MiR-876-5p通过靶向波形蛋白调节头颈部鳞癌转移和侵袭

摘要

背景

局部或远处转移仍是头颈部鳞癌患者死亡的主要原因。MicroRNAs（miRNAs）与HNSCC的转移有关，但其作用机制尚未见文献报道。通过公共头颈癌miRNA表达数据集，我们发现miR-876-5p是一种新型潜在的靶向HNSCC转移的肿瘤抑制因子。

方法

系统分析miR-876-5P在HNSCC中的临床意义和机制。采用定量RT-PCR评估HNSCC细胞株和20对伴有区域性淋巴结转移和无转移原发肿瘤的HNSCC中miR-876-5p的水平。评估划痕和侵袭试验，以确定miR-876-5p在调节HNSCC细胞迁移和侵袭中的作用。Western blotting用于研究miR-876-5p抑制HNSCC细胞侵袭和迁移的机制。进行荧光素酶分析以评估miR-876-5p与波形蛋白基因的结合。动物模型用于支持体外实验结果。

结果

MiR-876-5p模拟物抑制HNSCC细胞迁移和侵袭。miR-876-5p模拟物组中的波形蛋白蛋白和mRNA水平降低，但miR-875-5p抑制剂组中的水平升高，这表明miR-874-5p抑制HNSCC细胞中波形蛋白的表达。通过直接靶向波形蛋白3′-UTR，我们使用双核糖核酸酶报告子分析来验证波形蛋白是miR-876-5p的功能下游靶点。重要的是，波形蛋白表达增加促进了细胞迁移和侵袭，并与miR-876-5p拟态和波形蛋白共同转染，将细胞侵袭性恢复到原始水平。此外，miR-876-5p过表达显著下调波形蛋白表达水平，并抑制体内HNSCC细胞的远端转移。

结论

miR-876-5p在HNSCC中起抑癌作用，通过靶向波形蛋白抑制转移，为HNSCC治疗提供新的治疗靶点。

背景

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是世界上第六常见的癌症[1]. 据报道，一半以上新诊断的HNSCC患者患有晚期疾病，其中大多数可能导致肿瘤扩散至颈部区域引流淋巴结[2]. 评估患者是否有或将发生区域淋巴结转移与临床相关[三]. 因此，有必要加深对HNSCC转移的认识，并开发预测性分子标记，以提高生存率，指导新疗法的开发和评估[4].

微小RNA（miRNA）是内源性、小的、非编码的单链RNA（长度约22个核苷酸），可通过与mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）结合，在转录后水平抑制靶基因的表达，导致翻译抑制或mRNA降解[5，6，7]. 越来越多的miRNAs在头颈部癌症中被观察到，并被证明可以调节癌细胞的生物学行为[8]. 据报道，let-7a的下调与神经侵袭有关，而HNSCC样本中miR-145和miR-205的上调分别与血管侵袭和淋巴结转移有关[9]. 通过对HNSCC患者进行细针抽吸（FNA）活检，无论转移灶大小如何，所有转移样本中均显示miR-203和miR-205[10]. 然而，关于与淋巴结转移相关的肿瘤抑制microRNA的研究仍然很少。

MiR-876-5p是一种新发现的miRNA，据报道与膀胱癌转移特性的获得有关[11]. 据报道，它在肝细胞癌中也是一种肿瘤抑制因子[12]，结直肠癌[13]，胃癌[14]和霍奇金淋巴瘤[15]. 最近研究表明，miR-876-5p可以通过直接下调肺癌中的骨形态发生蛋白4来抑制上皮-间质转化（EMT）[16]. 然而，miR-876-5p是否对HNSCC的肿瘤发生和转移有影响尚不清楚。

肿瘤复发和转移通常导致HNSCC患者预后不良[17]. 转移过程非常复杂，被称为肿瘤发生的晚期事件[18]. 细胞与邻近细胞失去联系，通过间质基质迁移，侵入血液和淋巴管，并在淋巴结中重新发育[19]. 因此，转移细胞必须具备多种特性才能执行所有这些动作。肿瘤的转移行为将基于促进转移因子的过度表达和抑制因子的缺失[20，21]. EMT是目前备受关注的研究癌症细胞迁移、侵袭和转移扩散发病的过程[17]. 波形蛋白是一种中间大小的丝状物，在间充质细胞中高度表达，根据波形蛋白表达与侵袭性和转移性增加的正相关关系，通常用于识别进行EMT的癌细胞[22]. 其在口腔上皮细胞中的表达在病理学上与肿瘤的侵袭和转移有关[23].

在本研究中，我们首次证实miR-876-5p对HNSCC的抗转移作用。qRT-PCR检测miR-876-5p在HNSCC组织和细胞株中的表达。体内外均证实其对HNSCC细胞迁移和转移的抑制作用。通过生物信息分析（靶点扫描）和实验验证，我们发现波形蛋白是miR-876-5p的直接靶点。MiR-876-5p通过靶向波形蛋白抑制HNSCC转移和EMT，揭示其与转移性HNSCC预后的相关性。

方法

细胞培养、质粒和转染

CAL27和HEK293T（293T）细胞系从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得。人类HNSCC WSU-HN4和WSU-HN2（以下简称HN4与HN6）细胞系取自NIH的Silvio Gutkind博士（医学博士贝塞斯达）[24，25]. CAL27细胞（2017年7月认证）和HEK293T细胞（2018年3月认证）在天林生物科技公司（中国上海）片段分析设施中通过短串联重复测试进行测试。实验中使用的两个细胞系（WSU-HN4、WSH-HN6）显示出不同的基因型，与数据库中的任何基因型都不匹配。所有细胞系均被回收并保存在37°C、5%CO气氛下含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中₂从GenePharma（中国上海）购买hsa-miR-876-5p模拟物、hsa-miR876-5p抑制剂和相应的阴性对照。上述引物的RNA序列为：miR-876-5p mimics，正5′-UGGAUUUCUUUUGUGAAUCACA-3′和反义5′-GUGAUUCACAAAAAAUCCAUU-3′；模拟控制，感觉5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反义5′-ACGUGACACGGGAGAATT-3′；miR-876-5p抑制剂5′-UGGUGAUUCACAAAAAACA-3′；抑制剂对照5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。波形蛋白过表达质粒和阴性对照质粒分别来自GeneCopoeia（EX-vimentin-M02和EX-EGFP-M02）。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）将特殊波形蛋白过表达质粒和阴性对照质粒转染CAL27和HN6细胞8小时。通过qRT-PCR和western blotting检测转染效果。对于miR-876-5p表达的人工改变，细胞（5×10⁵在完全生长培养基中培养至80%汇合；然后，根据制造商的说明，将培养基替换为无血清培养基，培养基中含有miRNA模拟物或抑制剂，使用Lipofectamine 2000进行4-6小时的培养。

患者和样本采集

2017年至2018年间，南京医科大学江苏省口腔医院共有40例原发性HNSCC患者接受了组织病理学和临床诊断。患者详情见表1。所有患者在手术前均未接受任何肿瘤特异性治疗。在研究期间，收集了来自无转移原发肿瘤的HNSCC患者的组织样本，并作为正常对照，与来自有相关区域淋巴结转移的HNSC患者的组织样品进行比较。采集后，立即将所有组织样本冷冻在液氮中，并在−80°C下储存，直至进一步使用。所有组织都是在征得患者同意的情况下获得的，组织样本用于研究目的的书面知情同意书是从捐赠者或其近亲那里获得的。这项研究得到了南京医科大学机构伦理委员会的批准。

表1 40例HNSCC患者的临床特征

实时反转录（RT）-PCR

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。为了qRT-PCR检测成熟miR-876-5p表达，我们购买了Bulge-Loop™miRNA qRT-PCR引物集和对照引物集（中国广州RiboBio）。使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo）将RNA（2μg）转化为cDNA。QRT-PCR是使用ABI PRISM中的FastStart Universal SYBR Green Master Mix（Rox）（罗氏）完成的^®7300实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）符合制造商的说明。GADPH和U6被用作内源性对照。我们使用离解曲线监测非特异性扩增。使用2计算相对表达水平^-ΔΔCt方法。正、反义引物序列如下：波形蛋白5′-TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3′（正）和5′-TAGAG CTT CAA CGG CAA AGT TC-3′（反义）和GAPDH 5′-GAA GGT GAA GGT-CGG AGT C-3′（义）和5’-GAG ATG GTG ATG GGA TTT C-3’（反义。对于miRNA定量，RiboBio（中国广州）设计了针对U6和miR-876-5p的Bulge-loop™miRNA qRT-PCR引物集（每组一个RT引物和一对qPCR引物）。

蛋白质印迹

从细胞中提取总蛋白，并使用裂解缓冲液裂解30分钟（Beyotime Shanghai，China）。使用含有10%聚丙烯酰胺凝胶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将所有蛋白质分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA）上，该膜在室温下用5%BSA在含有吐温20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭2小时。然后用波形蛋白（1:1000；Proteintech，60330-1-Ig，中国）或β-肌动蛋白（1:100；Bioworld，I102，中国）特异性一级抗体在4°C下过夜，用TBST洗涤两次，并用辣根过氧化物酶结合（HRP）二级抗体孵育（中国中山金桥生物）在室温下保持1小时。最后，使用Immobilon Western Chemiluminating HRP底物（Millipore）检测蛋白质带，并使用ImageQuantLAS 4000微型成像系统（General Electrics）进行可视化。

侵入性分析

使用Transwell过滤器（8mm孔径；Millipore）分析细胞侵袭能力。使用Matrigel（Matrigel:DMEM=1:9；每孔50µL；BD生物科学，美国新泽西州富兰克林湖）。电池（1×10⁵)在上部培养箱中用200µL无血清培养基培养，而用500µL含有10%FBS的培养基作为化学引诱剂并放置在下部培养箱中。在37°C下培养细胞24或48小时后，用棉签轻轻去除过滤器上侧残留的非渗透细胞。用4%多聚甲醛（PFA）固定下膜侵袭细胞30min，用结晶紫染色5min。

划痕分析

细胞在6孔板中培养至90%的汇合处，然后用无菌的10-µL移液管尖端在中心区域划伤。用PBS仔细清除漂浮细胞和碎片，用无血清培养基替换培养基。在显微镜下观察创伤细胞的迁移，并随时间拍摄同一创伤区域的图像。

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验

细胞以2×10的密度接种在96个微孔板中^三每个孔的细胞数。细胞在含有10%CCK-8反应溶液的新培养基中培养（Selleckchem，休斯顿）。培养2 h后，根据制造商的说明，在分光光度计微孔板读取器（Multiskan MK3，Thermo）上以450 nm的波长测量吸光度。进行了三个独立的实验。

免疫荧光染色

简言之，将HN6和CAL27细胞在盖玻片上生长24小时，并将细胞固定在4%PFA中，并在1%Triton中透化。在与抗波形蛋白的一级抗体（1:100，Proteintech，60330-1-Ig，中国）孵育过夜后，将细胞与FITC缀合的ATF4兔多克隆抗体（1:500，Proteintech，FITC-10835，中国）孵育，并用DAPI（Beyotime Shanghai，C1002，中国）复染。随后通过荧光显微镜观察细胞（蔡司，德国）。

免疫组织化学

肿瘤标本在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后进行标准组织处理和包埋。切片在4μm处切割，并在37°C下在显微镜载玻片上干燥过夜。在二级抗体孵育30分钟后，用抗波形蛋白（1:2000，Proteintech，60330-1-Ig，中国）和Ki67（1:4000，Proteitech，27309-1-AP，中国）的一级抗体隔夜对组织切片进行染色。使用苏木精对所有切片进行复染，脱水、清洗并装裱，然后使用显微镜进行检查（德国莱卡DM4000B）。

载体构建和双核糖核酸酶报告子分析

对于荧光素酶分析，TargetScan预测了波形蛋白3′-UTR中潜在的miR-876-5p结合位点(http://www.targetscan.org)位于vimentin终止密码子位点47–56的位置。合成了所有具有野生型或突变种子区的波形蛋白3′-UTR序列，并将其克隆到荧光素酶终止密码子下游的Pezx-FR02载体（Genecopoeia，USA）中；新载体分别命名为波形蛋白WT或波形蛋白MUT。用50 nM miR-876-5p模拟物或阴性对照物和1µg波形蛋白-WT或波形蛋白-MUT（使用Lipofectamine 2000，美国Invitrogen）共同转染293T细胞。在转染后48小时收集细胞，并使用Luc-Pair Duo-luciferase Assay Kit 2.0（美国Genecopoeia）分析荧光素酶活性。

体内研究

所有动物研究均由南京医科大学动物护理和使用委员会批准和监督，所有程序均按照南京医科学院动物福利机构指南执行。所有小鼠都被保存在特定的无致病性（SPF）动物设施中，每天12小时，夜间12小时。雄性BALB/c-nu小鼠（5周龄）取自南京医科大学动物研究中心。为了评估miR-876-5p对肿瘤发生和转移的影响，1×10⁶将CAL27细胞（0.2 mL）悬浮在Matrigel（BD）中，并在小鼠背部下注射。当肿瘤直径达到3.0–5.0 mm（6周龄）时，将小鼠随机分为两组（每组7只）。Agomir-876-5p或阴性对照（NC）（中国广州RiboBio）以每只小鼠每3天5 nmol（50µL PBS）的剂量直接注射到植入的肿瘤中，共6次。每2天测量一次肿瘤直径（mm），持续3周，用游标卡尺测量长度（L）和宽度（W）来监测肿瘤体积（V），计算公式为V=（L×W²)/2. 将肿瘤标本固定在4%PFA溶液中12–24小时，并将石蜡包埋以进行进一步分析。对于肝脏播散试验，HN6细胞（1×10⁶/mL）转染agomir-876-5p或NC（中国广州RiboBio）的小鼠悬浮于200µL PBS中（每组3只）。这些细胞通过尾部外侧静脉注射到裸鼠体内。3周后，处死小鼠，解剖肝组织，用4%PFA溶液固定，石蜡包埋。所有切片用苏木精和伊红（H和E）染色以分析肿瘤细胞，并计算肝表面微转移的数量。

统计分析

采用SPSS18.0软件进行统计分析。所有数据均以三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）表示，并使用Student t检验进行评估。比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05具有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

结果

miR-876-5p和波形蛋白在HNSCC细胞株和组织中的表达

为了评估miR-876-5p对HNSCC转移和进展的影响，我们进行了定量PCR分析，以比较转移性HNSCC和非转移性HNSCC中miR-875-5p的表达。20例非转移性HNSCC组织和有淋巴结转移的HNSCC组（表1)，我们的结果显示miR-876-5p在有淋巴结转移的HNSCC组织中的表达显著低于无转移原发肿瘤的HNSC组织（图1a） ●●●●。然后，我们使用TargetScan7.1搜索潜在的miR-876-5p靶点(网址：http://www.targetscan.org)并发现波形蛋白的3′-UTR含有一个潜在的miR-876-5p结合位点（图1b） ●●●●。据报道，波形蛋白通常在正常间充质细胞中表达，对恶性细胞侵袭至关重要[26]. 在HNSCC样本中，我们发现与非转移性HNSCC组织相比，转移性HNSCC组织中的波形蛋白mRNA表达水平显著上调，这意味着miR-876-5p和波形蛋白之间存在互补关系（图1c） ●●●●。接下来，我们检测了HN4、HN6和CAL27细胞中波形蛋白和miR-876-5p的相对水平。在HN6细胞中检测到高波形蛋白表达水平，但在HN4和CAL27细胞中检测出低得多的波形蛋白水平（图1d） ●●●●。然而，在HN4和CAL27细胞中证实miR-876-5p转录水平较高，而在HN6细胞中发现miR-875-5p水平较低（图1e） ●●●●。因此，miR-876-5p表达水平可能与这些HNSCC细胞中的波形蛋白水平呈负相关。然后，我们进行跨孔分析以评估HNSCC细胞的侵袭能力。结果显示，HN6具有最大的侵袭性，HN4具有最差的侵袭性，CAL27介于这两者之间（图1f） ●●●●。因此，我们推测波形蛋白作为一种间充质标记物可能在HNSCC细胞的侵袭性中发挥关键作用，miR-876-5p可能以波形蛋白为靶点调控HNSCC的侵袭能力。

图1

miR-876-5p和波形蛋白在HNSCC细胞系和HNSCC组织中的表达。一伴有相关区域淋巴结转移和无原位转移原发性肿瘤的HNSCC组织中miR-876-5p mRNA的相对表达。b条使用TargetScan7.1预测波形蛋白3′-UTR中潜在的miR-876-5p结合位点。c（c）波形蛋白mRNA在转移性HNSCC组织和非转移性HNCCC组织中的相对表达水平。d日，e（电子）HN4、HN6和CAL27细胞中miR-876-5p和波形蛋白的表达水平。如果HN4、HN6和CAL27细胞侵袭力的差异。图像以200倍放大率拍摄*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001

MiR-876-5p显著抑制HNSCC细胞系的细胞迁移和侵袭

为了评估miR-876-5p对HNSCC侵袭和迁移的影响，我们用miR-875-5p模拟物或抑制剂转染HN6和CAL27细胞。利用Transwell和划痕分析验证细胞侵袭和迁移的改变。转染后，定量RT-PCR证实HNSCC细胞中miR-876-5p表达增加（图2a） ●●●●。在miR-876-5p模拟物组中，miR-875-5p过度表达，而HNSCC的侵袭和迁移活性显著降低（图2b、 c）。另一方面，与阴性对照细胞相比，miR-876-5p被敲除的细胞表现出更好的细胞侵袭和迁移（图2b、 c）。我们的数据表明miR-876-5p抑制HNSCC细胞的转移潜能。

图2

MiR-876-5p显著抑制HNSCC细胞系的细胞迁移和侵袭。一转染后MiR-876-5p表达。b条，c（c）miR-876-5p模拟物和抑制剂对HNSCC细胞侵袭和迁移的影响。划痕试验图像的伤口区域是以×40的放大倍数拍摄的。transwell分析的图像是在×200放大倍数下拍摄的*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001

此外，为了确定细胞增殖的变化，对HNSCC细胞进行CCK-8分析和流式细胞术。与阴性对照组相比，miR-876-5p模拟物或抑制剂没有显著影响HNSCC细胞的增殖（附加文件1：图S1A、B）。

波形蛋白是HNSCC中miR-876-5p的直接靶点

为了进一步研究miR-876-5p对波形蛋白的潜在负调控作用，我们用miR-876-5p模拟物或阴性对照瞬时转染HN6和CAL27细胞。miR-876-5p模拟转染的HNSCC细胞中的波形蛋白mRNA表达仅为转染阴性对照细胞的27%和21%（图三a） ●●●●。接下来，在miR-876-5p转染后，通过western blot分析定量波形蛋白的表达。miR-876-5p模拟物组的波形蛋白表达水平降低。相反，细胞转染miR-876-5p抑制剂后，波形蛋白蛋白表达上调（图三b） ●●●●。此外，我们通过免疫荧光研究了波形蛋白在HNSCC细胞中的表达；正如预期的那样，miR-876-5p模拟物组中的波形蛋白表达被解除，并且在转染miR-875-5p抑制剂后上调（图三c） ●●●●。因此，我们的数据表明miR-876-5p可能通过抑制波形蛋白来限制HNSCC细胞的转移潜能。

图3

波形蛋白是HNSCC中miR-876-5p的直接靶点。一，b条通过qRT-PCR和western blot检测波形蛋白mRNA和蛋白的相对表达水平。c（c）免疫荧光法分析波形蛋白在HNSCC细胞中的表达。比例尺，50μm。d日MiR-876-5p表达抑制野生型但不抑制突变波形蛋白3′-UTR报告活性*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001

为了研究miR-876-5p是否与靶mRNA的3′-UTR结合，我们构建了一个荧光素酶报告基因野生型载体，该载体含有波形蛋白3′-UTR和假定的miR-876-5p结合位点。相应地，我们构建了一个含有波形蛋白3′-UTR的突变报告载体，在推测的miR-876-5p结合位点发生突变。共转染实验表明，miR-876-5p将野生型载体的荧光素酶活性下调了50%，但在转染突变载体时没有出现这种下调（图三d） ●●●●。综上所述，这些结果表明波形蛋白是miR-876-5p的直接下游靶点。

波形蛋白过度表达促进HNSCC细胞迁移和侵袭

使用Lipofectamine 2000用特殊的波形蛋白过表达质粒转染HN6和CAL27细胞。qRT-PCR和蛋白质印迹分析显示，转染后的mRNA和蛋白质表达水平明显升高（图4a、 b）。通过划痕和跨阱分析，我们评估了波形蛋白是否上调了HNSCC细胞的迁移和侵袭能力。正如预期的那样，波形蛋白过度表达显著诱导了HNSCC细胞的侵袭能力（图4c） ●●●●。根据图中的结果4d、 波形蛋白过度表达组HN6和CAL27细胞迁移能力显著增加。这些结果表明，波形蛋白显著调节HNSCC细胞的侵袭和迁移。

图4

波形蛋白过度表达促进HNSCC细胞迁移和侵袭。一，b条转染后波形蛋白mRNA和蛋白表达。c（c），d日波形蛋白过度表达对HNSCC细胞侵袭和迁移能力的影响。划痕分析图像的伤口区域在×40倍放大下拍摄。transwell分析的图像是在×200放大倍数下拍摄的*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001

波形蛋白是HNSCC细胞miR-876-5p的关键介导物

为了进一步研究miR-876-5p是否靶向波形蛋白调节HNSCC细胞的侵袭和迁移，我们将其分为四组：miR-875-5p-NC与波形蛋白-NC共转染，miR-874-5p模拟与波形素过表达共转染、miR-876-5p-NC和波形蛋白过表达，miR-866-5p模拟和波形素-NC共表达。如图所示5a、 波形蛋白加miR-876-5p的转染模拟了波形蛋白表达的显著减弱。Transwell分析显示，与对照组相比，过表达波形蛋白组的细胞侵袭性较高，miR-876模拟物组的细胞侵入性较低。在miR-876-5p模拟物与过表达波形蛋白组和对照组之间，每个场的侵袭细胞数量没有显著差异（图5b、 c）。同样，在划痕试验中，波形蛋白增加了HNSCC细胞的迁移能力，而miR-876-5p模拟物阻止了这种变化（图5d、 e）。因此，我们的研究结果表明miR-876-5p通过靶向波形蛋白调节HNSCC细胞的侵袭和迁移。

图5

波形蛋白是HNSCC细胞中miR-876-5p的关键介质。一miR-876-5p与波形蛋白过表达的共转染可将波形蛋白的表达恢复到HNSCC细胞的原始水平。b条——e（电子）MiR-876-5p模拟物可减少HNSCC细胞的侵袭和迁移，而与EX-vimentin-M02联合转染则可抵消这些变化。划痕分析图像的伤口区域在×40倍放大下拍摄。transwell分析的图像是在放大×200倍的条件下拍摄的*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001

MiR-876-5p在体内抑制波形蛋白的表达并抑制HNSCC细胞的远端转移

由于miR-876-5p在体外显著抑制HNSCC细胞的迁移和侵袭，我们进一步研究了miR-875-5p在体内的生物学作用。与agomir-876-5p孵育后，2×10⁶将CAL27细胞注入裸鼠右背部皮下组织。接种两周后，每隔3天向肿瘤组织注射一次agomir-876-5p（5 nmol/只小鼠）。治疗3周后，处死所有小鼠，从小鼠身上提取的肿瘤如图所示6a、 b.我们发现，miR-876-5p-过表达CAL27细胞形成的肿瘤体积与NC-表达细胞形成的瘤体积没有显著差异。IHC染色显示，转移相关蛋白波形蛋白的表达上调，而增殖相关蛋白Ki-67的表达上调[27]在来自miR-876-5p转染的裸鼠的组织样品中没有减少。该数据表明miR-876-5p对体内肿瘤增殖没有显著影响（图6c） ●●●●。

图6

MiR-876-5p抑制波形蛋白表达并抑制体内HNSCC细胞的肝转移。一，b条agomir-876-5p组和阴性对照组之间的肿瘤体积没有显著差异。每组包含7只裸鼠。c（c）Ki-67和波形蛋白的组织学和免疫组织化学分析。比例尺，50μm。d日典型的组织学图像显示裸鼠肝脏肿瘤转移。e（电子）计算肝表面微转移的数量。每组包含三只裸鼠*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001

为了进一步确定miR-876-5p过度表达对体内HNSCC细胞转移的影响，我们使用裸鼠模型进行了远端扩散分析。BALB/c裸鼠经尾静脉注射agomir-876-5p或NC转染细胞（第2组，n=3）。注射后24天，处死所有小鼠。对于远端播散试验，取下肝组织并进行组织学检查。正如预期的那样，miR-876-5p显著减少了肝脏表面转移性HNSCC细胞团的数量（图6d） ●●●●。这些数据表明miR-876-5p抑制体内HNSCC细胞的转移。

讨论

在HNSCC的发生和发展过程中，miRNAs可以调节多种生物过程，充当肿瘤致癌基因或抑制物[28，29]. 越来越多的证据表明，一些miRNAs强烈调节致瘤细胞的转移和侵袭能力[30，31，32]. 因此，了解异常miRNA表达可能会促进我们对HNSCC肿瘤发生的理解，并为识别治疗HNSCC的新标记物和药物靶点提供关键信息。

由于HNSCC在发达国家和发展中国家的发病率都在增加，HNSCC的潜在分子机制受到了更多的关注[33，34，35]. 根据以前的研究，在HNSCC中发现了更多异常表达的miRNAs。例如，据报道，miR-30a和miR-934在酒精相关HNSCC中显著上调[36]. 此外，在HNSCC组织中miR-124的表达水平是正常组织的4.59倍[37]. 此外，一些研究人员发现，早期局部复发患者的口咽肿瘤中miR-422a显著降低[38]. 此外，在HNSCC组织和细胞系中，miR-145-5p和miR-145-3p的表达水平显著下调[39]. 在我们的研究中，我们发现miR-876-5p在HNSCC细胞系和组织中下调。miR-876-5p转染显著抑制细胞迁移和侵袭，表明其在HNSCC中具有抗肿瘤作用。

EMT是一个生物过程，在这个过程中，非能动上皮细胞转化为间充质表型，并伴有侵袭性增加[40]. 接受EMT的癌细胞的主要特征之一是间充质标志物的增强表达，如波形蛋白[18，41，42]. 一些研究表明，高波形蛋白表达与HNSCC细胞转移和侵袭潜力增强有关[23，43]. 越来越多的证据表明，miRNAs通过调节波形蛋白影响癌症的发展。在HNSCC中，miR-375间接调节波形蛋白mRNA水平，这对HNSCC的侵袭很重要[44]. 在结直肠癌中，miR-378可能起到抑癌作用，并通过靶向波形蛋白在抑制肿瘤生长和侵袭方面发挥重要作用[8]. 此外，miR-30a抑制波形蛋白的表达，波形蛋白可作为预测乳腺癌预后的肿瘤生物标记物，并有助于开发这种疾病的潜在治疗靶点[45]. 通过生物信息学分析，我们发现波形蛋白可能是miR-876-5p在下调HNSCC转移过程中的直接靶点。我们研究中的数据为研究miR-876-5p在人类HNSCC中的参与提供了第一个实例。

在本研究中，我们的所有数据表明miR-876-5p可能是一种影响HNSCC转移的新型肿瘤抑制因子。为了进一步阐明细胞增殖的变化，实验中进行了CCK-8分析和流式细胞术。我们发现，转染miR-876-5p模拟物的细胞与阴性对照细胞之间的细胞增殖能力没有显著变化。此外，体内研究表明，皮下肿瘤体积并未因miR-876-5p过度表达而显著减少。同时，Ki-67染色的IHC统计评分显示，注射agomir-876-5p细胞的肿瘤与注射NC细胞的肿瘤之间没有明显变化。因此，我们推测miR-876-5p可能不是HNSCC细胞增殖的新标志物。

为了更好地了解miR-876-5p在HNSCC中抗肿瘤作用的潜在分子机制，我们使用了TargetScan(网址：http://www.targetscan.org)寻找miR-876-5p的潜在靶基因。我们发现波形蛋白3′-UTR序列被预测含有一个高度保守的miR-876-5p结合位点。在本研究中，我们证明miR-876-5p与HNSCC细胞的侵袭性密切相关。通过荧光素酶报告分析，我们确认波形蛋白是miR-876-5p的直接下游靶点。此外，miR-876-5p过表达在体内外显著抑制HNSCC细胞的迁移和侵袭。有趣的是，波形蛋白表达水平的恢复改善了HNSCC细胞的迁移和侵袭。这些结果支持使用miR-876-5p作为HNSCC颈部淋巴结转移的特征性预后标记物和潜在预测因子。

结论

总之，我们的数据表明miR-876-5p在抑制HNSCC侵袭和转移中具有重要作用。波形蛋白表达载体与miR-876-5p共转染可有效降低波形蛋白的表达并逆转其在HNSCC细胞中的致瘤性。miR-876-5p下调波形蛋白表达的发现可能为HNSCC的治疗提供新的诊断标志和治疗靶点。