美托洛尔通过上调H9C2细胞中的AKT1–SERCA2级联反应缓解精氨酸加压素诱导的心肌细胞肥大

摘要

背景

心力衰竭患者精氨酸加压素（AVP）升高，血浆AVP浓度升高与疾病严重程度和死亡率呈正相关。美托洛尔（Met）是一种β受体阻滞剂，在临床上广泛用于治疗病理性心脏肥大和改善心脏功能。然而，Met减轻AVP诱导的病理性心肌肥厚的具体机制尚不清楚。我们目前的研究旨在评估Met对AVP诱导的心肌细胞肥大的抑制作用及其潜在机制。

方法

将AVP单独或AVP加Met添加到野生型或AKT1过度表达的大鼠心脏H9C2细胞系中。用细胞表面积和ANP/BNP/β-MHC表达评估肥大程度。Western bolling用于分析AKT1/P-AKT1、AKT2/P-AKT2、总AKT、SERCA2和磷蛋白聚糖（PLN）的表达。用Fluo3-AM测定细胞内钙²⁺商店。

结果

在目前的研究中，我们发现AKT1而不是AKT2介导AVP诱导的心肌细胞肥大的发病机制。AVP持续刺激（48小时）导致H9C2大鼠心肌细胞肥大，导致AKT1（与对照组相比为0.48倍）和SERCA2（0.62倍）下调，PLN上调（1.32倍），细胞质钙浓度升高（1.52倍）。此外，AKT1过表达增加了H9C2细胞中SERCA2的表达（1.34倍），降低了PLN的表达（0.48倍）。此外，我们发现Met可以减弱AVP诱导的AKT1、SERCA2和PLN表达的变化，并降低H9C2细胞的胞浆钙浓度。

结论

我们的结果表明，AKT1–SERCA2级联在AVP诱导的病理性心肌肥大中起着重要的调节途径。

背景

病理性心脏肥大与代谢紊乱、肌节紊乱、钙处理改变以及持续病理性肥大相关，导致心律失常、充血性心力衰竭和猝死[1,2]. 许多神经体液因子，如儿茶酚胺、血管紧张素II和内皮素-1，可导致病理性心肌肥大[三,4]. 精氨酸加压素（AVP）是下丘脑根据动脉压和血浆渗透压的变化而释放的，许多先前的研究表明，AVP可引起外周血管收缩和心脏肥大[5,6,7].

丝氨酸/苏氨酸AKT蛋白激酶，也称为PKB或Rac，由三个亚型组成：AKT1、AKT2和AKT3。AKT1广泛分布于许多组织，AKT2主要表达于肌肉和脂肪细胞，AKT3特异性表达于睾丸和大脑[8]. AKT调节与细胞生长和存活、分化、增殖、生长和代谢有关的几个生物过程[9]. 由于AKT在心脏生长、血管生成和心肌肥大中的作用，AKT也是心血管疾病的重要促因。激素和细胞因子是AKT信号的经典激活剂[10]在病理性肥大中，神经内分泌因子伴随持续超载的生物力学应激诱导PKC、MAPK和AKT等多种信号通路[2].

病理性心肌肥大与心肌收缩力直接相关[11]. 细胞内游离钙增加是心肌细胞收缩的主要原因[12]. 在肥厚心肌细胞中，细胞内收缩钙²⁺舒张钙降低²⁺增加，随后引发一系列病理生理反应。钙的储量²⁺肌浆网（SR）是影响心肌收缩的基本因素。研究表明，心力衰竭（HF）、心肌缺血和其他心脏病都伴随着钙的减少²⁺SR中的存储[13,14,15]. 肌浆/内质网钙²⁺-ATP酶（SERCA）是心脏SR-Ca的一种类型²⁺-ATP酶在心肌细胞钙稳态调节中起重要作用[13,16]. 在舒张过程中，心肌细胞内的钙主要通过肌浆网膜中的SERCA2被重新吸收到SR中，而磷蛋白（PLN）在调节SERCA2活性中起主要作用。当PLN去磷酸化时，PLN与SERCA2结合形成PLN–SERCA2复合物，这降低了SERCA2对Ca的亲和力²⁺当PLN被磷酸化时，PLN–SERCA2复合物解离，SERCA2重新获得其Ca²⁺-结合能力[17].

美托洛尔（Metoprolol，Met）是一种广泛用于抑制心肌肥厚和改善心脏功能的β受体阻滞剂[18,19]. 作为第三代β受体阻滞剂的奈比洛尔在新生儿心肌细胞肥大模型中具有抗肥厚作用[20]. AKT参与β肾上腺素能刺激的糖尿病和抗凋亡作用[21,22]. 然而，AKT是否在心肌肥厚期间介导Met的抑制作用尚不清楚。此外，Met减轻心肌细胞肥大的具体机制亟待研究。因此，我们进行了这项研究，以确定介导AVP诱导肥大的潜在参与者以及Met的保护作用。我们的结果揭示了在AVP诱导的病理性心肌肥厚中Met和AKT1–SERCA2信号通路之间的关系。

结果

AVP对H9C2细胞的增殖作用

我们最初通过将H9C2细胞暴露于AVP 48小时来建立心肌细胞肥大模型。罗丹明-球蛋白（F-actin）染色和定量结果表明，用AVP处理细胞时，细胞表面积增加（平均是对照处理细胞的1.265倍）（图1a、 b）。在AVP刺激的H9C2细胞中，心肌细胞肥大标志物心钠素（ANP）、B型钠尿肽（BNP）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）的mRNA表达水平显著增加（图1c） ●●●●。

图1

AVP导致H9C2细胞肥大表型。一采用F-actin染色（比例尺=200μm）检测AVP处理的H9C2细胞的肥大生长。b条AVP刺激的H9C2细胞表面积的量化。c（c）测定AVP刺激H9C2细胞ANP、BNP和β-MHC mRNA水平。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*与对照组相比P<0.05（续）

AKT1可能参与AVP诱导的H9C2细胞肥大

为了探讨AVP诱导H9C2细胞心肌肥大的潜在机制，我们使用western blot分析相关蛋白的表达水平。与对照治疗相比，暴露于AVP 48小时导致总AKT（0.65倍）、P-AKT1-Thr308（0.70倍）和AKT1（0.74倍）水平显著降低，而AKT2和P-AKT2（Ser474）水平没有改变（图2a、 b，附加文件1：图。S1）。

图2

在AVP诱导的肥大H9C2细胞中，AKT1下调。一通过western blot分析测定AVP处理的H9C2细胞中总AKT、AKT1、磷酸化AKT1（P-AKT1）、AKT2和P-AKT2的表达。GAPDH作为负荷控制。b条AVP诱导的H9C2心肌细胞中总AKT、AKT1、P-AKT1，AKT2和P-AKT2蛋白表达的定量。所有数据均以三个独立实验（标记为1、2和3）的平均值±S.E.M.表示。*表示P<0.05，NS公司与对照组相比不显著

AKT1过表达减弱了AVP诱导的心肌细胞肥大

为了进一步研究AKT1对AVP诱导的心肌肥厚的影响，我们构建了一株AKT1过表达的稳定H9C2菌株（Lentivirus-AKT1）。Western blot分析表明，无论是否有AVP刺激，P-AKT1-Thr308和AKT1在AKT1过度表达的稳定菌株中均显著表达，而AKT2没有改变（图三a、 b）。AVP处理过表达AKT1的H9C2心肌细胞的表面积下调了1.92倍（图三c、 d）。当AKT1过度表达时，ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平也显著降低（图三e） ●●●●。

图3

AKT1过表达抑制了AVP诱导的H9C2肥大。一,b条以AKT1过度表达H9C2稳定菌株GAPDH的P-AKT1（Thr308）、AKT1和AKT2的蛋白表达和定量作为内部对照。c（c）,d日采用α-肌动蛋白染色（比例尺=20μm）测定AVP处理的对照组和AKT1过度表达的H9C2细胞的肥厚水平。e（电子）在AKT1过度表达H9C2稳定株中测量ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*^,#,ΔP<0.05；NS公司不重要*与Con比较；^#与Con+AVP相比；^Δ与LV-AKT1相比

AKT1通过SERCA2/PLN介导AVP诱导的心肌细胞肥大

研究旨在进一步了解AKT1过度表达时心肌细胞肥大的机制。与未经AVP处理的心肌细胞相比，经AVP慢性治疗的心肌细胞中SERCA2蛋白表达显著降低，PLN表达增加。此外，当AKT1过度表达时，SERCA2表达上调，PLN表达下调。在AKT1过度表达的H9C2细胞中，AVP对SERCA2和PLN表达的影响显著减弱（图4a、 b、附加文件1：图S2）。此外，我们检查了细胞内钙的储存，发现细胞内钙²⁺AVP处理后浓度显著增加，而这对细胞内钙的影响²⁺在AVP处理的过度表达AKT1的H9C2细胞中，浓度几乎被消除（图4c、 d）。

图4

AKT1过表达上调SERCA2蛋白表达，下调PLN蛋白表达。一,b条AKT1过表达稳定菌株中SERCA2和PLN的蛋白表达和定量。GAPDH被用作负荷控制。c（c）,d日用Fluo-3/AM测定细胞内钙浓度。荧光（比例尺=100μm）和细胞内钙浓度的定量。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*^{, #,Δ}两者均表示P<0.05*与对照组相比；^#与Control+AVP相比；^Δ与LV-AKT1相比

美托洛尔通过上调AKT1–SERCA2级联反应减轻AVP诱导的心肌细胞肥大

为了检测Met对暴露于AVP的H9C2心肌细胞的保护作用，并研究Met这种保护作用的机制，我们进行了一系列的化学治疗分析。我们发现Met抑制了AVP诱导的H9C2细胞表面积的增加（图5a） 以及ANP、BNP和β-MHC mRNA水平（图5b） 改善了AVP诱导的P-AKT1（Thr308）、AKT1和SERCA2蛋白水平的降低，并抑制了AVP导致的PLN蛋白水平的增加（图5c、 d）。与AVP治疗组相比，Met治疗组的细胞内钙浓度降低（图5e、 f）。

图5

美托洛尔改善了AVP诱导的AKT1和SERCA2蛋白表达水平的下降。一左面板，F-actin染色（比例尺=200μm）测量AVP、Met和Met+AVP处理的H9C2细胞的肥大生长。右侧面板，AVP、Met和Met+AVP诱导的H9C2细胞表面积的量化。b条测定经AVP、Met和Met+AVP处理的H9C2细胞ANP、BNP和β-MHC mRNA水平。c（c）,d日AVP-、Met-和Met+AVP-处理的H9C2细胞中P-AKT1（Thr308）、AKT1、SERCA2和PLN水平的蛋白表达和定量，选择GAPDH作为负荷对照。e（电子）,（f）用Fluo-3/AM测定细胞内钙浓度。AVP-、Met-和Met+AVP-诱导的H9C2细胞中钙浓度的荧光（比例尺=100μm）和定量。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M。^*,#,§两者均表示P<0.05*与对照组相比；^#与AVP比较；^§与Met相比

讨论

高血压应激、心肌损伤或神经体液过动引起的心脏肥大与心脏功能障碍有关，这种情况被称为病理性肥大[2]. 众所周知，AVP可诱导细胞病理性肥大，这是由细胞表面积增加和ANP、BNP和β-MHC表达升高决定的，我们的结果与以前的研究一致[7,23]. 已知的病理性心肌肥大机制包括激活T细胞钙调神经磷酸酶核因子（NFAT）信号、β肾上腺素能受体信号、钙²⁺/钙调素依赖性激酶II信号、cGMP/蛋白激酶G信号、蛋白激酶C和有丝分裂原激活的蛋白激酶信号以及胰岛素受体（IR）/AKT信号[2]. AKT是一种重要的蛋白激酶，在许多生物过程中发挥重要作用。TAC后8周肥厚心脏中P-AKT（Ser473）、P-S6K1和4E-BP1的蛋白水平降低，表明病理性肥厚下调AKT/mTOR通路[24]. AKT1和AKT2是AKT激酶在心脏中表达的主要亚型[25]. 我们的结果表明，在AVP诱导的病理性肥大细胞中，AKT1的总水平和磷酸化水平均下调，但AKT2的水平没有改变。此外，AKT1过表达抑制了AVP诱导的H9C2细胞表面积增加以及ANP、BNP和β-MHC mRNA表达，从而减轻了AVP诱发的心肌细胞肥大。这些结果表明，在介导病理性肥大中起重要作用的特定亚型是AKT1，而不是AKT2。

许多研究表明，由于肥大细胞中SERCA2蛋白水平的降低，钙泵的功能受损，钙的摄取²⁺从细胞质到SR减少，导致细胞质钙超载，进而导致舒张钙短暂延长和心肌收缩力降低[26,27,28]. 由于钙的减少²⁺SERCA2转运到SR的水平，SR中储存的钙不足，导致收缩期钙释放减少和心肌收缩功能障碍[29,30,31]. 然而，AVP影响钙的机制²⁺没有得到很好的研究。我们发现SERCA2在肥厚心肌细胞中的表达降低，这一结果与肥厚表型一致。PLN是Ca-ATP酶的抑制剂，可以抑制Ca²⁺通过与Ca-ATPase（如SERCA2）相互作用进行转运[32]. 在这项研究中，在AVP诱导的肥大中，PLN表达显著上调，PLN的增加导致SERCA2抑制增强，然后细胞内钙的转运²⁺被阻止。这些结果表明，AVP通过调节SERCA2和PLN的表达水平来抑制心功能。此外，我们发现AKT1的表达水平与SERCA2的表达水平和细胞内Ca的浓度呈正相关²⁺AKT1的上调显著减弱了AVP处理H9C2细胞引起的SERCA2和PLN表达的变化。所有这些发现表明AKT1–SERCA2-Ca²⁺信号传导是AVP介导的心脏功能抑制的潜在途径。AKT激酶已被用作多种疾病的潜在基因治疗靶点，如高胰岛素血症、糖尿病和肝细胞癌[33,34,35]. 我们的结果还表明，AKT1可以作为治疗病理性心肌肥厚和改善心脏功能的一个可能的基因治疗靶点。虽然我们的研究表明AKT1–SERCA2级联在AVP诱导的病理性心肌肥大中发挥重要作用，但可能与体内存在一些差异。H9C2细胞最初来源于胚胎心脏组织，但体内心肌细胞具有明确的结构，在心力衰竭时会承受机械负荷。为了更好地理解心脏肥大的相关机制，未来需要进行更多的研究来评估这些发现并确定体内更具体的机制。

美托洛尔是一种选择性β1-肾上腺素受体抑制剂，广泛用于改善心脏功能[36,37]. 许多研究表明，长期服用Met可以下调I型胶原和III型胶原mRNA水平，调节干细胞特性以防止进行性病理重塑，此外，Met还可以改善Ca²⁺野百合碱（MCT）治疗大鼠右心室（RV）心肌细胞的处理和收缩性[18,38,39,40]. 在胚胎发育过程中，β受体的刺激导致AKT磷酸化降低[41]. 在缺血再灌注过程中，PI3K–Akt信号的激活有助于Ca的心脏保护作用²⁺拮抗剂和β受体阻滞剂[42]. 然而，AKT1和Met在AVP诱导的肥大中的关系尚不清楚。在当前的研究中，我们发现Met显著减轻了AVP诱导的肥大，进一步的实验表明，在AVP诱导H9C2细胞肥大的心肌细胞中，AKT1和磷酸化AKT1的水平均升高。上述结果表明AKT1介导了Met的心脏保护功能。此外，在Met治疗AVP诱导的肥大H9C2细胞后，SERCA2的表达上调，而作为SERCA2抑制剂的PLN在Met处理后显著降低。

作为对AVP诱导的反应，AKT1被下调，其对PLN的抑制和SERCA2的上调均被减弱。PLN和SERCA2的这些变化进一步导致细胞内钙超载²⁺许多研究表明细胞内钙²⁺动力学与心脏生理状态和细胞内钙离子密切相关²⁺超载可能导致心脏肥大[43,44,45]. 在Met治疗下，SERCA2的上调和PLN的下调使有效的细胞内Ca²⁺转运，促进细胞内钙²⁺动态平衡，最终减轻AVP诱导的肥大（图6). 总之，我们的结果表明，Met通过AKT1–SERCA2信号通路减轻了AVP诱导的肥大。

图6

Met通过AKT1–SERCA2级联缓解AVP诱导的心肌细胞肥大机制的工作模型。SERCA2泵Ca²⁺进入肌浆网并维持细胞内钙的动态平衡²⁺（左）作为对AVP诱导的反应，AKT1被下调，其对PLN的抑制和SERCA2的上调均被减弱。此外，PLN的上调进一步抑制Ca²⁺通过SERCA2运输。细胞内钙²⁺浓度持续升高，最终导致心肌细胞肥大。（右）在AVP诱导肥大的H9C2细胞中，美托洛尔减弱了AVP对AKT1的抑制作用。AKT1抑制PLN并上调SERCA2²⁺在胞浆中被泵入肌浆网。最终，心肌细胞肥大得到缓解

结论

在本研究中，我们证明AKT1–SERCA2级联在AVP诱导的心肌细胞肥大中起着重要的调节途径作用。首先，我们发现AKT1而不是AKT2介导AVP诱导的心肌细胞肥大的发病机制。第二，AVP通过调节SERCA2的表达和细胞内钙的转运而诱导H9C2细胞肥大²⁺第三，Met通过调节AKT-SERCA2级联来减轻AVP诱导的肥大。

材料和方法

抗体

GAPDH（目录号ab9485）、P-AKT1（Thr308）（目录号ab66134）、P-AKT2（目录号ab38513）、AKT2（产品目录号ab66129）和SERCA2（产品目录编号ab3625）的一级抗体购自美国马萨诸塞州坎布里奇市；AKT1的一级抗体（目录号TA504230）购自DBA Acris抗体（美国马里兰州罗克维尔）；AKT（目录号CS4685）和PLN（目录号14562）的一级抗体来自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州波士顿）。HRP结合的二级抗体（目录号ab6721和ab6885）和FITC-结合的二次抗体（目录编号ab6717）购自Abcam。

材料

[Arg8]-血管加压素醋酸盐（AVP）（目录号V9879）和美托洛尔（Met）（目录编号M1830000）购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。高糖DMEM（目录号SH30243.01）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（目录号SH30256.01）和胰蛋白酶（目录号SH30042.01）购自GE Healthcare（Logan，UT，USA），胎牛血清（FBS）（目录号10270106）和Fluo-3/AM（目录号F1241）由赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）提供。文化菜肴（目录号430166和430167）购自康宁Costar公司（美国马萨诸塞州剑桥）。共聚焦培养皿（目录号801002）来自NEST（中国江苏无锡）。

细胞培养

H9C2细胞系（目录号GNR 5）来自中国科学院细胞库（中国上海），传代号为10–15的细胞用于所有实验。细胞在添加有10%FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM中培养，培养箱温度为37°C，CO浓度为5%₂在与生长条件相同的条件下，用化学品（10μmol/L AVP或Met）处理细胞。

逆转录聚合酶链反应

如前所述进行实时定量PCR分析[46]. 引物序列如表所示1用TRIzol（目录号15596026，美国加利福尼亚州生命技术公司）方法分离总RNA，然后如前所述，使用DNA酶去除内部DNA污染。在逆转录反应中使用随机引物获得第一链cDNA，并使用SYBR Green qPCR Master Mix（目录号FP202，中国北京天根）扩增目标片段。用GAPDH cDNA扩增作为内部对照来分析结果。一般反应程序包括在95℃下初始变性步骤15分钟，然后在95℃进行39个周期的变性10秒，在58.2℃下退火30秒，在72℃下延伸20秒，板在95℃读取5秒。每个实验组进行三个独立的重复，并使用IBM SPSS（版本19）软件分析表达差异。

表1本研究中用于实时qPCR分析的引物

电池表面积测量

如前所述进行F-actin染色以测量细胞表面积[47]. 简而言之，在室温下用4%多聚甲醛固定新鲜制备的H9C2细胞15分钟。用PBS冲洗细胞三次后，将其在室温下用0.5%Triton X-100透化15分钟，用PBS洗涤三次，并在室温下用5µg/mL鬼笔肽染色在黑暗中孵育1小时，以使F-肌动蛋白可视化。用PBS冲洗细胞后，用荧光显微镜（日本东京奥林巴斯IX71）拍摄细胞照片。每个培养皿至少选择五个随机选择的区域，每个区域随机选择20个细胞。使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，Md，USA）定量所选H9C2细胞的2D细胞表面面积。

如前所述进行α-肌动蛋白染色[48]. 简单地说，用4%多聚甲醛固定感染LV-AKT1的细胞，然后用0.5%Triton X-100渗透15分钟。接下来，在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞2小时，然后在4°C下与兔抗肿瘤α-肌动蛋白抗体孵育过夜。然后将细胞与Alexa Fluor 594结合的山羊抗兔IgG二级抗体孵育，并通过共焦显微镜观察。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹[49]. 简单地说，用添加蛋白酶抑制剂的冷冻RIPA缓冲液（目录号WB009，中国西安郭安）溶解细胞，并在12000×克在4°C下保持15分钟。然后，用BCA法测量蛋白质浓度。变性后，用15%或10%SDS-PAGE分离总蛋白，并转移到0.2µm或0.45µm聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%的BSA封闭细胞膜2小时后，在4°C下用稀释在封闭缓冲液中的一级抗体培养细胞膜过夜。用TBST冲洗膜三次，然后在室温下用HRP结合的二级抗体进一步孵育2小时。用TBST清洗膜三次后，添加增强化学发光（ECL）底物，并使用ChemiDoc™XRS+系统（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad）显示目标蛋白带。ImageJ（版本1.46）用于比较目标带的灰度值，GAPDH用作内部控制。

AKT1过表达稳定细胞系的构建

如前所述，构建了过度表达AKT1的慢病毒载体[50]. 大鼠的完整ORFAKT1型将其插入pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro载体，然后将该构建物与pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91质粒一起转染HEK293T细胞。在转染后48小时收集慢病毒颗粒。总计1×10⁵24孔板中一孔的H9C2细胞感染1.2×10的AKT1慢病毒⁵TU，然后在含有10%FBS的高糖DMEM中培养。48 h后，感染细胞以5μg/mL的浓度进行嘌呤霉素选择。选择大约10天后，获得H9C2的单个克隆。通过qPCR和western blot检测AKT1的表达。

细胞内钙浓度的测量（[Ca²⁺])

细胞内钙浓度的测量如前所述进行[51]. 简而言之，用泰罗德的盐溶液清洗细胞三次。然后向细胞中添加500µL Fluo-3乙酰氧基甲酯（Fluo-3/AM，5μmol/L），并在37°C和5%CO中培养细胞30分钟₂在孵育期结束时，用1mL Tyrode的盐溶液轻轻清洗细胞三次。最后，向每组细胞中添加1 mL Tyrode的盐溶液，并在黑暗中培养20–30分钟，以确保细胞中的AM完全酯化。荧光强度由激光扫描共焦显微镜测量，激发波长为488nm，发射波长为525nm。通过固定场摄影记录最大荧光信号，并通过光电倍增管和数字输入相机将信号输入计算机系统。通过ImageJ软件计算平均细胞内荧光强度，以测定细胞内钙²⁺级别。

统计分析

GraphPad Prism 7.0（加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-Software Inc.）用于统计分析。通过单向方差分析（ANOVA）和Bonferroni校正（用于多重比较）或未配对Student t检验确定统计显著性。P＜0.05的值被认为表明具有统计学意义。执行的独立实验数量如图图例所示。