Podocalyxin的表达分离了小鼠胚胎干细胞源中胚层的造血和血管潜能

一个文摘

在小鼠胚胎和正在分化的胚胎干细胞中，造血细胞、内皮细胞和心肌细胞系来源于Flk1+中胚层祖细胞。在这里，我们报告称，作为唾液幻觉CD34家族成员的Podocalyxin（Podxl）的表面表达可用于将4.75天分化胚状体的Flk1+细胞细分为发育为不同中胚层谱系的群体。最终造血潜能仅限于Flk1+Podxl+人群，而Flk1-阴性Podxl+人群仅显示原始红系潜能。Flk1+Podxl阴性人群包含内皮细胞和心肌细胞潜能。Podxl表达可区分7.5、8.5和9.5天小鼠胚胎中的Flk1+中胚层群体，是祖细胞期原始红细胞的标记。这些发现确定Podxl是分离不同中胚层谱系的有用工具。S公司透射电镜C类厄尔斯 2014;32:191–203

介绍

原肠胚形成期间，外胚层的外胚层细胞通过原始条纹进入，形成中胚层[1-4]. 退出后原始条纹和中原始条纹的中胚层细胞，包括胚胎外、造血、血管和心脏中胚层，表达血管内皮生长因子（VEGF）受体Flk1（也称为Kdr或Vegfr2），表明这些定向中胚层谱系来源于Flk1+祖细胞[5-7]. 由于原肠胚形成期哺乳动物胚胎的可及性有限且体积较小，控制Flk1+祖细胞向不同中胚层谱系多样化的机制尚不清楚。胚胎干细胞（ES）的体外分化是发育中胚胎的有用替代物，因为它们相对忠实地再现了早期胚胎发育过程，具有大量生长的能力，并且易于进行基因操作[8, 9]. 使用Brachyury公司-GFP转基因报告鼠系跟随新生中胚层[10]在含有不同中胚层祖细胞的分化类胚体（EB）中观察到两个连续的Flk1表达波。早期（第3.25天）人群发育为造血细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的潜能增强，而晚期（第4.25天）群体具有心血管潜能[6, 11]. 其他标记物也被用来表征Flk1+中胚层祖细胞在EB分化中的特征。表达血小板衍生生长因子受体a（PDGFR-a）和Flk1的ES-derived cells代表早期（“原始”）中胚层谱系，从中衍生出具有造血和内皮潜能的Flk1+PDGFRa阴性谱系[12-14]. 与单独表达Flk1的细胞相比，同时表达Flk1和Endoglin（Eng）（转化生长因子β超家族的受体）的分化EB细胞的成血管细胞活性更高[15]. 在本文报道的工作中，我们询问Flk1+中胚层群体的不同潜能是否由其他不同的表面蛋白谱反映出来。

同源盒转录因子基因的条件诱导（强力霉素，DOX）混合物1在里面i-混合1ES细胞加速了中胚层发育程序，增加了血管母细胞和造血祖细胞的数量[16]. Mixl1激活肠系膜标志基因Gsc公司通过与启动子直接结合[17]从而控制ES细胞向中胚层谱系分化的承诺。在诱导与未诱导分化期间表达的基因的微阵列分析中i-混合EB，我们发现细胞标志蛋白(Podxl或Pclp1)是上调最强烈的基因。Podxl是一种与CD34和内多糖密切相关的跨膜糖蛋白（综述于[18].). 最初在成人肾脏上发现，它调节足细胞发育[19]在小鼠早期胚胎的细胞上也发现了[20]随后，在血管母细胞、造血干细胞和祖细胞、内皮细胞和循环胚胎红细胞上[20-24].

检测到Podxl公司in感应i-混合EB，其中中胚层的形成被加速和扩展[16]，我们系统地检测了Podx1在ES细胞分化过程中的表达，并询问它是否可以用作分离中胚层祖细胞的标志物。我们发现Podxl蛋白在分化EB细胞和小鼠胚胎中的表达先于Flk1，然后与Flkl重叠。此外，Podxl表达可用于将Flk1+中胚层细分为两个具有部分重叠但不同发育潜力的种群（Flk1+Podxl-阴性和Flk1-+Podxl+）。虽然Flk1+Podxl+人群的造血潜能丰富，但Flk1+Podxl阴性人群主要包含内皮和心脏潜能。Podxl+Flk1阴性人群显示出异常高的原始红细胞潜能。此外，Podxl在原始红系细胞上的表达比先前认为的要早得多，这不仅标志着胚胎第10-12天的循环红细胞，也标志着其E7.5-8.5的祖细胞。这些结果表明，Podxl的表达是分离具有不同发育潜能的Flk1+中胚层细胞的有用标记。

材料和方法

小鼠ES细胞系和转基因小鼠

E14 ES细胞通过EB的形成分化[25]，稍作修改。将ES细胞以每毫升20000个细胞的速度接种在含有15%胎牛血清的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中（FBS；CellGro，Manassas，VA，网址：http://www.cellgro.com)，2 mM谷氨酰胺（Gibco，Grand Island，NY，http://www.invitrogen.com网站)，50µg/mL抗坏血酸（西格玛，密苏里州圣路易斯，网址：http://www.sigmaaldrich.com)、5%无蛋白杂交瘤培养基II（PFHM-II；Gibco）和4.5×10⁻⁴M单硫代甘油（MTG）；西格玛）。对EB进行长达8天的分化，并在不同时间点采集EB进行流式细胞仪分析或荧光激活细胞分选（FACS）。为了测试发育潜力，将分选的细胞在分化培养基中重新聚集20小时[10]在24孔低簇板（Costar）中或在IV型胶原涂层的六孔板上再培养2-3天[26]在含有VEGF的分化培养基中（5 ng/mL；R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯，http://www.rndsystems.com)和/或造血细胞因子促红细胞生成素（EPO；2单位/mL；Amgen，加州千橡树，http://www.amgen.com网站)、白细胞介素3（IL-3；100 ng/mL；研发系统）和干细胞因子（SCF；100 ng/mL；研发体系）。

对于胚胎研究ɛ-珠蛋白-在人类控制下表达组蛋白H2B-GFP融合蛋白的H2B-EGFP转基因小鼠系ɛ-珠蛋白启动子、3′非翻译区（UTR）和最小位点控制区（mLCR）增强子[27-29]已使用。

微阵列鉴别分析i-混合胚胎干细胞

分化过程中基因表达的变化i-混合1在有或无DOX（0.1µg/mL，添加24小时分化后）的情况下培养的ES细胞[16]，每个处理每个时间点三次重复）。从第2、3和4天收获的EB中分离总RNA（在ES细胞接种后1天添加DOX）。将RNA（1µg）进行一轮线性扩增（RiboAmp系统）以产生10µg RNA。使用氨基烯丙基-dUTP间接标记RNA[30]然后与Cy3或Cy5共轭。用标记的RNA筛选15K小鼠发育cDNA微阵列[31]. 对每天采集的样本进行有或无DOX培养的EB杂交结果的配对分析。使用Spotfire软件进行数据管理和过滤。过滤数据后，将基因表达率归一化，以去除低强度和低质量的斑点。重复样本的数据在统计上符合良好（低调整第页-值）。对数据进行RNA标记、微阵列杂交和初步筛选。阵列分析生成的数据文件已提交给基因表达综合(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc = GSE40703），登录号为GSE40703。

流式细胞术

使用非昏迷细胞分离缓冲液（Gibco）将EB分散到单个细胞。将细胞重新悬浮在含有10%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并与抗体（支持信息表S1）在冰上孵育15分钟。然后用含有10%FBS的PBS清洗细胞一次，并用别藻蓝蛋白（APC）结合的链霉亲和素（eBioscience，加州圣地亚哥，网址：http://www.ebioscience.com)在冰上放置15分钟。用含有10%FBS的PBS洗涤后，细胞再悬浮在含有3%FBS和3µM 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS中，并使用FACSAria III或FACS流入仪器（BD，Franklin Lakes，NJ，网址：http://www.bd.com). 为了分析其他表面标记物，将分离的EB细胞或再培养细胞与抗Flk1和-Podxl抗体以及抗CD144[血管内皮（VE）-钙粘蛋白]、CD117（c-Kit）、CD31（Pecam1）和CD41抗体一起在冰上培养15分钟（支持信息表S1）。用含有10%FBS的PBS清洗细胞一次，并用APC-结合物（eBioscience）、荧光素异硫氰酸盐（FITC）结合物（BioLegend，加州圣地亚哥，http://www.biolegend.com网站)或藻红蛋白（PE）/Cy7-共轭（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥，http://www.bdbiosciences.com/index[小写]us.shtml)链霉亲和素。然后用含有10%FBS的PBS清洗细胞，并将其重新悬浮在含有3%FBS和3µM DAPI的PBS中，以使用BD-LSRII系统进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件（v8.8.6；TreeStar，Ashland，OR，网址：http://www.treestar.com).

定量实时聚合酶链反应

使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒从ES细胞、EB和分选细胞中分离出总RNA，网址：http://www1.qiagen.com)按照制造商的说明。cDNA是使用Superscript III第一链合成系统（Invitrogen，Carlsbad，CA，http://www.invitrogen.com网站)或iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，http://www.bio-rad.com)按照制造商的说明，在20µL反应中加入1µg总RNA模板。TaqMan方案、引物和探针如前所述[16]. SYBR Green方法的引物序列如支持信息表S2所示。对于SYBR Green定量实时聚合酶链式反应（QRT-PCR），20µL反应包含1µL cDNA、每个引物5µM和10µL SYBR Green PCR主混合物（Applied Biosystems，Foster City，CA，http://www.appliedbiosystems.com)或iQ SYBR Green Supermix（Bio-Read）。反应在7900HT快速实时PCR仪器（Applied Biosystems）中进行，程序如下：95°C，2分钟；40次循环：95°C，15秒；55°C，15秒；72°C，30秒；95°C，15秒；和60°C，15秒。这个Gapdh公司基因作为内部控制，每个基因的相对表达水平由C类_吨将基因值标准化为盖普，如前所述[29]. 公式中的任意值设置为100000。

造血祖细胞检测

对于原始红细胞集落形成细胞（EryP-CFC）分析，将分选的细胞与甲基纤维素混合物结合用于EryP集落[32, 33]每毫升20000个细胞，37°C培养，4天后对EryP菌落进行评分。对于多系造血祖细胞集落分析，将分选的细胞与甲基纤维素混合物（每毫升10000或25000个细胞）结合，用于多系造血集落，改性自[25]抗坏血酸的增加和转铁蛋白[1%甲基纤维素（w/v）、15%血浆衍生血清、10%PFHMII、2 mM谷氨酰胺、VEGF（10 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（10 ng/mL）、hSCF（100 ng/mL；25 ng/mL）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF；1 ng/mL和IMDM]，并在37°C下培养。细胞因子购自R&D Systems；PFMII来自GIBCO/Invitrogen。根据血统，在第5-10天对造血集落进行评分。

心脏电位测定

已排序的单元格（10⁵在补充有2 mM谷氨酰胺、转铁蛋白（200 mg/mL）、0.5 mM抗坏血酸和4.5×10⁻⁴M MTG在超低附着24孔板（Costar）中放置24小时，基本如所述[34]. 将含有VEGF（5 ng/mL）、bFGF（30 ng/mL。

免疫荧光分析

分选的细胞在IV型胶原涂层的八层玻片上重新培养（Millipore，Billerica，MA，网址：http://www.millipore.com)在有或无VEGF（5 ng/mL）的分化培养基中，每室30000个细胞培养2-3天。按照说明进行免疫荧光分析[35].

DiI-Ac-LDL吸收

将分选好的细胞在含有VEGF（5 ng/mL）的分化培养基中以每室30000个细胞的速度在IV型胶原涂层的八层玻片上重新培养3天。然后用标记有1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐（DiI-Ac-LDL；生物医学技术，马萨诸塞州斯托顿，网址：http://www.btiinc.com)持续4小时，然后按照制造商的说明进行固定和安装。

免疫荧光分析

通过在PBS中3%（v/v）甲醛中孵育，然后在PBS内用含有5%马血清的封闭缓冲液孵育来固定细胞。然后用大鼠抗鼠CD31（Southern Biotech，Bermingham，AL，网址：http://www.southernbotech.com). 然后用0.5%（v/v）Triton X-100在PBS中清洗细胞，并在室温下用AlexaFluor 568山羊抗鼠IgG（H+L）（Invitrogen，A-11077）以1:1000的稀释度孵育1小时。在PBS中用0.5%（v/v）Triton X-100清洗后，用VECTASHIELD HardSet安装介质和DAPI（Vector Laboratories，Burlingame，CA，网址：http://www.vectorlabs.com)并使用Axioplan 2荧光显微镜（德国耶拿卡尔蔡司，网址：http://www.zeiss.com).

血管生成/试管形成分析

将120000个细胞重新悬浮在浓度为每毫升600000个细胞的培养基（90%Dulbecco改良Eagle's培养基、10%FBS、50 ng/mL VEGF和2.5 ng/mL bFGF）中，并在室温下在预涂有Matrigel（BD）的48-well平板上培养1小时。在长达6小时的时间内，每1小时对试管形成情况进行一次目视评估。使用安装在Ziess AxioVert25上的Canon EOS Rebel T2i相机，使用Plan NEOFLUAR 5X/NA0.15物镜获取相位对比图像。

结果

Podxl的表达可区分EB分化过程中Flk1+中胚层的种群

检查转录变化，以应对混合物1，我们筛选了一个15K小鼠发育cDNA微阵列[31]使用从未诱导和DOX诱导中分离的RNAi-混合1EB（电子制动系统）[16]分化开始后的不同时间（第2、3或4天）（如前所述，在第1天添加DOX[16])。聚类分析显示DOX治疗的EB中基因表达的动态变化（支持信息图S1）。许多发育调控基因的基因表达发生了显著变化，包括转录因子、信号通路调节因子、生长因子和细胞粘附分子。早在第2天，参与中胚层形成、造血、血管和心脏发育的基因转录就被激活（支持信息表S3和图S1），最强烈上调的基因（～12倍）为Podxl公司.Flk1是已知的最早的新生中胚层表面标记[5]. 我们假设第3-4天EB（中胚层诱导峰值）中的Flk1+群体是异质和多能的。因此，可以使用额外的标记物将Flk1+细胞细分为潜力更有限的不同亚群。

我们使用流式细胞术检测了未分化和分化小鼠ES细胞上Podxl的表达模式（图。1安培). Podxl在未分化的小鼠ES细胞上不表达，但在分化过程中上调，在Flk1蛋白和RNA表达之前（图。1安培; 支持信息图S2、S3），并将Flk1+种群分为两个不同的Flk1+亚种群（图。1，装箱）。到4.75天，鉴定出四个不同的群体（Flk1-SP，Flk1-单阳性；Podxl-SP，Podxl单阳性；DP，Flk 1和Podxx双阳性；DN，双阴性）。因此，我们将重点放在这个时间点上进行后续研究。

鉴于Podxl-SP细胞在EB分化中的早期出现，我们询问它们是否能产生Flk1+细胞，从而代表一个新的中胚层祖细胞群体。在第3.5天、第4.0天和第4.75天使用FACS从EB中分离出不同的群体，允许其重新聚集20小时[10]，然后分析Flk1和Podxl的表面表达。分选后立即通过流式细胞术确认分选群体的纯度（支持信息图S4）。图中显示了一个代表性实验（共三个）1B年新的Flk1+细胞数量最多的是重新聚集的DN细胞（高达～40%）。只有约一半的新Flk1+细胞由重新聚集的Flk1-SP细胞形成（约22%），而DP和Podxl-SP群体产生的细胞更少（分别为约15%和约12%）。

相反，新的Podxl+细胞主要来自重新聚集的Flk1-SP（高达～71%），其次是DN（～42%）和DP（26%）细胞（图。1B年). 重新聚集的Podxl-SP细胞几乎只产生Flk1+细胞，并且在4.75天时也是最小的群体（图。1安培). 重新聚集的Podxl-SP未产生任何新的DP细胞。只有DN和Flk1 SP细胞在重新聚集后产生了所有四个亚群。总之，这些发现表明，从第4.75天开始，四个亚群的发育潜力不同。

分类细胞群的中胚层特征

为了评估4.75天EB细胞群的中胚层特征，进行了QRT-PCR分析。这些群体都没有表达多能性标记Sox2系统和纳克（图。2安培). The highest levels of expression ofBrachyury（T)在DN、Flk1-SP和Podxl-SP群体中检测到原始条纹和新生中胚层的标记，而在DP群体中表达非常低（图。2B型). 相反，在Flk1-SP群体中，原始条纹、中胚层和肠系膜的标记(T、 混合物1和Gsc公司，图。2B型)在显著水平上表达。Flk1-SP群体也转录了侧板标记(扭曲)，近轴(Pdgfra公司和Tbx6型)和心脏病前期(Gata4公司)但不是轴向(福克斯2)中胚层（图。2摄氏度). 总之，这些结果表明，Flk1-SP群体包含早期Flk1+Pdgfra+中胚层祖细胞和/或其衍生的近轴、心脏前和血管中胚层细胞[14]. DP群体的表达谱最像侧板中胚层(扭曲，图。2摄氏度). 这些结果表明，通过Podxl表达分离的Flk1-SP和DP群体代表不同的中胚层群体。

Podxl标志着EB中第一批具有原始造血潜能的人群

EryP细胞是在原肠胚中出现的第一个造血谱系[36]或分化ES细胞[25]. 为了确定4.75天EB中哪种分类的细胞群体含有EryP潜能，我们在甲基纤维素中进行了克隆形成祖细胞分析，并对EryP菌落进行了评分（代表EryP-CFC）。大多数EryP电位（75%）在Podxl-SP人群中检测到，其余25%在DP人群中（图。第3页). 胚胎（βH1和εY）和成人β1珠蛋白在Podxl SP细胞中以显著水平表达，在DP细胞中以低得多的水平表达（图。3B公司). 本质上没有表达珠蛋白在DN或Flk1-SP人群中检测到基因。结合EryP-CFC数据，这些发现表明最早具有原始红细胞生成潜能的细胞群体以Podxl表达为标志。

Flk1+Podxl+（DP）人群因最终造血潜能而增加

为了评估这四个群体的确切造血潜能，我们进行了多系造血祖细胞分析。只有DP群体产生了大量明确的造血集落（EryD、巨噬细胞、巨核细胞、混合红细胞/巨噬细胞或红细胞/巨核细胞；图。4A级). 造血转录因子基因(Lmo2、Cdx4、Ets1、Runx1、Gata1、Tal1、HoxB4、和飞行1)也在DP人群中大量表达（图。4B类). 第4.75天的DP人群同时表达c-Kit和CD41（图。4摄氏度)，两个明确的造血祖细胞表面标记[37, 38]. 然而，这些标记并没有同时表达（图。4摄氏度和数据未显示）。这些数据与其他人发表的结果一致，这些结果显示c-Kit在4.75天的EB中显著表达，但CD41水平较低[37]. CD41在大多数（58%）分离并在IV型胶原上重新培养3天的DP细胞表面表达[26, 39]但其他三个再培养群体中的细胞很少（如果有的话）（图。4D（四维）). 综上所述，这些结果表明DP人群具有明确的造血潜能。

Flk1-SP和DP人群含有内皮电位

内皮转录因子基因的表达Etv2/ER71型,塔尔1,Lmo2、Fli1、和等1[40]第4.75天，在Flk1-SP和DP人群中（图。4B类)引导我们评估他们的内皮潜能。在有VEGF存在的情况下，将IV型胶原重新培养后，用流式细胞术检测分选细胞上内皮标记物Flk1和CD31的表达。Flk1-SP和DP群体都表达了Flk1和CD31（图。5A级)并显示DiI-Ac-LDL的摄取（图。5摄氏度). CD31的表达通过免疫荧光进一步证实（图。5亿). 最后，Flk1-SP和DP细胞在Matrigel上形成毛细血管样结构（图。第五天).

心脏中胚层电位仅限于Flk1-SP人群

高水平表达Gata4公司（图。2摄氏度)心前中胚层标志物[41]在Flk1-SP细胞中，提示我们询问该人群是否具有心脏电位。我们检查了心脏标志物Gata4、Hand1、Hand2、和牛顿x2.5排序日4.75个种群。手动Gata4、和手牌2与DN和Podxl-SP细胞相比，在Flk1-SP和DP细胞中都有较高水平的表达（图。6A级).牛顿x2.5在我们的分析中，在第4.75天未检测到表达；其他人报告称，它大约在EB分化的第6天被激活[42, 43]. 为了检查分类群体形成跳动菌落的可能性，从第4.75天开始分类的细胞被允许重新聚集24小时，然后在VEGF和bFGF的存在下培养4天[34]. 仅在培养的Flk1-SP聚集体中发现打浆菌落（图。6亿). 使用免疫荧光分析心脏标记物肌钙蛋白T（cTnT）的表达，仅在来自Flk1-SP细胞的搏动集落的细胞中检测到（图。6摄氏度). 总的来说，这些数据表明Flk1的单独表达表明中胚层细胞向心肌谱系分离。

Podxl表达区分小鼠胚胎中Flk1+中胚层群体

为了确定Podxl的表达是否区分体内Flk1+中胚层群体，在E7.5、E8.5和E9.5收获小鼠胚胎，分散到单细胞中，并使用流式细胞术分析Flk1和Podxl的表面表达。如区分EB所观察到的（图。1)，发育中的小鼠胚胎包含Flk1-SP、Podxl-SP和DP群体（图。第7章)在分析的每个阶段（E7.5和E8.5，在循环开始之前，当EryP局限于含有祖细胞活性的卵黄囊时；E9.5，当Ery P存在于血流中，但祖细胞活性已消失时[29, 36]).

以前的一份报告表明，Podxl在E10的胚胎外周血细胞和E12卵黄囊的Ter119+CD71+细胞上表达[20]. 为了更直接地确定这种蛋白是否在EryP上表达，我们使用了一种转基因小鼠系，在该系中，组蛋白H2B-GFP报告基因在人的控制下在EryP细胞的细胞核中表达-珠蛋白启动子和mLCR增强子[27-29]. 用抗Podxl和Flk1抗体对GFP+（EryP）细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析。如预期[29]，Flk1在E7.5时在EryP/GFP+细胞亚群的表面表达，但在E8.5和E9.5时在大多数EryP中不表达（图。7亿). 相反，当几乎所有EryP都是Podxl+时，GFP+EryP上Podxl的表达从E7.5急剧增加到E8.5（图。7亿). 相反，胚胎中Podxl+细胞的显著比例（27%-60%）为EryP（图。7亿). 造血标记物CD41的表达在每个发育阶段与GFP荧光密切相关（图。7摄氏度). CD41表达从E7.5增加到E8.5（EryP祖细胞数量增加[29])然后E9.5开始下降，此时EryP在血液中循环，祖细胞活性缺失[36、44].

讨论

我们对造血发育和多能干祖细胞之间的等级关系的了解，极大地得益于使用细胞表面标记来前瞻性地识别、分离和表征处于不同承诺阶段的细胞群体（例如[45, 46].). 以类似的方法，根据表面蛋白表达细分中胚层祖细胞的能力，将促进我们对中胚层谱系规范的理解。在这里，我们报告，根据Podxl表达，通过表面Flk1表达鉴定的ES细胞源性中胚层可以分离为具有不同潜力的不同群体。

在第4.75天（明确识别出四个亚群的时候），从EB中筛选出的Podxl-SP亚群仅产生EryP细胞，且此潜能显著高于其他三个筛选出的群体。这些发现出乎意料，因为血统追踪研究先前证实原始和最终造血细胞均来自Flk1+中胚层[7]Flk1标记E7.5（祖细胞期）EryP的一个子集([29]和本工程）。

在分化ES细胞时，Podxl的表达早于Flk1的表达，这增加了至少一些Flk1+中胚层细胞来自早期Podxl+细胞群的可能性。与这个想法一致，在不同时间从EB中分选出来的重新聚集的Podxl-SP细胞几乎只产生Flk1-SP细胞。因此，在Podxl表达分离表达Flk1的中胚层之前，Flk1表达可能会将表达Podxl-的中胚叶分离为亚群。相反，重新聚集的Flk1-SP和DP细胞产生Flk1-SP、DP和Podxl-SP细胞。这些观察结果表明，Podxl-SP群体包含早期中胚层细胞，与形成卵黄囊胚外中胚层和原始红系祖细胞的细胞相当。因此，这些数据表明Podxl可能是Flk1+中胚层细胞参与原始红系命运的早期标记。

在小鼠胚胎中，50%以上的GFP+转基因EryP在E7.5表达Podxl（大约在第一次使用集落分析检测祖细胞活性时[29])以及E8.5和E9.5的基本所有EryP。此外，胚胎中大部分Podxl+细胞为EryP（E7.5、E8.5和E9.5分别为～27%、60%和～50%）。因此，Podxl的表达不仅标志着循环EryP，也标志着其祖细胞，为鉴定胚胎的第一批造血细胞提供了新的工具。Podxl具有抗粘附性能[47]并可能在动员骨髓中的红系祖细胞中发挥作用[48]. 很容易推测，这种抗粘附作用也有助于在胚胎中开始循环时从卵黄囊中释放原始成红细胞。

与Podxl-SP亚群相比，DP细胞基本上包含所有明确的造血潜能。DP群体也表达侧板中胚层标记扭曲所有造血基因都在最高水平上测试。它含有一小部分原始电位和内皮电位。先前已经根据EB中Flk1+细胞出现的时间模式来区分原始和确定的造血谱系[49]. 在这里，我们根据细胞表面标记，在EB分化的同一时间段分离了这些谱系。

Flk1-SP细胞产生少量明确的造血细胞、内皮细胞和心肌细胞，而DP人群产生原始和明确的造血和内皮细胞谱系。Flk1-SP和DP细胞的内皮和造血标记物表达与其各自的发育潜能一致。Flk1-SP细胞表达内皮发育所需的高水平基因，但造血基因水平很低，能够摄取Ac-LDL，并生成CD31+细胞。这些观察结果表明，该人群的内皮细胞潜能大于造血潜能。Flk1-SP人群也表达高水平的心脏标志物Gata4公司引起cTnT+心肌细胞收缩。它们可能与Brachyury公司-先前报道的GFP/Flk1+心脏祖细胞[6, 11].

如引言部分所述，与Flk1+细胞群相比，表达Flk1和Eng的细胞群富含成血管细胞活性[15]. 在提交这项工作后，据报道Eng的表达标志着早期胚胎中的第一个造血祖细胞[50]并且可以根据Eng在发育后期的表达水平来区分造血和内皮谱系[51]. 有趣的是，诱导的Eng过度表达可能影响决定造血与内皮和心脏潜能的转换[52]. 我们有兴趣在这里分析的各种细胞群上检测Eng的表达。CD40和Icam2在体外和体内血液规格化的早期阶段相继表达[53]. 他们与Podxl和Eng的时间关系尚待确定。

结论

Podxl的表达提供了一种新的工具，可以在无需转基因报告ES细胞系的情况下分离不同的中胚层细胞群，从而分化EB，因此应该可以翻译到人类多能干细胞系统。随着Podxl和其他标记物的联合使用，对具有独特发育潜力的早期中胚层细胞群进行更精确的分离将成为可能，并最终将有助于从分化多能干细胞中分离出谱系特异性祖细胞，以用于再生医学。

致谢

我们感谢Ambjuj（Butch）Upadhyay提供的杰出技术援助，感谢Andrei Vacaru博士对手稿的周到评论。这项工作得到了国家卫生研究院（RO1 HL62248）的资助，M.H.B.J.I.目前隶属于西班牙马德里Melchor Fernández Almagro 3国家心血管研究中心（CNIC）心血管开发与修复部；S.T.F.目前隶属于澳大利亚新南威尔士州坎珀顿悉尼大学医学院生理学、解剖学和组织学学科。

作者贡献

H.Z.、S.T.F.、J.I.和M.H.B.：概念和设计；H.Z.、J.L.、S.T.F.、J.I.、P.D.、D.P.、S.L.D'S.和M.A.D.：数据收集和汇编；H.Z.、J.L.、S.T.F.、J.I.、P.D.、D.P.、M.A.D.和M.H.B.：数据分析和解释；H.Z.、S.T.F.和M.H.B.：手稿写作；I.R.L.、M.A.D.、M.H.B.：财务支持；M.H.B.：手稿的最终批准。

潜在利益冲突的披露

作者表示没有潜在的利益冲突。

参考文献