者的RGC保护治疗。

A类确认

这项工作得到了香港大学拨款委员会、中国国家自然科学基金会（81570849和81470636）、中国高等教育博士项目研究基金（2011440212007）和中国广东省自然科学基金（2015A030313446）的部分资助。G.H.-F目前隶属于新加坡新加坡眼科研究所组织工程和干细胞小组。

A类作者C类贡献

L.P.C.和T.K.N.：概念和设计；M.Z.和C.P.P.：财政支持；X.Y.、G.H.Y.和H.C.：提供研究材料或患者；L.P.C.、T.K.N.、J.J.L.和X.Z.：数据收集和/或汇编；L.P.C.、T.K.N.、H.S.C.和C.P.P.：数据分析和解释；L.P.C.、T.K.N.和C.P.P.：手稿写作；M.Z.和C.P.P.：手稿的最终批准。

D类披露P（P）潜在的C类关于…的冲突我利息

提交人表示没有潜在的利益冲突。

R（右）参考文献

作者注释