PKCδ激活上调B7-H4表达，并有助于PKCδ诱导的结直肠癌细胞运动

摘要

引言

B7-H4在结直肠癌（CRC）中过表达，在肿瘤生长和免疫抑制中发挥重要作用。然而，调节B7-H4表达的确切机制在很大程度上仍然未知。在此，我们研究了蛋白激酶Cδ（PKCδ）是否调节大肠癌中B7-H4的表达。

方法

通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色，我们分析了225例大肠肿瘤标本中B7-H4和磷酸化PKCδ（p-PKCδ）的表达，并确定了其表达模式的临床意义。利用CRC细胞系HCT116和SW620进行体外实验，以检测PKCδ激活对B7-H4表达的影响，并用罗氏菌素治疗异种移植小鼠，以监测B7-H5的表达和肿瘤转移。

结果

B7-H4表达水平与p-PKCδ水平显著相关（r=0.378，P（P） < 0.001）。p-PKCδ和B7-H4的共表达与中/低分化显著相关(P（P）============================================================================0.024），淋巴结转移(P（P）============================================================================0.001）和高级Dukes阶段(P（P）============================================================================0.002). Western blot分析表明，Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-醋酸酯（TPA）以浓度依赖性方式增加B7-H4的表达，而鹿特伦消除了TPA诱导的B7-H5表达增加。PKCδ特异性siRNA显著降低了B7-H4和p-STAT3的蛋白水平。此外，STAT3抑制剂隐丹参酮显著降低了CRC细胞中的B7-H3蛋白水平。B7-H4或PKCδ的敲除抑制细胞迁移和运动。Rottlerin还抑制体内B7-H4的表达和肿瘤转移。

结论

B7-H4表达水平与大肠癌标本中p-PKCδ水平和肿瘤转移显著相关。通过PKCδ激活STAT3上调B7-H4的表达，并在PKCδ诱导的癌细胞运动和转移中发挥作用，提示PKCδ/STAT3/B7-H4轴可能是CRC的潜在治疗靶点。

引言

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，每年约有30000例新发病例。CRC每年导致13000人死亡，是癌症相关死亡的第四大原因[1,2]. 尽管早期诊断和治疗策略的进步降低了CRC的死亡率，但存活率仍然很低[三,4]. 高死亡率通常归因于肿瘤复发和转移。

B7-H4（VTCN1/B7x/B7S1）是B7家族中的共刺激分子，主要由抗原提呈细胞（APC）表达。B7-H4可以抑制中性粒细胞祖细胞和T细胞的扩张，从而导致免疫抑制[5,6,7]. 在许多肿瘤组织中，B7-H4过度表达，并与各种临床病理特征呈正相关[8,9,10,11,12,13]. B7-H4在大肠癌组织中的表达明显高于正常组织，并且与浸润深度、淋巴结转移和调节性T细胞（Treg）浸润呈正相关[14,15]. 此外，血清中的可溶性B7-H4已被证明是疾病的潜在生物标志物[16,17,18,19]. 许多研究表明，B7-H4除了在免疫抑制中发挥作用外，还促进肿瘤增殖和转移。Li等人发现B7-H4促进CRC细胞的增殖和转移[20]. Zhang等人揭示，B7-H4还促进肺癌生长和转移进展[21]. Xie等人表明，B7-H4通过激活ERK1/2信号通路促进肿瘤侵袭和转移[22]. 总之，B7-H4有助于免疫逃避、肿瘤生长和肿瘤转移，但调节B7-H5表达的确切机制尚不清楚。

蛋白激酶C（PKC）家族由一系列丝氨酸/苏氨酸激酶组成，调节各种细胞生理过程[23,24]. 大肠癌组织中PKCδ水平升高，提示PKCδ在结肠癌发生中具有特殊作用[25,26,27]. PKCδ作为一种独特的新型PKC，在多种癌症中发挥着重要作用，并具有不同的细胞特异性作用[28,29,30]. PKCδ因其抗增殖和促凋亡活性而被认为主要起到抑癌作用。然而，研究发现PKCδ的下调可诱导细胞毒性，并抑制来源于人类乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的培养干细胞样细胞的生长[29,31]. 在结肠癌中，PKCδ可以抑制细胞生长和增殖，并作为促凋亡调节物[32,33]. 此外，许多研究表明PKCδ参与了结肠癌细胞的迁移和侵袭[26,34,35,36].

在本研究中，我们证明了临床CRC样本中B7-H4和p-PKCδ之间的正相关。此外，p-PKCδ⁺B7-H4型⁺表型与肿瘤转移有关。为了在临床样本中验证这一发现，我们研究了PKCδ对B7-H4表达的影响。TPA对PKCδ的激活增强了B7-H4的表达。然而，通过转染特异性小干扰RNA（siRNA）干扰PKCδ表达，可在结直肠癌细胞系中构建下调的B7-H4。此外，PKCδ和B7-H4都有助于CRC细胞的运动。B7-H4的敲除消除了PKCδ诱导的细胞转移，证实了B7-H3介导PKCδ诱发的细胞转移和侵袭。

材料和方法

临床样本

苏州大学第一附属医院批准了我们的实验方案。共采集225例结肠癌组织标本和36例邻近正常组织标本进行免疫组织化学（IHC）分析。所有实验程序都符合《赫尔辛基宣言》（2013年修订）的原则。苏州大学机构审查委员会（编号：2014865082）对涉及临床样本的实验给予了伦理批准。此外，还获得了患者对其样本的实验使用的知情同意。

免疫组织化学和免疫荧光染色

对于p-PKCδ的IHC分析，使用从Abcam（Cambridge，MA，USA）购买的对人p-PKCδ特异性的兔单克隆抗体（磷酸-S299，ab133456），稀释度为1:100。对于B7-H4 IHC染色，在我们的实验室中产生了一种对人B7-H4特异性的小鼠单克隆抗体（克隆3C8，中国苏州），并以1:200的稀释度使用[37]. 对于IF分析，使用Alexa Fluor 488-共轭山羊抗兔IgG（1:100，A32731）和Alexa Fuor 594-共轭山羊抗鼠IgG，1:200，A11005作为Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）的二级抗体。

用Leica切片机（德国Wetzlar）将石蜡包埋样品切片（4µm厚）。如前所述，组织微阵列脱蜡、复水、冲洗并染色以检测B7-H4和p-PKCδ[38]. IHC染色采用ChemMate™Envision/HRP技术（Gene Tech Company Limited）。在低倍镜（100倍）下对切片进行评估，以确定阳性染色。根据B7-H4或p-PKCδ信号阳性细胞的百分率，将样本分为四组：1、阳性细胞少于25%；2，占26-50%；3例，占51-75%；75%以上。根据相对强度将染色强度分为：1、弱染色；2、中间染色；强染色。总得分计算为阳性百分率得分Ⅸ染色强度得分。Quickscore≥4分的病例被视为阳性，其他病例则被视为阴性。两名独立研究人员对染色切片进行了检查和评估。

对于IF分析，如前所述，连续切片在室温下与单克隆抗p-PKCδ、抗B7-H4和/或同型IgG抗体孵育1.5小时[38]. 使用Alexa Fluor 488结合二级抗体检测p-PKCδ。使用Alexa Fluor 594缀合的第二抗体来检测B7-H4。IF图像是在徕卡DM2500显微镜下采集的（德国韦兹拉）。

细胞培养和转染

人CRC细胞系HCT116、SW620、SW480、RKO和NCM460购自上海细胞银行（中国科学院，上海）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养，培养温度为37°C，湿度为5%CO₂.RPMI 1640培养基和FBS购自HyClone（美国犹他州洛根）。PKCδ激活剂TPA、PKCδ抑制剂rottlerin（美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司）和STAT3抑制剂隐丹参酮（美国塞勒克化学公司）储存在−80°C下。

人PKCδ特异性siRNA、人B7-H4特异性siRNAs和相应的对照siRNAs（con-siRNAs）购自GenePharma Co.Ltd.（中国上海）。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将SiRNAs转染到HCT116或SW620细胞。RT-qPCR和Western blotting检测转染效率。

总RNA分离和RT-qPCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离总RNA，在37°C下用无RNase的DNase孵育20分钟，用RNeasy MinElute清洁试剂盒（74204，Qiagen，Hilden，Germany）纯化，并用分光光度计（BioDrop-μLite，UK）定量。使用PrimeScript™RT Master Mix（Takara Bio，Japan）将总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR PrimeScript RT–qPCR试剂盒（日本Takara Bio）检测单个基因。PCR所用的热循环程序如下：95°C 2 min，然后在95°C下进行45次变性循环10 s，在59°C下退火40 s，在72°C下延伸45 s。所有检测基因的水平均归一化为GAPDH mRNA水平。RT-qPCR中使用的单个基因的引物在附加文件中列出7：表S1。

蛋白质提取和蛋白质印迹分析

人CRC细胞在6孔培养板中培养，然后用RIPA裂解缓冲液（中国上海贝尤泰姆）进行裂解。将蛋白酶抑制剂混合物添加到RIPA缓冲液中。在使用BCA蛋白检测试剂盒（中国上海贝尤泰姆）测定所有样品的蛋白质浓度后，将含有等量总蛋白的样品装入凝胶并通过电泳分离。凝胶上的蛋白质带转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（德国默克米利波）。将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜。使用的主要抗体如下：鼠抗人B7-H4（3C8）、兔抗人PKCδ（#9616T，CST，Danvers，Massachusetts，USA）、兔抗人/鼠p-PKCδ，兔抗人/鼠GAPDH（#5174，CST）和兔抗人-鼠β-肌动蛋白（#4970，CST。用PBST清洗三次后，PVDF膜在室温下与二级抗体孵育2小时。二级抗体如下：HRP-结合山羊抗鼠/抗兔IgG（H+L）和兔抗山羊IgG，H+L（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。用PBST清洗膜五次。然后，将膜浸入电化学发光（ECL）检测试剂（CST）中。使用Gel-DocTM EZ系统（美国Bio-Rad）采集图像。使用Image Lab 4.0.1软件（美国Bio–Rad）分析波段强度。

流式细胞术分析和IF分析

为了检测细胞内B7-H4的表达，使用细胞内固定和渗透缓冲液（eBioscience，CA，USA）使细胞渗透。然后，用PE结合的抗B7-H4抗体（#358104，Biolegend，CA，USA）对细胞进行染色。使用PE-结合小鼠IgG1同型对照（eBioscience）作为对照抗体。在Beckman流式细胞仪上进行流式细胞术。使用FlowJo软件（7.6版，Tree Star Inc.）分析数据。

对于细胞中B7-H4表达的IF分析，将培养的细胞用冷丙酮固定10分钟，在含有1%FCS的PBS缓冲液中洗涤，并用PE缀合的抗B7-H4抗体染色。

Transwell侵入试验

转染16h后，用胰蛋白酶消化法获取细胞，并将其重新悬浮在含有10%FBS的培养基中⁴HCT116或8×10⁴将SW620细胞接种在24孔Transwell室中，其中包含孔径为8μm的膜（Falcon，美国）。用100μl 1:16稀释的Matrigel（美国纽约州科宁市）对膜进行预涂。4-6小时后，将每个孔中的培养基换成含有2%FBS和药物或溶剂的培养基。然后，将700μl含有20%FBS的培养基添加到底部隔间中，作为化学引诱剂。培养24小时后，侵入Transwell膜下方的细胞用甲醇固定，并用0.1%结晶紫溶液染色。然后，在尼康TI-SR倒置显微镜下观察染色细胞，并使用尼康DS-Fi2相机成像。ImageJ用于确定三个不同视野中的细胞数量。

伤口愈合试验

为了通过伤口愈合测定来评估迁移，用密度为3×10的细胞接种12孔板⁵细胞/孔。在生长和附着过夜后，用10µl移液管尖端刮伤培养细胞的表面。再培养24小时后，用尼康DS-Fi2相机观察并成像伤口闭合情况。使用ImageJ软件计算伤口闭合百分比。

动物实验

从上海实验动物中心（中国上海）购买10只4-6周龄雌性BALB/c裸鼠。适应1周后，HCT-116细胞（2×10⁶)在PBS中（100μl）静脉注射到裸鼠体内。24小时后，将小鼠随机分为两组：一组小鼠口服200μl溶剂，另一组小鼠每隔两天口服一次鹿特伦（20 mg/kg）。根据我们的初步实验结果和以前的报告确定了鹿特伦的剂量[39,40]. 这些实验中的所有程序都得到了苏州大学动物保护和使用委员会的批准。注射后54天，处死小鼠以评估肿瘤的发展，并将肺部取出并包埋在石蜡中以进行进一步分析。

生物信息学分析

分析COAD患者样本中PKCs和B7-H4表达的相关性。比较TCGA结肠腺癌（COAD）数据集COAD组织和正常组织中PRKCD（编码PKCδ）和VTCN1（编码B7-H4）的mRNA表达。这些生物信息分析通过基因表达谱交互分析（GEPIA）网站进行[41] (http://gepia.cancer-pku.cn). 通过XENA网站对TCGA COAD数据集中B7-H4 mRNA水平与淋巴结转移状态之间的相关性进行了研究。

统计分析

使用GraphPad Prism 5.0版对实验结果进行统计分析。通过χ²测试。相关性采用Spearman秩相关系数进行评估。使用双尾非配对Student t检验评估各组之间的差异。采用配对Student t检验分析重复实验。所有显著性检验均为双尾检验，且P（P） < 0.05被认为是显著的。

结果

大肠癌中B7-H4和p-PKCδ上调

首先，我们基于LinkedOmics和GEPIA数据库分析了CRC患者样本中PKC和B7-H4的表达之间的相关性，发现PKRCA和PRKCD（PKCδ）的表达与B7-H5的表达呈正相关，但只有PKCδ在结直肠癌组织中异常上调（附加文件1：图S1）。然后，我们通过IHC染色评估225例临床大肠肿瘤组织标本和36例邻近正常组织标本的B7-H4和p-PKCδ蛋白水平。IHC染色的代表性图像如图所示1答：在132例CRC组织标本中检测到B7-H4阳性表达（132/225，58.7%），并且B7-H4在结直肠癌细胞的膜、细胞质和细胞核中表达（图1A） ●●●●。在139例CRC组织标本中检测到p-PKCδ阳性染色（139/225，61.8%），并且p-PKCΔ在大肠肿瘤细胞的膜和细胞质中表达（图1A） ●●●●。肿瘤组织与邻近正常组织的比较显示，肿瘤组织样本中B7-H4和p-PKCδ的表达均显著增加（图1B） ，与以前的报告一致[14,25,27,40]. 此外，定量PCR分析表明，与邻近正常组织相比，肿瘤组织中B7-H4和PKCδ的表达显著增加（图1C） 。

图1

临床CRC组织标本中B7-H4和p-PKCδ水平升高。A类B7-H4和p-PKCδ的阴性（400×）、弱（400×。B类大肠癌中B7-H4和p-PKCδ水平显著升高。将大肠癌组织样本中的B7-H4和p-PKCδ水平与相邻正常组织样本进行比较。采用非配对t检验进行统计分析(P（P） < 0.001).C类定量PCR分析表明，与邻近正常结肠组织样本相比，肿瘤组织样本中的B7-H4和PKCδ水平显著升高

大肠癌中B7-H4与p-PKCδ的相关性

IHC染色数据的Spearman相关分析表明，B7-H4蛋白表达与p-PKCδ蛋白表达显著相关（r=0.378，P（P） < 0.001). Pearsonχ2检验分析也表明，B7-H4蛋白表达与p-PKCδ蛋白表达显著相关(P（P） < 0.001）（表1). 在139个p-PKCδ阳性肿瘤样本中，101个（72.7%，101/139）显示B7-H4阳性表达，而在86个p-PKCδ阴性肿瘤样本中，只有31个（36.0%，31/86）显示B7-H4阳性表达。对TCGA结肠腺癌（COAD）数据集的分析表明，PRKCD mRNA水平也与VTCN1（编码B7-H4）mRNA水平呈正相关（图2A） ●●●●。

表1 B7-H4和p-PKCδ在临床CRC组织中的表达

图2

B7-H4和p-PKCδ水平之间的相关性。A类在GEPIA网站上进行TCGA数据集分析(http://gepia.cancer-pku.cn/). 该分析表明，PRKCD（PKCδ）mRNA表达与VTCN1（编码B7-H4）mRNA的表达呈正相关。B类通过Western blot分析测定NCM460、SW480、HCT116、SW620和RKO细胞系中B7-H4和p-PKCδ的蛋白水平。数据表示为平均值±SD值；n个============================================================================三。C类序列p-PKCδ⁺检测肿瘤切片中B7-H4的表达，并在CRC标本中显示阳性染色（400×）的B7-H3和p-PKCδ。对CRC样本进行双IF染色。对CRC组织样本进行p-PKCδ（绿色，200×）和B7-H4（红色，200×）染色。B7-H4型⁺/p-PKCδ⁺在CRC组织标本中发现细胞（深黄色；原始放大）。D类TCGA COAD数据集分析在XENA网站上进行。该分析表明，B7-H4 mRNA水平与淋巴结转移呈正相关

为了验证临床样本中B7-H4蛋白水平与p-PKCδ水平相关的发现，我们检测了CRC细胞系中B7-H4和p-PKCΔ水平。如图所示2B和附加文件2：图S2，B7-H4蛋白水平在HCT116和SW620细胞系中较高，在SW480和RKO细胞系中居中，在NCM460细胞系中低。与此模式一致，HCT116和SW620细胞中的p-PKCδ水平高于其他细胞，验证了CRC细胞系中p-PKCΔ和B7-H4蛋白水平之间的相关性。

总之，对临床CRC样本和CRC细胞株的分析结果表明，B7-H4水平与CRC中的p-PKCδ水平相关。

由于我们发现B7-H4蛋白水平与p-PKCδ水平显著相关，我们进一步研究了B7-H3和p-PKCΔ是否在CRC组织中共存。p-PKCδ的连续截面⁺B7-H4型⁺对CRC标本进行如下系列染色：p-PKCδ的IHC染色，B7-H4的IHC-染色，以及p-PKCΔ和B7-H4.的双重IF染色。着色断面的代表性图像如图所示2C.IHC染色显示两种分子的阳性染色面积相似。双IF染色的合并图像显示绿色和红色荧光信号重叠。IHC和IF染色结果均表明，p-PKCδ和B7-H4在CRC组织中共存。

连续CRC标本染色结果进一步表明，B7-H4在CRC组织中的表达与PKCδ的激活相关。

B7-H4和p-PKCδ的阳性与CRC样本中的肿瘤转移相关

接下来，我们检查了B7-H4和p-PKCδ与临床参数的相关性。如表所示2在225例CRC样本中，B7-H4阳性表达与中/低分化相关（χ2=8.992，P（P）============================================================================0.003），淋巴结转移（χ²============================================================================8.919,P（P）============================================================================0.003）和晚期Dukes期（χ²============================================================================5.427之间，P（P）============================================================================0.02），p-PKCδ阳性与晚期Dukes分期相关（χ²============================================================================4.118,P（P）============================================================================0.042). 值得注意的是，B7-H4和p-PKCδ的共同表达与中度/低分化显著相关（χ²============================================================================5.072,P（P）============================================================================0.024），淋巴结转移（χ²============================================================================10.909,P（P）============================================================================0.001）和晚期Dukes分期（χ²============================================================================10.017,P（P）============================================================================0.002). 通过XENA网站进行的TCGA COAD数据集分析显示，B7-H4 mRNA水平也与淋巴结转移呈正相关（图2D） 。这些结果表明B7-H4和p-PKCδ与肿瘤转移有关。

表2 B7-H4和p-PKCδ与临床参数的关系

激活PKCδ诱导大肠癌细胞株B7-H4表达

由于TPA可以诱导PKCδ主要定位于质膜[26]，我们检测了TPA对CRC细胞系中B7-H4表达的影响。用不同浓度的TPA处理HCT116和SW620细胞20 h，用Western blotting测定B7-H4蛋白水平。如图所示三A和附加文件三：图S3A，用10和50 nM TPA处理20小时有效地增加了p-PKCδ水平，而只有用50 nM的TPA处理才能有效地增加B7-H4水平。100 nM TPA治疗20小时后，PKCδ开始失活，可能是由于TPA慢性治疗的影响[42,43]. 同样，B7-H4表达开始下降的时间点被延迟，所需浓度增加到200 nM。B7-H4表达减少与PKCδ失活之间的延迟可能是由于PKCδ下游信号转导所需的时间。因此，延迟强烈证实B7-H4受PKCδ信号通路调节。分别用PE结合的抗B7-H4抗体和DAPI对HCT116细胞中的B7-H5和细胞核进行染色，然后在共焦显微镜下观察细胞（图三B） ●●●●。结果表明，TPA处理显著提高了B7-H4阳性细胞的百分比。此外，细胞系用一种PKCδ抑制剂rottlerin处理。Rottlerin抑制PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ、PKCη、CKII和PKA，低浓度时优先抑制PKCδ活性，高浓度时抑制其他PKC亚型[44]; 因此，我们使用浓度为1-2μM（低浓度）的罗特勒林来研究PKCδ对B7-H4的抑制作用。结果表明，鹿特伦在HCT116和SW620细胞系中以浓度依赖的方式有效降低了B7-H4蛋白水平（图三C和附加文件三：图S3B）。流式细胞术分析还表明，TPA增加了HCT116和SW620细胞系中B7-H4的表达，而罗氏菌素降低了B7-H5的表达（图三D） 。然后，首先用1μM罗氏菌素处理HCT116和SW620细胞系，然后用100 nM TPA处理。该实验表明，鹿特伦有效地消除了TPA诱导的B7-H4表达增加（图三E和附加文件三：图S3C）。

图3

PKCδ介导CRC细胞株中B7-H4的上调。用不同浓度的TPA处理HCT116和SW620细胞(A类)或罗特勒林(C类)持续20小时。B类分别用PE结合的抗B7-H4抗体和DAPI对HCT116细胞的B7-H5和细胞核进行染色。D类流式细胞术分析用于检测经TPA或rottlerin处理的HCT116和SW620细胞中B7-H4表达的变化。用TPA或rottlerin处理CRC细胞24 h，用流式细胞术检测细胞内B7-H4的表达。E类HCT116和SW620细胞系用1μM鹿特伦和100 nM TPA处理24 h，并用Western blotting测定B7-H4水平。左侧面板中显示了一个具有代表性的Western blot图像。右侧面板显示了三个独立实验中B7-H4表达的统计分析（平均值±SD）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

PKCδ激活上调CRC细胞系中B7-H4的表达

在使用PKCδ激活剂和PKCδ抑制剂后，我们降低了PKCδ的表达，并检测了对CRC细胞系中B7-H4表达的影响。如材料和方法部分所述，在HCT116和SW620细胞中PKCδmRNA表达被抑制。与模拟组相比，治疗组的PKCδmRNA水平显著降低（图4A） ●●●●。Western blot分析表明，PKCδsiRNA/HCT116和PKCδsiRNA/SW620细胞系中PKCδ和B7-H4蛋白水平显著降低（图4B和附加文件4：图S4A）。用TPA处理con-siRNA和PKCδ-siRNA细胞系，发现PKCδ敲除可以消除TPA诱导的B7-H4表达增加（图4C和附加文件4：图S4B）。综上所述，这些数据表明PKCδ敲除下调了CRC细胞中B7-H4的表达。

图4

PKCδ基因敲除抑制了大肠癌细胞株中B7-H4的表达。用PKCδ特异性siRNA处理HCT116和SW620细胞45小时。通过定量RT-PCR测定B7-H4和PKCδ水平(A类)和蛋白质印迹(B类). 用PKCδ特异性siRNA处理HCT116和SW620细胞24小时，然后用TPA（100 nM）孵育20小时(C类). 收集细胞生成全细胞裂解物，通过Western blot分析检测指示的蛋白质。显示了来自三个单独实验的代表性Western blot和B7-H4表达数据（平均值±SD）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

STAT3介导的PKCδ诱导的CRC细胞系B7-H4上调

接下来我们探索了PKCδ介导B7-H4表达的信号通路。先前的研究表明，活化的STAT3可以与B7-H4启动子结合，并增强小胶质细胞中B7-H5蛋白的表达[45]. 此外，PKCδ是角质形成细胞和黄体细胞中STAT3磷酸化的主要调节因子[46,47]. 因此，我们假设活化的PKCδ可以通过增加CRC细胞中STAT3的磷酸化来诱导B7-H4的表达。Western blot分析显示，PKCδsiRNA CRC细胞中B7-H4和p-STAT3的水平降低（图5A和附加文件5：图S5A）。此外，我们观察到隐丹参酮（一种STAT3磷酸化抑制剂）以浓度依赖的方式显著降低HCT116和SW620细胞中的B7-H4蛋白水平（图5B和附加文件5：图S5B）。这些结果表明，PKCδ可以通过STAT3信号通路调节大肠癌细胞中B7-H4的表达。

图5

PKCδ通过STAT3抑制CRC细胞株中B7-H4的表达。PKCδ特异性siRNA处理降低HCT116和SW620细胞中B7-H4和STAT3的表达(A类). 用不同浓度的STAT3抑制剂隐丹参酮处理HCT116和SW620细胞(B类)持续24小时。收集细胞生成全细胞裂解物，通过Western blot分析检测指示的蛋白质。显示了来自三个单独实验的代表性Western blot和B7-H4表达数据（平均值±SD）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

PKCδ/B7-H4轴促进CRC细胞运动

由于临床样本和数据集的分析表明，B7-H4和p-PKCδ与CRC转移相关，我们进一步研究了CRC细胞的侵袭和迁移是否通过PKCδ/B7-H4轴介导。此前，已经建立了PKCδsiRNA/HCT116和PKCδsiRNA/SW620细胞系。在此，我们建立了B7-H4 siRNA/HCT116和B7-H4-siRNA/SW620细胞系（图6A和附加文件6：图S6A）。Transwell分析显示，B7-H4或PKCδ表达的下调抑制了CRC细胞的构成性侵袭（图6B和附加文件6：图S6B），表明B7-H4和PKCδ促进细胞运动。此外，我们发现TPA治疗24小时后药物诱导PKCδ表达有效增强了细胞侵袭（图6C） ●●●●。然而，B7-H4的敲除阻止了入侵的增加（图6C） 表明B7-H4在PKCδ激活诱导的细胞侵袭中发挥作用。

图6

PKCδ/B7-H4轴促进了HCT116细胞的迁移。用PKCδ特异性siRNA和/或B7-H4特异性siRNAs处理HCT116细胞45 h，然后通过Western blot分析测定B7-H5蛋白水平(A类). 采用Transwell法检测B7-H4 siRNA/HCT116、PKCδsiRNA/HCT116，PKCδsiRNA+B7-H4-siRNA/HCT116和con-siRNA/HCT 116细胞的构成性侵袭(B类). 用100 nM TPA处理细胞24小时后，评估B7-H4 siRNA/HCT116细胞的侵袭性(C类). 通过伤口愈合试验评估PKCδ和B7-H4对细胞迁移的影响(D类). 实验一式三份*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001

为了评估PKCδ和B7-H4对细胞迁移的影响，我们进行了伤口愈合试验。显示伤口闭合的图像如图所示6D和附加文件6：图S6B。敲低PKCδ或B7-H4表达可有效抑制细胞运动。TPA处理有效地增强了con siRNA/HCT116细胞的活力，但在B7-H4 siRNA/HCT116和PKCδsiRNA/HCT116细胞中这种作用明显减弱。细胞活力也通过伤口愈合测定法进行评估。TPA治疗组和对照组之间没有差异（数据未显示）。

Rottlerin抑制小鼠B7-H4表达和肿瘤转移

为了验证PKCδ/B7-H4轴对体内肿瘤转移的影响，我们向HCT116荷瘤裸鼠体内注射罗特林。Rottlerin治疗显著减少了肺转移（图7A和B）。IHC结果表明，经鹿特伦治疗的小鼠肺组织中人B7-H4和p-PKCδ的水平降低（图7C类；每组三只小鼠的肺组织）。这些结果表明，与对照组相比，洛氏菌素通过PKCδ/B7-H4轴抑制结肠癌转移。

图7

A类注射HCT116细胞54天后，小鼠肺转移性结节的典型图像出现。按照“材料和方法”一节中的说明处理隔离的肺部。比例尺，5 mm。B类,C类肺转移性结节的典型图像和H&E染色。红色箭头表示肺部有转移性结节。H&E染色用于评估一对小鼠的肺微转移A类.D类两组p-PKCδ和B7-H4的免疫组化分析。数据显示为平均值±SD值(n个============================================================================5只动物/组）*P<0.05**P<0.01

讨论

CRC细胞迁移和侵袭与CRC患者术后转移和生存不良的发生有关；因此，我们需要找到新的CRC疗法来阻止转移。作为PKC家族的一个新成员，PKCδ可以独立于Ca激活²⁺和磷脂，具有多种与癌症进展相关的功能，包括癌细胞的增殖、存活、凋亡和运动功能[30]. PKCδ通过IGF-I信号通路参与结肠上皮细胞迁移[34]. 尽管一些研究发现大多数原发性CRC肿瘤和一些CRC细胞系中PKCδmRNA表达降低，但在一部分结直肠癌中p-PKCδ水平升高，这种增加还可以通过增强KITENIN的表达以及HuR和Trop-2的磷酸化来增强结肠癌细胞的迁移和侵袭性[26,27,36]. B7-H4的敲除通过各种信号通路有效抑制CRC细胞、胃癌细胞和肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[20,21,48]. PKCδ和B7-H4均参与肿瘤转移；因此，我们试图研究PKCδ、B7-H4与大肠癌转移的相关性。

在这项研究中，我们评估了肿瘤细胞中p-PKCδ和B7-H4的蛋白水平，发现一些大肠肿瘤样本中的p-PKCΔ水平增加（139/225，61.8%）。对相同组织连续切片的IHC分析表明，101个p-PKCδ⁺样本也表达B7-H4（72.7%，101/139），IF染色结果进一步证实了这一发现。IHC结果显示p-PKCδ⁺B7-H4型⁺结直肠癌标本的表型与中/低分化、淋巴结转移和晚期Dukes分期显著相关。因此，我们推测PKCδ激活的程度与B7-H4水平有关，并在癌症进展中发挥重要作用。

据报道，许多炎症介质可以上调B7-H4的表达。在肾癌细胞系中，发现IFN-α、IL-2和IFN-γ上调B7-H4的表达[49]. 在人类卵巢癌和胶质瘤癌中，肿瘤相关Tregs触发巨噬细胞分泌IL-10和IL-6，激活STAT3并诱导B7-H4转录[50,51]. 在人类肺癌中，肿瘤相关巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10和IFN-γ，诱导肺癌细胞中B7-H4的表达[52]. 我们之前的研究表明，肺癌中B7-H4可以通过MEK/ERK1/2信号通路通过IGF1R激活上调[53]. 在多发性骨髓瘤中，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）可以与B7-H4启动子结合并诱导B7-H5表达[54]. 此外，NF-κB（P65）通路可以增加肝细胞癌（HCC）组织中PD-L1和B7-H4的水平[55]. 最近的一项研究表明，TGF-β1驱动的SMAD3/4信号传导可增加CRC中B7-H4的表达[56]. 大多数研究都确定了B7-H4表达的触发因素，但调控B7-H3表达的确切信号通路仍需进一步阐明。

在本研究中，我们发现CRC细胞系中p-PKCδ和B7-H4的蛋白水平高于正常细胞系。PKC激活剂TPA以浓度依赖的方式增加HCT116和SW620细胞中的B7-H4水平。为了证实B7-H4受PKCδ激活的调节，使用了特异性PKCδ抑制剂rottlerin和PKCδ特异性siRNA。最初，由于与ATP竞争PKC中的ATP结合位点，发现鹿特伦蛋白部分抑制PKC，并且鹿特伦的结构对PKCδ同工酶更具选择性[44]. 然而，随后的一系列研究表明，鹿特伦可以抑制激动剂诱导的PKCδ移位，从而抑制PKCδ活性[57,58]. 不管确切的机制如何，所有这些研究都表明，鹿特伦可以选择性地抑制PKCδ的激活。因此，在本研究中，我们使用罗氏菌素作为特异性PKCδ抑制剂。结果表明，鹿特伦降低了B7-H4的表达，并消除了TPA诱导的B7-H3表达增加。此外，用PKCδ特异性siRNA处理也能有效降低B7-H4水平，并消除TPA诱导的B7-H3表达增加。总的来说，这些结果证实了临床样本的研究结果，并证实了PKCδ激活可以上调B7-H4的表达。此外，PKCδsiRNA处理也降低了STAT3的活性。STAT3抑制剂隐丹参酮以浓度依赖的方式显著降低CRC细胞系中的B7-H4蛋白水平。这些结果表明，PKCδ可以通过STAT3调节B7-H4的表达。我们还研究了PKCδ是否通过MEK/ERK1/2途径促进CRC细胞中B7-H4的表达，但我们没有发现相关的变化（数据未显示）。以往的研究表明，PKCδ在结肠癌细胞迁移和侵袭中起重要作用。B7-H4通过靶向血管生成因子MMP2、MMP9和VEGF，增加细胞迁移和侵袭。B7-H4过表达激活多种信号通路，如NF-κB、ERK1/2、AKT/STAT3和PI3K/AKT/mTOR通路，促进上皮-间质转化（EMT）和癌细胞侵袭[20,22,59,60]. 在这里，我们还进行了Transwell侵袭和伤口愈合试验，以评估CRC细胞的运动能力。我们发现，B7-H4或PKCδ的敲低抑制了细胞运动，并抑制了TPA对细胞侵袭和迁移的增强作用。我们还发现，罗特勒林治疗可显著抑制体内B7-H4的表达和肿瘤转移。本研究中使用的罗勒林剂量（20 mg/kg）低于先前研究中确定的安全剂量。

总之，我们的结果确定了在结直肠癌细胞中构成活性的典型PKCδ/STAT3/B7-H4信号通路。B7-H4表达被PKCδ激活上调，并有助于PKCδ诱导的细胞运动，这在CSC的免疫逃逸中起作用。这一结果提示B7-H4和PKCδ可能是肿瘤转移的治疗靶点。临床使用PKCδ抑制剂时，考虑对B7-H4表达的影响可能很重要。