微小RNA-133b/EGFR轴通过抑制失巢细胞耐药性和锚定非依赖性生长调节食管鳞状细胞癌转移

摘要

背景

Anoikis耐药性已被证明有助于癌症的远处转移。发现MicroRNA-133b（miR-133b）在各种肿瘤中下调，包括食管鳞癌（ESCC），并与ESCC的恶性表型密切相关。本研究旨在评估miR-133b通过调控失巢凋亡在食管鳞癌转移中的作用。

方法

检测miR-133b及相关分子在ESCC组织和细胞中的表达。miR-133b与表皮生长因子受体（EGFR）之间的靶向关系通过双荧光素酶报告分析得到验证。细胞增殖通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化法检测。Anoikis和凤尾鱼非依赖性生长通过Anoikis试验和软琼脂试验进行评估。通过划痕和穿孔分析评估迁移和侵袭。采用逆转录定量聚合酶链反应和western blotting检测相关分子的表达。体内结果通过裸鼠体内的肿瘤移植进行测定。

结果

ESCC组织和细胞中MiR-133b水平降低，这与EGFR、整合素β4（ITGB4）和磷酸化黏着斑激酶水平呈负相关。此外，miR-133b下调了ESCC细胞中EGFR的表达。miR-133b的过度表达通过靶向EGFR抑制ESCC细胞的抗失巢、迁移、侵袭和上皮-间质转化。最后，miR-133b过度表达抑制了体内ESCC的肿瘤生长和肺转移。ITGB4/FAK/生长因子受体结合蛋白2（Grb2）、蛋白激酶B（AKT）和细胞外信号调节激酶（ERK）通路参与了体内外ESCC转移中miR-133b/EGFR轴的调控机制。

结论

结果表明，miR-133b/EGFR轴通过ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK通路影响失巢凋亡抵抗来调节ESCC的转移。

背景

食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要组织学类型，是中国第四常见的癌症[1,2]. 已证明食管鳞癌进展迅速，潜在侵袭力强，转移率高，生存率低[三]. 目前，手术、化疗和放疗是食管鳞癌的常用治疗方法。然而食管鳞癌的预后仍然很差，5年生存率仅为15–25%[4,5]. 区域性或远处转移是食管鳞癌复发和预后不良的危险因素。因此，迫切需要寻找新的标志物并研究复发和转移的机制，以提高ESCC患者的生存率。

微RNA（MicroRNAs）是一种短的内源性非编码RNA，通过与3′-非翻译区（3′-UTR）结合来抑制其靶基因的表达。越来越多的证据表明，一些miRNAs异常表达，并在调控ESCC的生长和转移中发挥关键作用。miR-133b是一种已被证实的miRNAs，它是一种抑制多种癌症进展的肿瘤抑制因子[6,7,8]. 在食管鳞状细胞癌中，miR-133b也被证实下调并参与食管鳞状上皮细胞癌的恶性表型[9,10]. 然而，miR-133b在食管鳞癌发生发展中的调控机制尚未完全阐明。

表皮生长因子受体（EGFR）属于人类表皮生长因子感受器家族，作为原癌基因发挥作用，促进细胞生长和转移[11]. 先前的研究表明，miR-133b可以通过靶向多种癌细胞中的EGFR来抑制细胞的侵袭和转移[12,13,14]，包括卵巢癌、非小细胞肺癌和结直肠癌。然而，miR-133b是否可以通过调节EGFR的表达来调节ESCC的转移尚不清楚。

Frisch和Francis于1994年首次发现了anoikis[15]. 失活是一种程序性细胞死亡，在细胞与细胞外基质（ECM）分离后阻止细胞生长[16]. 然而，基因表达的紊乱帮助癌细胞逃避失巢凋亡，从而导致淋巴、血液中癌细胞的存活，并促进其区域或远处转移[17,18]. 因此，诱导癌细胞失巢凋亡可能是抑制肿瘤转移的有效治疗方法。之前的一项研究表明N个-乙酰氨基葡萄糖转移酶V基因促进肿瘤转移过程中抗失巢凋亡[19]. Hu等人证明诱导caspase介导的失巢凋亡抑制肝细胞癌的进展[20]. 非锚定生长是高度侵袭性肿瘤细胞的一个特征，因为这些细胞在缺乏细胞外基质的情况下有更好的生存和增殖机会，然后扩张和侵袭邻近组织，进而引起转移[21]. Anoikis抗性是凤尾鱼非依赖性生长的重要保护过程[22]. 研究表明，促进凤尾鱼非依赖性生长有助于肺癌细胞的侵袭和进展[23]. 但到目前为止，miR-133b/EGFR轴在调控ESCC抗失巢凋亡和锚定非依赖性生长中的作用尚未见报道。

研究表明，EGFR与整合素β4（ITGB4）协同促进肝细胞癌的非依赖性生长和转移[24]. ITGB4属于整合素家族，据报道通过调节失巢凋亡影响肿瘤进展。粘着斑激酶（FAK）是一种介导细胞粘着的蛋白酪氨酸激酶，FAK的激活可以通过下游磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）途径连接整合素的构象以促进细胞增殖，最终导致失巢抗性[25]. 生长因子受体结合蛋白2（Grb2）是整合素粘合剂的一员，对肿瘤的恶性进展至关重要[26]. 先前的研究发现，Grb2/细胞外信号调节激酶（ERK）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3信号通路参与了乳腺癌细胞对失巢凋亡的抵抗[27]. 此外，Grb2被认为与FAK结合并调节黑色素瘤的增殖和侵袭[28]. AKT和ERK是受Grb2调控的两条重要下游信号通路，进而促进肿瘤进展[29,30]. 因此，ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK通路参与调控失巢凋亡抗性。

在本研究中，我们通过ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK信号通路调节anoikis抵抗和锚定非依赖性生长，研究miR-133b/EGFR轴在ESCC转移中的作用。该研究从临床、细胞和动物水平进行，为miR-133b作为治疗ESCC转移的靶点提供了证据。

方法

患者样本

从新疆医科大学附属肿瘤医院（中国新疆乌鲁木齐）知情同意的患者中采集30对食管鳞癌组织和相应的邻近正常组织。实验方案得到新疆医科大学附属肿瘤医院研究伦理委员会的批准。所有患者术前均未接受化疗或放疗。食管鳞癌患者的特征如表所示1.样品立即在液氮中冷冻，直至进一步分析。

表1纳入研究的食管鳞癌患者的特征

细胞培养和转染

人类ESCC细胞系KYSE30、KYSE150和ECa109（中国科学院类型培养标本，中国上海）在添加10%胎牛血清（FBS）的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640中培养。正常人食管上皮细胞系Het-1A（Cobioer Biosciences，南京，江苏，中国）保存在含有10%FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中。所有细胞在37°C的含5%CO的湿空气中培养₂.

用miR-133b agomir/antagomir（中国上海基因制药公司）或shEGFR（基因制药公司，使用Lipofectamine）转染KYSE150和ECa109细胞^R（右）RNAiMAX转染试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）符合说明。

双荧光素酶报告分析

含有EGFR野生型（WT）或突变型（MUT）3′-UTR的质粒来自GeneCopoeia（中国广东广州）。将HEK-293T细胞接种到96-well板中，并使用100 ng荧光素酶报告基因构建物（EGFR-WT或EGFR-MUT）和100 nM miR-133b agomir或miR-133 b阴性对照物（使用Lipo2000（Invitrogen））共同转染。在转染后48小时，使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）评估荧光素酶活性。进行了三次双荧光素酶报告试验。

3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定

MTT法检测细胞增殖情况。简言之，将转染的细胞接种到96孔板中并孵育24小时。然后在指定的时间点，将5 mg/mL MTT（Sigma，Saint-Louis，MO，USA）添加到每个孔中。培养4 h后，去除上清液，并添加200μL二甲基亚砜（DMSO，Sigma）以溶解甲赞产品。通过微孔板读取器（BioTek，Winsky，Vermont，USA）在490nm处读取结果。

Anoikis评估分析

将KYSE150和ECa109细胞接种到poly-Hema（Sigma）预涂层板中，并在37°C下培养24小时。然后，收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，并根据制造商的说明使用Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen™，美国新泽西州富兰克林湖）进行流式细胞术分析。

凤尾鱼非依赖性生长的软琼脂克隆试验

大约1500个细胞/孔悬浮在含有0.25%琼脂糖的预加热培养基中，并接种在培养基中预先涂有0.5%琼脂酶的培养皿中。细胞在37°C和5%CO下培养2-3周₂大气。在光学显微镜下对形成的菌落进行计数和成像（日本东京奥林巴斯）。

划痕试验

用划痕法测定细胞迁移能力。简言之，转染细胞（0.5×10⁶细胞/孔）接种到6孔板中。然后，使用10μL移液管尖端在融合的单层细胞中划痕。在用PBS清洗去除细胞碎片后，立即用光学显微镜拍摄图像。然后将细胞在37°C的无血清培养基中保存24小时并拍照。细胞迁移率的测量公式如下：（W_0小时 − W公司_24小时)/W公司_0小时 × 100%.

Transwell分析

细胞侵袭能力通过跨阱实验进行评估。将无血清培养基中的细胞接种在经Matrigel预涂层的transwell室（Corning，Corning，MA，USA）的上部隔室中。作为化学引诱剂，在底部隔室中添加含有20%FBS的RPMI1640。在37°C下培养16小时后，用棉签擦除上表面的非浸润细胞，用4%多聚甲醛固定下表面的浸润细胞，并用Giemsa染色。这些图像是在光学显微镜下随机拍摄的（日本东京奥林巴斯）。

裸鼠肿瘤异种移植

雄性7周龄BALB/c裸鼠购自中国科学院（中国上海），并保持在无致病条件下。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。为了评估miR-133b在肿瘤形成中的作用⁶将感染表达miR-133b-agomir或miR-133b NC慢病毒的KYSE150和ECa109细胞（GeneChem，中国上海）皮下注射到裸鼠腋下。将小鼠随机分为四组（每组5只）：KYSE150-miR-133b NC、KYSE150miR-133b-agomir、ECa109-miR-133b NC和ECa109-miR-133bagomir。每隔5天测量肿瘤的长度和宽度，并根据0.5×长×宽的公式计算肿瘤体积²注射后30天，处死小鼠，收集肿瘤并称重。确定肺转移，5×10⁶将上述细胞经尾静脉注入裸鼠体内。30天后，杀死小鼠，收集肺组织，并将其储存在液氮中进行进一步测试。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测

通过Trizol（Invitrogen，USA）从ESCC组织和细胞中分离总RNA，并使用PrimerScript RT试剂盒（TaKaRa，Osaka，Japan）逆转录。使用SYBR Green RT-qPCR SuperMix Kit（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）和特定引物（表2)AB7300热回收器（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和U6小核RNA（U6-snRNA）分别用作mRNA和miRNA的内部对照。miR-133b和mRNA的水平由2^-ΔΔCt方法。

表2实时PCR的寡核苷酸引物集

蛋白质印迹分析

用放射免疫沉淀法（RIPA）（中国江苏省海门市贝尤泰姆）从ESCC组织和细胞中提取含有1%苯甲烷磺酰氟（PMSF）的蛋白质，然后在14000℃离心克在4°C下保持10分钟。收集上清液中的蛋白质，并使用双茚二酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行定量。然后对40µg蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移到聚偏氟乙烯膜上（美国马萨诸塞州米利浦）。随后，将膜与5%脱脂牛奶孵育1小时，以阻止非特异性结合，并用抗EGFR（1:2000，Abcam，Cambridge，UK）、ITGB4（1:1000，Abcam）、p-FAK（1:1000；Abcam）、FAK（1-1000，Abcam）、纤维结合蛋白（1:1000）、波形蛋白（1:11000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）、，N-cadherin（1:1000，细胞信号技术）、E-cadherin_Thr308型（1:1000，细胞信号技术），p-AKT_Ser473系列（1:2000，细胞信号技术）、AKT（1:1000，细胞信息技术）、p-ERK1/2（1:1000、Abcam）、ERK1/2、GAPDH（1:5000、Proteintech）分别在4°C下过夜。然后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠或抗兔（1:5000，Beyotime）二级抗体孵育1h，并使用ECL试剂（Millipore）进行可视化。

统计分析

所有实验均至少进行了三次，并显示了一个具有代表性的实验。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。使用Student’st吨使用SPSS软件13.0版进行两组间的检验（双尾）或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey事后检验进行多重比较。在第页 < 0.05.

结果

食管鳞癌组织样本中miR-133b、EGFR、ITGB4和FAK的水平

首先，采用RT-qPCR方法检测30对食管鳞癌组织及邻近正常组织中miR-133b水平、EGFR、ITGB4 mRNA水平。食管鳞癌患者的临床病理特征如表所示1如图所示1a、 与正常组织相比，肿瘤组织中miR-133b水平降低，EGFR和ITGB4 mRNA水平升高。此外，进行了蛋白质印迹分析以进一步验证上述结果。如图所示1b、 c，与正常组织相比，肿瘤组织中EGFR、ITGB4和p-FAK的蛋白水平升高。从这些结果中，我们发现miR-133b水平与肿瘤组织中EGFR和ITGB4水平呈负相关，这可能参与了ESCC的转移。

图1

ESCC组织样本中miR-133b、EGFR、ITGB4和FAK的水平。一采用RT-qPCR方法检测30对食管鳞癌组织及相应邻近正常组织中miR-133b水平、EGFR和ITGB4 mRNA水平。b条western blotting法检测食管鳞癌组织和邻近正常组织中EGFR、ITGB4、p-FAK和FAK的蛋白水平。c（c）定量分析了谱带的灰度值。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

ESCC细胞系中miR-133b、EGFR、ITGB4和FAK的水平

接下来，我们在细胞水平上研究了三种ESCC细胞系（包括KYSE150、KYSE30和ECa109）和正常人食管上皮细胞系Het-1A中miR-133b、EGFR和ITGB4的水平。与组织样品中的结果一致，与正常Het-1A细胞相比，三种ESCC细胞系中miR-133b的水平显著降低，而EGFR和ITGB4 mRNA的水平显著增加（图2a） ●●●●。正如预期的那样，KYSE150、KYSE30和ECa109细胞中EGFR、ITGB4和p-FAK的蛋白水平显著增强（图2b、 c）。因此，在ESCC细胞中进一步证实了miR-133b与EGFR、ITGB4之间的负相关。选择KYSE150和ECa109细胞进行以下实验。

图2

ESCC细胞系中miR-133b、EGFR、ITGB4和FAK的水平。一采用RT-qPCR方法检测食管鳞癌细胞系和正常人食管上皮细胞系中miR-133b水平、EGFR和ITGB4 mRNA水平。b条western blotting检测食管鳞癌细胞系和正常人食管上皮细胞系EGFR、ITGB4、p-FAK和FAK蛋白水平。c（c）定量分析了谱带的灰度值。d日显示了EGFR mRNA 3′-UTR中miR-133b的特异结合位点和突变结合位点。WT，野生型；MUT，突变型。e（电子）与EGFR报告子和miR-133b-agomir或miR-133b NC共转染48小时后的相对荧光素酶活性。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

MiR-133b调控ESCC细胞系EGFR的表达

为了评估EGFR是否为miR-133b的靶基因，进行了双荧光素酶报告基因分析。将EGFR的WT或MUT 3′-UTR构建成荧光素酶系统。结果表明，miR-133b的过度表达抑制了EGFR的WT 3′-UTR的荧光素酶活性，但不影响EGFR的MUT 3′-UTR的荧光素酶活性（图2d、 e）。此外，我们研究了miR-133b对ESCC细胞中EGFR表达的调节作用。为此，采用miR-133b的agomir或antagomir调节miR-133 b水平，shEGFR沉默EGFR在ESCC细胞中的表达。如图所示三a、 b，转染miR-133b-agomir显著上调KYSE150和ECa109细胞的miR-133b水平，同时抑制EGFR mRNA水平。shEGFR能有效抑制EGFR mRNA水平，但对miR-133b水平无影响。然而，与shEGFR和miR-133b antagomir联合转染显著抑制了miR-133 b水平，并逆转了shEGFR诱导的EGFR mRNA水平（图三a、 b）。此外，miR-133b-agomir或shEGFR处理可以降低KYSE150和ECa109细胞中EGFR的蛋白水平。与shEGFR组相比，shEGFR和miR-133b antagomir联合转染组的EGFR蛋白水平升高（图三c、 d）。根据这些结果，EGFR被证实是ESCC细胞中miR-133b的靶基因。

图3

MiR-133b调节ESCC细胞中EGFR的表达。一,b条用RT-qPCR检测miR-133b NC、miR-133b-agomir、shEGFR、miR-133b-antagomir和shEGFR转染KYSE150和ECa109细胞后miR-133bmRNA水平和EGFR mRNA水平。c（c）western blotting检测KYSE150和ECa109细胞EGFR蛋白水平。d日定量分析了谱带的灰度值。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

MiR-133b通过调控EGFR抑制ESCC细胞的增殖、抗失巢凋亡和锚定非依赖性生长

MTT法检测KYSE150和ECa109细胞的增殖情况。观察到细胞增殖受到miR-133b agomir或shEGFR的抑制。然而，miR-133b antagomir明显抑制shEGFR诱导的KYSE150和ECa109细胞增殖的下降（图4a） ●●●●。此外，miR-133b agomir或shEGFR处理促进了KYSE150和ECa109细胞的凋亡并抑制了失巢细胞耐药性，而miR-133b antagomir削弱了shEGFR处理对失巢细胞耐药性的影响（图4b、 c）。如图所示4d、 e，用软琼脂克隆法测定细胞凤尾鱼的非依赖性生长。结果表明，与miR-133b NC或shNC组的细胞相比，用miR-133b agomir或shEGFR转染的KYSE150和ECa109细胞形成的集落要少得多。然而，miR-133b antagomir显著增加了转染shEGFR的KYSE150和ECa109细胞形成的集落数量。因此，miR-133b通过调节EGFR显著抑制ESCC细胞的增殖、抗失巢凋亡和锚定非依赖性生长。

图4

MiR-133b通过调节EGFR抑制ESCC细胞的增殖、抗失巢凋亡和锚定非依赖性生长。一MTT法检测不同治疗组KYSE150和ECa109细胞的增殖情况。b条将KYSE150和ECa109细胞接种到多血球预涂层板中，通过Annexin V/PI染色检测其异型性。c（c）计算并显示KYSE150和ECa109细胞的失巢率。d日用软琼脂克隆法检测KYSE150和ECa109细胞中的非凤尾鱼生长。e（电子）计算并显示克隆数。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

MiR-133b通过调控EGFR抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和EMT过程

用划痕法检测ESCC细胞的迁移能力。如图所示5a、 b，转染miR-133b-agomir或shEGFR的KYSE150和ECa109细胞的迁移能力受到抑制。MiR-133b antagomir可增强shEGFR诱导的细胞迁移能力。此外，miR-133b-agomir或shEGFR显著减少了经well检测的侵袭性KYSE150和ECa109细胞的数量。但与shEGFR组相比，miR-133b antagomir组侵袭细胞的数量显著增加（图5c、 d）。此外，通过western blotting分析评估EMT和转移相关标记物的蛋白水平。如图所示5e、 用miR-133b-agomir或shEGFR处理的KYSE150和ECa109细胞中，纤维结合蛋白、波形蛋白、N-钙粘蛋白、MMP-2和MMP-9的蛋白水平降低，而e-钙粘蛋白的蛋白水平升高。正如我们预期的那样，miR-133b antagomir可以逆转shEGFR诱导的这些蛋白水平的变化。因此，miR-133b通过调控EGFR抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和EMT过程。

图5

MiR-133b通过调节EGFR抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和EMT过程。一用划痕法评价KYSE150和ECa109细胞的迁移能力。b条计算并显示了迁移率。c（c）采用跨阱法检测KYSE150和ECa109细胞的侵袭能力。d日计算侵袭细胞的数量。e（电子）western blotting法检测KYSE150和ECa109细胞中纤维结合蛋白、波形蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘素、MMP-2和MMP-9的蛋白水平。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

miR-133b/EGFR轴在ESCC细胞相关信号通路中的调控

为了阐明miR-133b/EGFR轴在ESCC细胞中作用的详细机制，对一系列相关分子和信号通路进行了评估。如图所示6a–d、miR-133b agomir或shEGFR导致ITGB4、Grb2、p-FAK、p-AKT的蛋白水平明显降低_Thr308型，p-ATK_Ser473系列，以及KYSE150和ECa109细胞中的p-ERK1/2。但是，当ESCC细胞与miR-133b antagomir和shEGFR联合转染时，情况可能会发生逆转。因此，ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK通路参与了ESCC细胞miR-133b/EGFR轴的机制。MiR-133b/EGFR轴可能通过ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK信号通路调节ESCC细胞的增殖、抗失巢和非锚定生长、迁移和侵袭。

图6

ESCC细胞相关信号通路中miR-133b/EGFR轴的调节。一,c（c）ITGB4、p-FAK、FAK、Grb2、p-AKT的蛋白质水平_Thr308型，p-AKT_Ser473系列通过western blotting检测KYSE150和ECa109细胞中的p-ERK1/2和ERK1/2。b条,d日定量分析了谱带的灰度值。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

MiR-133b抑制小鼠ESCC细胞的肿瘤生长和肺转移

最后，我们在裸鼠体内模型中进一步验证了我们的结果。结果表明，注射miR-133b过度表达KYSE150和ECa109细胞的小鼠肿瘤体积和重量降低（图7a–c）。注射miR-133b抗原转染的KYSE150和ECa109细胞的小鼠肺组织中，miR-133 b水平升高，而EGFR、ITGB4和Grb2 mRNA水平降低（图7d、 e）。同时，miR-133b阿基米尔治疗导致小鼠肺组织中EGFR、ITGB4、p-FAK和Grb2的蛋白水平降低（图7f、 g）。上述结果表明，miR-133b在裸鼠体内抑制ESCC细胞的肿瘤生长和肺转移。

图7

MiR-133b抑制小鼠ESCC细胞的肿瘤生长和肺转移。(一注射后30天，KYSE150和ECa109细胞转染miR-133b-agomir或miR-133b NC后形成的异种移植瘤的照片。b条肿瘤生长曲线和c（c）显示各组肿瘤重量。d日,e（电子）用RT-qPCR方法检测注射KYSE150或ECa109细胞的小鼠肺组织中miR-133b水平和EGFR、ITGB4、FAK和Grb2 mRNA水平。（f）western blotting检测肺组织中EGFR、ITGB4、p-FAK、FAK和Grb2的蛋白水平。克定量分析了谱带的灰度值。实验数据代表了三个独立的实验。结果表示为平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001

讨论

在本研究中，我们旨在评估miR-133b/EGFR轴在ESCC转移中的作用。我们的研究结果表明，miR-133b在食管鳞癌组织和细胞中表达下调，从而促进食管鳞癌的增殖、抗失巢凋亡、锚定非依赖性生长，并最终通过靶向EGFR和下游ITGB4/FAK/Grb2、AKT和ERK通路导致食管鳞癌侵袭和转移。这些结果阐明了ESCC的侵袭和转移机制，这对在分子水平上为ESCC治疗带来更多新策略有很大帮助。

已证实miR-133b在多种类型的癌症（包括ESCC）中下调，并在肿瘤的恶性进展中发挥关键作用。然而，miR-133b在调节ESCC侵袭和转移中的详细机制尚不完全清楚。与之前的研究一致，我们的结果表明miR-133b在ESCC组织和细胞中的表达显著降低。此外，miR-133b的表达与ESCC组织和细胞中EGFR、ITGB4和p-FAK水平呈负相关，提示这些分子可能参与了miR-133 b在ESCC中的调控机制。

EGFR已被证明是几种人类癌细胞中miR-133b的靶基因之一[12,13,31]. 众所周知，EGFR是一种具有细胞内酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白[32]. EGFR的激活可以触发一系列下游信号通路，主要是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3 K/AKT通路[33]与癌细胞的增殖、侵袭和转移有关。因此，许多以EGFR为靶点的抗癌药物被称为“EGFR抑制剂”，如西妥昔单抗和帕尼图单抗已被采用。在本研究中，双荧光素酶报告子分析结果表明，EGFR是ESCC细胞中miR-133b的靶基因，这进一步通过miR-133 b与EGFR在ESCC组织和细胞中的表达呈负相关来验证。此外，miR-133b的过度表达抑制了ESCC细胞中EGFR的水平，而EGFR的沉默对miR-133 b的表达没有影响。这些结果证明，除了EGFR外，miR-133b还可能调节其产物参与EGFR信号通路的其他基因的表达。

癌细胞从细胞外基质中分离并在非锚定生长条件下增殖被认为是肿瘤转移的早期步骤[34]. 正常情况下，脱落的正常细胞可能受到失巢凋亡信号通路的调控[35]. 然而，肿瘤细胞可能通过抗失巢凋亡而存活并发生远处转移[36]. 在本研究中，miR-133b的过度表达和EGFR的下调通过抑制EGFR的表达，抑制了ESCC细胞的抗失巢凋亡和锚定非依赖性生长。根据这些结果，我们推测miR-133b/EGFR可能通过调节失巢凋亡抗性和锚定非依赖性生长来影响ESCC细胞的迁移和侵袭。正如预期的那样，我们的结果证实了miR-133b-agomir和shEGFR通过靶向EGFR抑制ESCC细胞的迁移和侵袭能力。MMP-2和MMP-9是两种重要的细胞外基质降解酶，通过破坏基底膜结构和降解细胞外基质促进肿瘤的侵袭和转移[37]. 在本研究中，miR-133b过度表达和EGFR沉默抑制了ESCC细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白水平。众所周知，抗失巢凋亡通过触发EMT促进转移[18]. EMT是一个分化良好的上皮细胞失去其极性和细胞-细胞紧密连接，并转化为运动能力和侵袭能力增强的间充质细胞的过程。新的数据表明，EMT是癌症转移的驱动力[38,39]. 在EMT过程中，上皮标记物E-cadherin的表达减少，而间充质标记物纤维结合蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达增加[40]. 根据本研究，通过靶向调控EGFR，miR-133b agomir或shEGFR处理ESCC细胞后，纤维结合蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白的蛋白水平下调，而E-钙粘蛋白水平上调。此外，miR-133b antagomir逆转shEGFR诱导的ESCC细胞增殖、抗失巢凋亡和非锚定生长、迁移和侵袭的变化。从这些结果中，我们提出miR-133b/EGFR轴通过调节失巢凋亡抵抗和锚定非依赖性生长在ESCC转移中发挥关键作用。

此外，我们重点研究了miR-133b/EGFR轴在调控ESCC失巢凋亡抵抗和转移中的详细分子机制。由于我们证明miR-133b表达与ESCC组织和细胞中ITGB4和p-FAK水平呈负相关，因此进一步研究了miR-133 b对ITGB4、FAK和相关信号通路的影响。ITGB4在多种肿瘤中表达上调，并通过促进增殖、侵袭和EMT过程促进肿瘤进展[41,42]. 先前的研究表明，ITGB4通过与肝细胞癌EGFR的相互作用影响失巢凋亡[25]. ITGB4被发现可触发下游跨膜蛋白激酶（包括FAK）的激活，以防止失巢凋亡[43]. 此外，还证实了FAK可以与Grb2结合，并调节黑色素瘤的增殖和侵袭[28]. 有许多下游信号通路，如AKT和ERK，受Grb2调节并促进肿瘤进展[30,38]. 在我们的研究中，miR-133b agomir或shEGFR抑制ITGB4、Grb2水平以及FAK、AKT和ERK的磷酸化水平。

为了进一步验证我们的发现，我们在裸鼠体内进行了肿瘤异种移植。与体外结果一致，miR-133b的过度表达通过调节EGFR/ITGB4/FAK/Grb2信号通路显著抑制肿瘤生长和肺转移。

结论

总之，我们的数据表明，miR-133b在ESCC组织和细胞中表达下调，这与EGFR、ITGB4和p-FAK水平呈负相关。此外，miR-133b通过在体内外靶向EGFR来调节失巢和凤尾鱼非依赖性生长，从而抑制ESCC的转移。ITGB4/FAK/Grb2及下游AKT和ERK通路参与了ESCC中miR-133b/EGFR轴的调控机制。总之，我们的结果揭示了miR-133b在食管鳞癌转移中的作用和机制，其参与调节失巢凋亡抵抗和锚定非依赖性生长。MiR-133b可能是针对这种恶性肿瘤的潜在新的诊断和治疗靶点。