血管生成素-2导致正常视网膜周细胞脱落:糖尿病视网膜病变的证据

本研究中进行的实验符合视觉和眼科研究协会（ARVO）关于“动物在眼科和视觉研究中的使用”的声明

通过静脉注射链脲佐菌素（STZ）使6周龄雄性Wistar大鼠（查尔斯·里弗（Charles River），苏尔兹菲尔德（Sulzfeld），德国曼海姆（Mannheim）的体重达到65毫克/千克（Boehringer-Manheim），患上糖尿病。连续监测血糖水平和体重，并通过亲和色谱法（Glyc-Affin；Isolab，Akron，OH）测定糖化血红蛋白。

Ang-2启动子控制下报告基因LacZ的小鼠（Ang-2-LacZ敲除）(22)是最近开发的，由Regeneron Pharmaceuticals（新泽西州塔里敦）提供。以野生型幼崽为对照。用STZ（150 mg/kg i.p.）诱导体重为24±3 g的6周龄动物产生稳定的糖尿病。血糖监测的方法与糖尿病和非糖尿病大鼠相同。糖尿病小鼠和年龄匹配的对照组维持6周以分析高血糖状态下Ang-2表达的变化，并维持26周以分析周细胞数量的变化和无细胞毛细血管的形成（见下文）。

为了确定周细胞丢失的开始时间，从糖尿病和非糖尿病大鼠中取出眼睛(n个=每组5）。研究开始时，对一组五只非糖尿病动物进行了调查。在深度麻醉下，动物眼球摘除后获得视网膜，并立即用4%的福尔马林缓冲液固定。如前所述，使用胃蛋白酶-胰蛋白酶消化技术进行视网膜血管制备(20，21)。简单地说，使用联合胃蛋白酶（5%胃蛋白酶在0.2%盐酸中浸泡1.5小时）胰蛋白酶（2.5%在0.2mol/l Tris中浸泡15–30分钟）消化来分离视网膜血管。随后，用周期性酸性希夫碱（PAS）对样品进行染色。使用图像分析系统（CUE-2；德国汉堡奥林巴斯光学公司）在10个随机选择的视网膜区域中计算周细胞总数，并将其数量归一化为相对毛细血管密度（每毫米细胞数²毛细管面积）。由于在糖尿病2个月后发现周细胞明显丢失，因此从糖尿病3周后的大鼠、年龄匹配的非糖尿病对照组、糖尿病3个月后的糖尿病大鼠和年龄匹配的正常对照组中获取眼睛。眼睛被植入OCT（Miles，IL），切片（6μm）在-20°C的低温恒温器上切割并放置在聚乙烯上-我-赖氨酸包被载玻片。

视网膜消化制剂(n个=4）26-week-diabetic Ang-2 LacZ^+/−同样对小鼠和非糖尿病对照组进行试验，并对PAS染色样品中的周细胞数和脱细胞毛细血管进行分析，如上所述。

为了确定视网膜中高血糖介导的Ang-1和Ang-2调节，使用四个实验组的蛋白提取物进行Western blot分析。简言之，视网膜蛋白提取物在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝化纤维过滤器后，与抗Ang-1抗体（亲和纯化的山羊抗人Ang-1氨基末端多克隆抗体；0.2μg/ml，SC 6319；St。Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany）和Ang-2（针对小鼠Ang-2的亲和纯化山羊抗体；0.2μg/ml；SC 7017；St.Cruz biotechnoology）。使用增强化学发光Western印迹检测系统开发了过滤器（德国布伦瑞克阿默沙姆），并使用数字拷贝和定量分析软件对免疫复合物进行定量（德国汉堡奥林巴斯光学公司分析）。使用小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体（0.1μg/ml；C4，Boehringer Mannheim）重新配制过滤器，并如上所述进行开发。这些数据用于将血管生成素水平标准化为蛋白质负荷。

6周龄糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠和年龄匹配的非糖尿病对照组的眼睛(n个=5个视网膜/组）在深度麻醉下切除，并对LacZ和凝集素进行染色，以根据已发表的方案显示Ang-2表达与视网膜血管系统的关系(23)。简单地说，将非糖尿病和糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠的眼睛固定在含有0.2%戊二醛和1.5%甲醛的溶液中，并进行X-gal染色。从眼睛中分离视网膜并将其固定在4%的福尔马林缓冲液中，用1%的BSA和0.5%的Triton-X-100进行渗透，然后在4°C下用TRITC结合的异种凝集素（Sigma L-5264，1:50）染色过夜。通过在视网膜浅层和深层的每个显微镜视野中计数LacZ阳性细胞来评估Ang-2表达细胞的数量。在放大40倍的条件下，每个视网膜平均计数10个随机选择的显微镜视野。记录视网膜内层（神经节细胞层和神经纤维层）的细胞数量，以显微镜下大血管聚焦为参考，以及以深毛细血管层为焦点的内核层。此外，获得了LacZ染色的眼睛，并按照所述进行了垂直冷冻切片(22).

使用正常雄性Wistar大鼠（6周龄；Charles River，Sulzbach，德国）。将含有0.330μg（四只动物）和1μg（四只动物）重组Ang-2（德国威斯巴登研发中心）的10微升Ang-2在深度麻醉下经玻璃体内注入左眼（阿维汀）。右眼注射无菌PBS作为对照。1周后从深度麻醉的动物身上取下眼睛，按照上述方法对视网膜进行消化处理，并评估毛细血管网络中每个毛细血管区域周细胞的数量。

糖尿病的诱因如上所述。在26周的稳定高血糖后，从以下组获得眼睛：非糖尿病野生型小鼠(n个=6），糖尿病野生型小鼠(n个=6），非糖尿病性Ang-2 LacZ敲除小鼠(n个=4）和糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠(n个= 4). 从深度麻醉的动物中取出眼睛，按照上述方法对视网膜进行消化处理，并使用前面描述的定量方法评估毛细血管网络周细胞和无细胞毛细血管的数量。

结果以平均值±SD表示。为了进行统计分析，使用了方差分析和Bonferroni多重比较检验（Instat；GraphPad，San Diago，CA）。

我们使用定量视网膜形态计量学测定了糖尿病3个月期间视网膜毛细血管周细胞丢失的发生和程度。表1显示体重、血糖和HbA₁实验组。STZ诱导的糖尿病大鼠血糖升高三倍以上，糖化血红蛋白水平升高（3周时增加三倍，3个月时增加四倍以上）。与非糖尿病对照组（+23.5%）相比，糖尿病动物的体重增加幅度要小得多（基础体重增加10.3%）。糖尿病持续2个月后，糖尿病患者的周细胞数量显著不同（2342±104周细胞/mm²毛细血管面积）和非糖尿病动物（2769±99周细胞/mm²毛细管面积；P（P）< 0.001) (图1)表明糖尿病大鼠模型中周细胞早期丢失。根据这些数据，使用在周细胞丢失开始之前（即糖尿病诱导后3周）和之后（即糖尿病诱发后3个月）的某个时间点获得的视网膜进行后续实验。

接下来，通过免疫印迹法评估高血糖对Ang-1和Ang-2表达的影响，这与周细胞脱落的开始有关。在3周和3个月时，非糖尿病视网膜中均存在Ang-1。在糖尿病视网膜中，Ang-1在3周时增加了2.5倍，3个月时仍高于非糖尿病对照组，表明慢性高血糖持续上调。Ang-2蛋白在非糖尿病动物中的表达在3周时非常低，在3个月时很低。相比之下，在糖尿病大鼠3周时，Ang-2蛋白的上调幅度是非糖尿病大鼠的37倍，而在糖尿病3个月时，其上调幅度仍然是非糖尿病对照组的2.5倍(图2)。这些数据表明，高血糖主要且强烈上调Ang-2，并且Ang-2上调先于糖尿病视网膜周细胞丢失的发生。

我们使用了一个小鼠模型，在该模型中，Ang-2的表达通过LacZ报告子结构可视化，以确认高血糖对Ang-2表达的影响。此前，研究表明，这些小鼠在成人视网膜内核层的水平细胞和神经节细胞层中分布不清的少数细胞中表达Ang-2(24)。在患有STZ诱导的6周糖尿病的小鼠和年龄匹配的非糖尿病对照小鼠之间比较可检测到LacZ表达的视网膜细胞的数量。两组的代谢数据如下所示表2在12周龄的非糖尿病动物中，每个显微镜下共有34个细胞表达Ang-2，其中8%（2.7±1.2个细胞/面积）位于神经节细胞层(图3)，而大多数细胞位于外毛细血管丛，即内核层的外缘（31.25±4.18个细胞/面积）。神经节细胞层LacZ阳性细胞增加2.8倍（7.5±1.61个细胞/面积；P（P）与非糖尿病组相比，<0.0001），内核层增加2.0倍（60.87±18.35个细胞/面积；P（P）<0.0001 vs.非糖尿病组）。除了在视网膜的已知位置表达外，如图所示，在从神经节细胞到视网膜内核层的毛细血管中也观察到Ang-2的表达图3这些数据证实了在STZ糖尿病大鼠模型中获得的数据，并与慢性高血糖上调视网膜Ang-2的假设一致。

由于慢性高血糖和眼部应用Ang-2药物均会导致周细胞脱落，因此我们询问Ang-2表达降低的小鼠是否能防止周细胞脱落以及随后的后果，如无细胞毛细血管的形成。因此，我们研究了患有糖尿病26周的Ang-2 LacZ敲除小鼠视网膜周细胞脱落和脱细胞毛细血管的形成。小鼠的代谢数据见表3尽管糖化血红蛋白水平是非糖尿病野生型对照组（糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠1762±180周细胞/mm²毛细血管面积，非糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠1835±248周细胞/mm²; NS）(图4A)。尽管周细胞没有丢失，但在糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠中观察到无细胞毛细血管数量显著增加(图4B)。与糖尿病野生型幼崽中无细胞毛细血管形成的增加相比，这种增加明显减少。

为了研究眼内Ang-2浓度增加是否会导致周细胞脱落，将重组Ang-2玻璃体内注射到6周龄非糖尿病大鼠体内。注射后1周分离视网膜，并进行视网膜消化准备和形态测量。定性地说，在所有接受治疗的动物眼睛中均未观察到炎症迹象，这表明毛细血管细胞间串扰的药理调节并非由炎症细胞诱导。一周后，注射330 ng Ang-2诱导非糖尿病大鼠视网膜周细胞数量减少13%，注射1μg Ang-2则减少22%（对照组2871±550细胞/mm）²毛细管面积；330 ng Ang-2 2490±380个细胞/mm²毛细管面积；P（P）与对照组相比<0.01；1μg Ang-2 2260±430个细胞/mm²毛细管面积；P（P）<0.001与对照组相比；图5)。周细胞覆盖率的这些定量变化与内皮细胞增殖无关，如定量形态计量学所评估（未显示）。重要的是，Ang-2注射不会影响视网膜毛细血管的直径或规则性（PBS注射视网膜的毛细血管宽度：7.29±0.81μm vs.Ang-2 1μg 6.97±0.69μm；NS）。图5B和C说明Ang-2注射后毛细血管的规律。我们没有观察到质的变化；特别是，既没有发芽和新血管形成的迹象，也没有血管退化的迹象。

我们的实验数据表明，慢性高血糖上调糖尿病视网膜中的Ang-2，Ang-2上调与糖尿病视网膜病变周细胞丢失的发病机制有关。因此，这些数据增加了一个尚未被重视的新方面，即Ang-2的上调通过主动消除机制参与了周细胞损失的发病机制。

已经提出了几种机制来解释糖尿病视网膜周细胞丢失。一种假设是指有毒细胞内产物的积累，如山梨醇或晚期糖基化终产物（AGEs）(25，26)。醛糖还原酶将葡萄糖转化为山梨醇，被认为只在视网膜周细胞中表达，但其他研究表明，醛糖还原酶在包括内皮细胞在内的多种细胞类型中表达(27)。虽然醛糖还原酶途径对糖尿病视网膜病变的相对重要性尚未确定，但其在周细胞脱落中的作用可能不是主要的。AGEs被发现在糖尿病动物的周细胞中积累，但这种积累的时间过程与周细胞损失的时间过程不一致，这表明AGE的积累可能不是因果关系(26)。当注射到非糖尿病动物体内时，AGEs会积聚在周细胞中。然而，这可能更多地归因于周细胞的吞噬倾向，而不是糖尿病诱导损伤的特定机制(28)。进一步的数据表明糖尿病视网膜周细胞存在选择性损伤，包括对修饰蛋白（如氧化低密度脂蛋白）的不同敏感性(29)以及对葡萄糖暴露的促凋亡途径的选择性激活(30)。我们的数据不是周细胞的被动破坏，而是与糖尿病周细胞丢失的另一种假设相一致，即糖尿病视网膜周细胞丢失是由涉及Ang-2的周细胞主动消除所启动的过程的一部分。

Ang-2可能有三种来源。在正常视网膜中，Ang-2在水平细胞和一些未定义的神经节细胞层细胞类型中表达(24)。还描述了血管内皮细胞中Ang-2的表达(31)。此外，体外数据表明，在高血糖条件下，Muöller细胞增加Ang-2的表达(32)。虽然我们未能通过免疫学方法评估大鼠糖尿病视网膜中有助于Ang-2整体上调的细胞的精确定位，但我们的数据表明，糖尿病中提供Ang-2的细胞数量增多。此外，我们对糖尿病Ang-2 LacZ敲除小鼠的研究表明，血管细胞在高血糖条件下可以成为Ang-2的来源。

高血糖对Ang-2的（上调）调节尚未见报道。迄今为止描述的参与Ang-2调节的因素包括缺氧、组织缺血和生长因子，如VEGF(33——35)。然而，糖尿病视网膜Ang-2早期上调的具体机制尚不清楚。我们发现糖尿病大鼠视网膜中Ang-2蛋白表达增加，但在前3个月内，视网膜尚未形成大量无细胞毛细血管，因此缺氧可能是Ang-2表达的诱导因素。最近的数据表明，高血糖诱导线粒体过度产生活性氧物种导致糖酵解途径受到抑制，底物通过以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为起点的生化途径过量流动。结果可能是基因转录和蛋白质生产的改变，可能包括Ang-2的转录增加(36——38).

发育研究表明，Ang-1与Tie-2的相互作用通过周细胞和平滑肌细胞的募集导致血管成熟和稳定(11——15)。血管紧张素-1是周细胞定位系统的一部分，使血管对增殖或退化信号难以反应。Ang-2被激活为Ang-1的天然拮抗剂，通过抑制Tie-2磷酸化进行循环生理重塑(15)。血管对Ang-2的反应是依赖于环境的，因为Ang-2在长期暴露后也可以诱导而不是抑制Tie-2的自身磷酸化(22)。内源性Ang-2虽然在成人视网膜中低水平表达，甚至不表达，但在实验性增殖性视网膜病中显著上调，在短暂血管形成模型中外源性给予Ang-2（内皮细胞仍然依赖VEGF生存），导致内皮细胞增殖和新生血管生成(39——41)。因此，只要血管紧张素-2遇到血管内皮生长因子和致敏的视网膜血管系统，它就可以在视网膜中发挥血管生成因子的作用。我们的研究为Ang-Tie系统的复杂性增加了一个新的方面，即Ang-2诱导成熟视网膜周细胞脱落，而不会伴随急性内皮细胞变化，如内皮细胞增殖或毛细血管不规则成形。在我们的啮齿动物实验性糖尿病视网膜病变模型系统中，视网膜内新生血管生成缺乏。因此，尽管周细胞丢失和VEGF上调，早期糖尿病视网膜中的Ang-2上调并不会引起血管生成反应(10，42)。关于周细胞一般作用的重要信息，特别是在视网膜中的作用，来自于发育研究。人们认为周细胞和平滑肌细胞的补充以及新的细胞外基质的沉积决定了从未成熟到成熟的毛细血管网络的转变(19)。以前的数据表明，周细胞向视网膜血管的募集标志着可塑性窗口的结束，在此期间，内皮细胞功能受到生长因子的存在或缺失的调节(43)。然而，新数据对这一概念提出了挑战，并证明周细胞存在于萌芽尖端附近(44)。哪些分子信号标志着视网膜血管的最终成熟尚不清楚。更重要的是，就糖尿病视网膜病变的发病机制而言，周细胞在促进视网膜毛细血管的存活方面起着至关重要的作用。糖尿病视网膜病变几乎完全发生在成熟的视网膜中。内皮细胞和周细胞之间的细胞串扰的主动破坏导致异常重塑，而周细胞血管覆盖的完成使内皮细胞难以接受生长因子的调节(8，9，45)。目前尚不清楚发育中的视网膜内皮细胞与成人视网膜内皮细胞不同的相关因素是什么，但当周细胞缺陷持续到成年时，视网膜毛细血管中的无细胞毛细血管会出现适度但显著的增加(10)。此外，根据最近的一项研究，当周细胞对发育中的血管的覆盖不足超过视网膜血管的50%时，血管对周细胞缺乏的反应性存在剂量依赖性效应(23).

周细胞向发育中视网膜毛细血管的募集最初是PDGF受体β依赖性的，而老年小鼠的毛细血管对PDGF-B耗竭具有抵抗力(9)。从这些数据中可以看出，发育中的视网膜中的周细胞控制着萌芽和血管重塑，而在成年/成熟的视网膜中，它们可能是内皮细胞的生存支持细胞。在这种情况下，糖尿病诱导的Ang-2上调可能在血管对高血糖挑战的反应中发挥重要作用。虽然伴随的血管紧张素-1适度上调表明存在抗渗透性和额外的内皮细胞存活促进反应，但血管紧张素-2被认为是周细胞清除的启动子，可能促进内皮细胞的修复，但周细胞的存活促进作用也会随之受损。

糖尿病杂合性Ang-2 LacZ敲除小鼠的数据支持高血糖诱导生长因子上调清除周细胞的模型，其中Ang-2基因剂量减少了50%。我们在这些动物中观察到糖尿病周细胞丢失的完全预防，这表明Ang-2和糖尿病周细胞脱落之间存在因果关系，并且这种效果具有剂量依赖性。尽管周细胞得到了保存，但脱细胞毛细血管的形成受到了显著影响，这表明额外的高血糖相关机制进一步导致糖尿病内皮损伤。有证据表明，与平滑肌细胞相比，内皮细胞表达谷氨酸-1，而在高血糖的情况下，谷氨酸-1没有下调，导致通过糖酵解增加底物流量，增加线粒体活性氧的生成，从而证明了这种机制的存在(36)。活性氧物种的线粒体过度生产通过ROS诱导的聚ADP-核糖聚合酶的激活诱导聚ADP核糖基化，从而抑制糖酵解途径的关键酶。由此产生的代谢集团导致两种重要中间体的形成，即6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛，这两种中间体可激活参与糖尿病并发症发病机制的不同生化途径(46)。从糖尿病Ang-2 LacZ小鼠的实验中可以得出，在周细胞缺失的情况下，这些途径对内皮损伤的相对贡献。

总之，我们的数据表明，Ang-2调节成人视网膜毛细血管周细胞覆盖率，早期糖尿病视网膜病变周细胞丢失是Ang-2上调启动的消除过程的结果。尽管周细胞得到保存，但脱细胞毛细血管并没有被阻止，这表明血管细胞之间存在复杂的相互作用，其中毛细血管内皮谱系的存活具有最高优先级。

这项工作得到了德国糖尿病协会、德国糖尿病协会和海德堡大学曼海姆临床医学院的资助。我们感谢Stan Wiegand博士对手稿的有益评论。