靶向谷氨酰胺代谢使胰腺癌对拉帕松诱导的PARP驱动的代谢突变敏感

摘要

背景

胰腺导管腺癌（PDA）激活细胞溶质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）生成的谷氨酰胺依赖性途径，以维持氧化还原平衡并支持增殖。参与该途径的酶(GLS1级（线粒体谷氨酰胺酶1），GOT1公司（细胞质谷氨酸草酰乙酸转氨酶1），以及获得2（线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶2）在PDA中高度上调，其中GLS1级最近被用于针对合成代谢谷氨酰胺代谢的临床试验。然而，这种途径的单药抑制是细胞抑制性的，不太可能在控制晚期疾病方面提供持久的益处。

结果

在这里，我们报告了通过基因或药物（双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）或CB-839）抑制突变型Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物中谷氨酰胺代谢来减少NADPH库(KRAS公司)PDA使细胞株和肿瘤对ß-拉帕酮（\223\223\lap，临床形式ARQ761）敏感。ß-Lap是一种NADPH:醌氧化还原酶(NQO1号机组)-通过药物无效氧化还原循环产生的高水平活性氧（ROS）导致NADPH耗竭的生物活性药物，以及随后通过聚ADP核糖聚合酶耗竭的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+(PARP项目)过度激活。NQO1号机组突变体高度激活表达KRAS公司发出信号。因此，在突变株中，ß-lap处理与谷氨酰胺代谢抑制同时进行KRAS公司,NQO1号机组PDA过度表达会导致大量氧化还原失衡，广泛的DNA损伤，快速PARP项目-介导的NAD+消耗和PDA细胞死亡特征NQO1号机组-低，野生型KRAS公司表达细胞。

结论

这种治疗策略证明了以下原理：同时降低谷氨酰胺代谢依赖性肿瘤抗氧化防御和诱导超生理活性氧的形成是杀瘤的，并且这种合理设计的组合策略降低了这两种药物的所需剂量在体外和体内.非重叠特性GLS1级PDA肿瘤抑制剂和ß-lap具有较高的肿瘤选择性，同时保留正常组织。

背景

胰腺导管腺癌（PDA）是一种顽固性癌症，患者的5年生存率＜6%。预计到2020年，该疾病的死亡率将成为癌症相关死亡的第二大原因[1]. PDA对传统化疗具有高度耐药性[1]和激活Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变(KRAS公司)95%以上的病例[2]. 尽管制药行业在过去30年中做出了重大努力，KRAS公司已经证明是一个具有挑战性的药物靶标[三]. 一种新兴的治疗方法是靶向突变驱动的PDA代谢的改变KRAS公司[2,4–6]. 例如，PDA细胞通过磷酸戊糖途径的非氧化臂生成大量用于从头合成核苷酸的核糖[7]. 这个KRAS公司-葡萄糖代谢的驱动重编程绕过了产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化臂。为了补偿这种重新布线，PDA通过GLS1级（线粒体谷氨酰胺酶）-，获得2（线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶2）-，和GOT1公司（细胞质谷氨酸草酰乙酸转氨酶1）依赖性途径，在面临快速增殖和生长时支持细胞氧化还原平衡（图1a个) [2,8,9]. 这与谷氨酰胺衍生谷氨酸通过总账1（谷氨酸脱氢酶1）为TCA循环提供碳骨架。此途径中酶的遗传抑制是PDA中严重的生长抑制，但不会导致细胞毒性反应的诱导。这些结果表明，在PDA中诱导氧化还原平衡的方法与抑制氧化还原平衡同时存在KRAS公司-依赖性谷氨酰胺代谢途径，可能提供一种诱导肿瘤选择性杀伤的手段。

图1

PDA中谷氨酰胺代谢基因上调。一PDA中谷氨酰胺的利用途径。天冬氨酸天冬氨酸，GSR公司谷胱甘肽二硫化物还原酶。b条 NQO1号机组PDA患者肿瘤组织中谷氨酰胺代谢酶与17种其他癌症类型的比较(中央立柱“其他”癌症包括实体和血液恶性肿瘤）和PDA与正常胰腺组织(最右边的列). 数据来自Oncomine(网址：www.oncomine.org).c（c）根据高低分组的45例PDA患者的多重比较校正Kaplan-Meier生存曲线GOT1：GLUD1使用PROGgene网络工具评估表达(http://watson.combio.iupui.edu/chirayu/proggene/database/？url=proggene)

为了提高肿瘤细胞对谷氨酰胺的依赖性GLS1型已开发（例如，双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES），CB-839，化合物968）[10–12].GLS1级催化PDA谷氨酰胺代谢途径的第一步，将谷氨酰胺转化为谷氨酸（图1a个) [8]. 像这样的，GLS1级培养中PDA细胞的抑制导致谷氨酰胺代谢的阻断，但与上述遗传方法一样，缺乏细胞毒性。此外，虽然GLS1级抑制剂是细胞培养模型中细胞增殖的有效抑制剂，在临床前肿瘤模型中作为单一药物对肿瘤生长的影响相对较小[13–17].

为了提高GLS1级通过抑制PDA，我们将BPTES或CB-839与ß-拉帕酮（\223»-lap）结合，这是一种靶向癌症治疗方法，可在NADPH:醌氧化还原酶1中形成肿瘤选择性活性氧物种（ROS）(NQO1号机组)-具体方式[18].NQO1号机组在多种癌症中高度表达，包括PDA。事实上NQO1号机组在约90%的PDA患者标本中观察到表达（≥10倍），这使得PDA成为使用NQO1号机组-生物活性药物，如ß-lap[18–21].

ß-Lap是通过NQO1号机组，一种诱导II相醌解毒酶。生成的对苯二酚形式的ß-lap高度不稳定，并与氧自发反应，还原为母体化合物，每摩尔NAD（P）H产生两摩尔超氧物[18]. 这导致了一个徒劳的循环，在NQO1号机组-过度表达细胞导致大量ROS形成、DNA氧化损伤和H₂O（运行）₂-介导的DNA单链断裂（附加文件1：图S1A）。为了修复这种损伤，聚ADP核糖聚合酶(PARP项目)变得过度活化，产生大量自由支链聚（ADP核糖）（PAR）聚合物水平。过度活化的PARP项目大量消耗细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+和三磷酸腺苷（ATP）池，并最终压倒DNA修复机制修复ßlap诱导的DNA损伤的能力。

提供的治疗窗口NQO1号机组表达式（因此NQO1号机组-介导的ß-lap生物活性）已将\223»-lap推进到I期和Ib期临床试验（ARQ761）[22]. 不幸的是，高ß-lap剂量下非特异性ROS生成引起的剂量限制性高铁血红蛋白血症在一定程度上限制了\223»-lap作为单一疗法的疗效[22]. 增加癌细胞细胞毒性的策略，同时保持NQO1号机组特异性，可以进一步提高ß-lap治疗PDA的疗效。

ß-圈和GLS1级抑制具有独特但高度互补的作用机制。ß-Lap诱导PDA细胞特异性产生肿瘤选择性ROS，PDA细胞表达高水平的NQO1号机组.GLS1级抑制通过降低谷氨酰胺产生的抗氧化物库，使细胞对活性氧损伤敏感，从而使PDA癌细胞提前死亡。在这里，我们使用PDA的体内临床前模型表明，PDA细胞对谷氨酰胺的依赖性增加是通过接触这两种药物而实现的。ß-lap的使用GLS1级抑制剂产生协同效应NQO1号机组-和PARP项目-依赖性癌细胞死亡，允许两种药物使用较低剂量和较短治疗时间。

结果

PDA中谷氨酰胺代谢基因上调

PDA中用于谷氨酰胺代谢的酶，GLS1级,政府1/2和苹果酸酶1(ME1公司)（参见路径，图1a个)，除了NQO1号机组在使用Oncomine网络工具进行评估时，PDA中的，与其他17种癌症相比显著上调（图1亿) [8]. 这在细胞系和肿瘤样本中都很明显。相反，总账1将谷氨酰胺碳从GOT2–GOT1–ME1与其他类型的癌症相比，PDA中的代谢途径并没有上调（图1a个). 此外，谷氨酰胺代谢酶，NQO1号机组、和总账1相对于正常胰腺组织，发现在PDA中显著上调（图1a个). 为了确定PDA谷氨酰胺代谢途径相对于其他参与谷氨酰胺代谢的酶的临床相关性，我们评估了包含临床随访信息的数据集中个体基因表达水平与总生存率的相关性[23]. Kaplan–Meier分析显示，当患者被分为高表达和低表达相关基因时，结果没有显著差异（数据未显示）。然而，当GOT1公司和获得2标准化为总账1我们发现GOT1公司到总账1或获得2到总账1该比率与不良结果显著相关（图1c个，其他文件1：图S1B）。这些数据表明得到了PDA中的亚型通常升高，与总账1表达式。

抑制谷氨酰胺代谢使PDA对ß-lap敏感

鉴于PDA依赖谷氨酰胺代谢实现氧化还原平衡，我们假设谷氨酰胺缺乏NQO1号机组-过度表达的PDA细胞会通过降低抗氧化防御和增加NQO1号机组-诱导活性氧损伤。MiaPaCa2细胞在无Gln或含Gln（2 mM）的培养基中生长16 h，然后暴露于ßlap中2 h。短期Gln剥夺本身并没有显著改变克隆形成存活率（图2a个)但在亚致死剂量和更高剂量的药物下，确实使MiaPaCa2细胞对ßlap敏感（图2a个). 为了证实这些结果，我们在其他五种PDA细胞系中重复了该实验：ASPC1、MPanc96、HPAFII、SW1990和DAN-G（图2b–f). 此外，我们证明观察到的细胞毒性是NQO1依赖性的NQO1号机组抑制剂双香豆素（DIC）使细胞免于死亡（图2亿–（f）) [24–26].

图2

抑制谷氨酰胺代谢使PDA对ß-lap敏感。一谷氨酰胺耗尽16 h后用ß-lap处理2 h的MiaPaCa2细胞的集落形成测定。p<0.01在3μM和p<0.00014μM。b条–（f）在ASPC1、MPanc96、HPAFII、SW1990和DAN-G PDA细胞系中进行剂量范围为ß-lap的谷氨酰胺剥夺实验。克MiaPaCa2细胞的ß-lap剂量反应GLS1级.小时蛋白质印迹GLS1级,ME1公司,GOT1公司、和总账1使用siRNA在MiaPaCa2细胞系中敲除48小时后。我的相对存活率GOT1公司,GLS1级,总账1、和ME1公司用2.5μMß-lap处理MiaPaCa2敲除细胞2小时。j个,k个 GLS1级在MiaPaCa2中被击倒，然后添加3 mM草酰乙酸（OAA）或3 mM苹果酸二甲酯24小时，然后用2.5μMß-lap进行2小时处理。相对存活率代表处理后48小时CellTiter-Glo存活率测定的平均值，绘制为处理/对照百分比（T/C），六份样品的±SE。使用Student的t吨测验。*p<0.05; **p<0.01；***p<0.001;****p<0.0001

接下来，RNAi介导的谷氨酰胺代谢酶的敲除表明GLS1型,GOT1公司、和ME1公司相对于非靶向控制（干扰小干扰RNA（siScr）），MiaPaCa2和ASPC1 PDA细胞系对ß-lap显著增敏（图2克–k个). 与谷氨酰胺在PDA中代谢以维持氧化还原平衡的机制一致[8]，击倒总账1对ß-lap灵敏度没有影响（图第2页). 经ß-lap处理的MiaPaCa2细胞的致敏作用GLS1级通过补充谷氨酰胺代谢途径下游的代谢底物来挽救击倒GLS1级反应，即草酰乙酸（OAA）或细胞可渗透的苹果酸二甲酯（图第2节,k个). 这些数据表明PDA细胞越来越依赖谷氨酰胺生成NADPH（图1a个)存在ß-lap诱导的ROS应力。

GLS1级BPTES的抑制使PDA对NQO1号机组-依赖方式

为了从药理学上复制对抑制Gln代谢的ß-lap敏感性，用亚致死剂量的线粒体处理MiaPaCa2细胞GLS1级抑制剂，BPTES（500 nM，48 h，附加文件2：图S2），然后暴露于不同剂量的ß-lap 2 h，有或没有DIC（图3a年). 与单独使用ß-lap相比，BPTES预处理与\223»-lap联合使用显著降低了克隆形成存活率，而添加DIC则避免了死亡（图3a年). 为了证实我们的结果是由于谷氨酰胺依赖性转氨途径的抑制，而不是通过总账1，我们用表没食子儿茶素没食子酸盐（EGCG）预处理MiaPaCa2细胞，EGCG是一种总账1  [27]48小时，然后将其暴露在ß圈中。与我们的RNAi结果一致（图第2页)，我们发现总账1EGCG的抑制作用对ß圈敏感性没有影响（图3亿). 此外，正常人IMR-90胚胎肺成纤维细胞NQO1号机组水平[26]没有受到ß-lap的影响，无论是否进行BPTES处理（图3立方厘米). 添加OAA或苹果酸二甲酯，补充NADPH产生的转氨途径GLS1级，挽救了MiaPaCa2、ASPC1和HPAFII PDA细胞对ßlap的BPTES依赖性超敏反应（图三维).

图3

GLS1级BPTES的抑制使PDA对NQO1号机组-依赖方式。一MiaPaCa2预处理±500 nM BPTES 48 h，然后添加ß-lap±50μM 2 h，进行克隆存活试验。数据表示四份样本的生存均值±SE。b条用100μM的总账1抑制剂EGCG持续48小时，然后进行2-hß-圈剂量反应。相对细胞存活率代表六倍样品经ß-lap处理48 h后CellTiter-Glo存活率测定的平均值，绘制为处理/对照（T/C）±SE的百分比。c（c）正常肺成纤维细胞系IMR90的克隆形成存活试验，用±500 nM BPTES预处理48 h，然后进行2 h的重叠处理。数据表示四份样本的生存均值±SE。d日用±500 nM BPTES预处理MiaPaCa2、ASPC1和HPAFII PDA细胞系48 h，最后24 h用3 mM草酰乙酸（OAA）或3 mM苹果酸二甲酯，2.5μMß-lap预处理2 h。相对细胞存活率表示治疗48 h后CellTiter-Glo存活率测定的平均值，以六倍样本的百分比（T/C）±SE表示。e（电子）各种癌症细胞系用±500 nM BPTES（亚生长抑制）预处理48 h，然后添加2.5μMß-lap 2 h。突变（mt）KRAS公司行：A549非小细胞肺(NSCL公司)、PL45掌上电脑、，NQO1号机组表达S2-013(S2系列+)个人数字助理，NQO1号机组表达MDA-MB-231(231+)三阴性乳腺H2122NSCL，NQO1号机组-S2-013缺陷(S2负极)PDA，以及NQO1号机组MDA-MB-231缺陷(231−)三阴性乳腺癌细胞。野生型（wt）KRAS公司线：Hs766T型个人数字助理，BxPC3公司个人数字助理，MCF7型乳房，以及NQO1+H596型NSCL和H661型NSCL癌细胞系

突变体KRAS公司信号驱动器NQO1号机组谷氨酰胺的表达和依赖性[7,8,28,29]因此，我们试图评估突变体的普遍性KRAS公司表达对BPTES和ß-lap的影响。BPTES预处理使多种NQO1号机组-表达KRAS公司到ßlap的突变癌细胞系，包括肺、三阴性乳腺和其他PDA细胞系。相反，NQO1号机组-不足KRAS公司无论是否添加BPTES，突变株系仍然对ß-lap具有抗性（图第三版). 此外，用500 nM BPTES预处理48小时并没有增加ßlap反应的敏感性，NQO1号机组-表达KRAS公司野生型肺癌、乳腺癌或胰腺癌细胞系，与文献报道一致[8,30]. 总之，这些结果表明，为了使这种靶向药物组合有效，敏感细胞必须同时出现这两种突变KRAS公司-驱动的Gln依赖性和NQO1号机组表达式。后者是大多数（但不是全部）突变体的特征KRAS公司-转变了癌症类型。

GLS1级抑制减弱抗氧化防御并增加对ß-lap诱导的DNA损伤的敏感性

我们观察到，在单独暴露于ß-lap的MiaPaCa2细胞中，NADP+/NADPH比率（细胞氧化状态的代表）呈剂量依赖性增加，与未处理细胞中的基线相比，达到了四倍的水平（图4a类). 在BPTES预处理中，我们注意到与未处理的MiaPaCa2细胞的基线水平相比，暴露于ßlap的细胞中NADP+/NADPH比率增加了7倍（图4a类)与单独暴露于ß-lap的细胞相比，其水平高出约两倍。BPTES预处理（500 nM，48 h）也显著降低了MiaPaCa2细胞中的还原性谷胱甘肽（GSH）水平，与单独的DMSO载体相比（>两倍；其他文件三：图S3A）和细胞外H₂O（运行）₂在BPTES加ß-lap处理后，产量以时间和剂量依赖的方式显著增加（图4b个，其他文件三：图S3B）。此外，在BPTES加ß-lap治疗后，细胞内总ROS水平显著增加（附加文件三：图S3C）。与H的动力学一致₂O（运行）₂生产中，我们观察到最短死亡时间减少[31,32]使用BPTES预处理对MiaPaCa2中的ß-lap诱导的致死性（图4c类). 在用BPTES预处理48 h后，再加上用ß-lap预处理2 h后，抗氧化还原的二乙基酯GSH可以挽救暴露于\223»-lap的MiaPaCa2、ASPC1、HPAFII和MPanc96细胞中克隆形成存活的这种影响（图第4天).

图4

GLS1级抑制降低抗氧化防御能力并增加对ß-lap诱导的DNA损伤的敏感性。一用BPTES预处理48 h（500 nM），然后用ßlap处理2 h的MiaPaCa2细胞中NADP+与NADPH的相对比值。治疗2小时后立即测量NADP+和NADPH水平。b条相对细胞外H₂O（运行）₂通过在4μMß-lap±DIC、±BPTES处理的MiaPaCa2介质中进行发光分析，在120分钟的时间范围内，从六倍样品中测量±SE。c（c）MiaPaCa2预处理±500 nM BPTES 48小时，然后添加ß-lap进行不同孵育时间的克隆原性存活。数据表示四份样本的生存均值±SE。d日用±500 nM BPTES和±GSH还原乙酯预处理MiaPaCa2、ASPC1、HPAFII和MPanc96 48 h，然后添加ßlap 2 h。e（电子）,（f）用±500 nM BPTES预处理的ASPC1 PDA细胞系进行碱性彗星试验，然后进行2 h的ß-lap。克MiaPaCa2治疗后24小时平均53BP1病灶。小时用Western blot检测15分钟ß-lap暴露后经指示处理的PAR形成。我治疗2小时后，不同剂量的ß-lap的相对NAD+水平±BPTES。使用Student的t吨测验。*p<0.05;**p<0.01;***第页< 0.001

BPTES预处理后暴露于ß-lap协同增加了ASPC1细胞中的总DNA损伤，如在处理2小时后立即通过碱性彗星分析评估的，以及MiaPaCa2细胞中的DNA双链断裂（DSB）形成，如在处理24小时后通过53BP1病灶形成监测的（图第4页–克). 此外，使用BPTES进行预处理，然后使用ßlap进行治疗，显著增加PARP项目伴随NAD+耗竭和PAR形成的过度激活，通过添加PARP项目与单独治疗相比，在MiaPaCa2细胞中的抑制剂Rucaparib（AG014699）4小时,我). 这些数据表明，PDA细胞依赖谷氨酰胺实现氧化还原平衡，而被破坏的氧化还原状态增强了ß-lap诱导的DNA损伤PARP项目-引发的代谢灾难。

GLS1级体内抑制使PDA对ß-lap敏感

确定药物是否抑制GLS1级我们使用临床配方的ß-lap（ARQ761）、羟丙基β-环糊精旅行（HP \223»CD）-\223＆lap和口服药物，与\223lap联合使用将导致协同抑制PDA肿瘤在体内的生长GLS1级抑制剂，CB-839，由Calithera Biosciences提供。这两种化合物均处于不同癌症类型（NCT01502800、NCT02071862、NCT02071888和NCT02071 927）的单独I/II期临床试验中[11]. 这些研究采用CB-839，因为BPTES代谢稳定性差，体内溶解度低[11]. 弗斯特,我们证实，CB-839预处理，如BPTES，也使PDA细胞系在体外对MiaPaCa2和ASPC1细胞系中的ßlap敏感（图5a级). 接下来，我们将人类MiaPaCa2细胞注射到Nu/Nu雌性无胸腺小鼠的右后肢，生成皮下肿瘤，并使肿瘤生长到100 mm的体积^三在开始治疗之前。当肿瘤体积达到1000毫米时，处死小鼠^三根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定。

图5

GLS1级抑制使胰腺癌在体内对ß-lap敏感。一用1μM CB-839预处理MiaPaCa2和ASPC1细胞48小时，然后进行2小时的ß-重叠剂量反应。b条裸鼠体内由MiaPaCa2细胞生长的皮下肿瘤体积可以达到100 mm^三之后，每隔一天用载体（HPßCD，n个 = 6） ，次有效剂量的CB-839（口服灌胃，200mg/kg，每日两次，连续10天，n个 = 8） ，次有效剂量的ß-lap（IV，25mg/kg，n个 = 8） 或次有效剂量的CB-839和ß-lap(n个 = 10） 总共五剂(箭头). 监测肿瘤生长直至肿瘤达到1000mm^三.误差线，扫描电镜。c（c）以Kaplan–Meier图表示的荷瘤小鼠的存活率。当肿瘤达到1000毫米时，将小鼠处死^三.采用对数-秩检验对趋势进行统计分析。d日用ß-lap±CB-839（4天治疗）治疗30分钟后从一组肿瘤中提取的PAR和γH2AX的Western blot，n个 = 每组3个肿瘤，剂量同上。e（电子）治疗组的相对GSH/GSSG比率标准化为肿瘤蛋白微克。除非另有说明，所有结果均使用Student’st吨测验。*p<0.05;**p<0.01;***第页< 0.001

这些动物每天两次口服灌胃给药（即HPßCD）或CB-839（200 mg/kg），连续10天，每隔一天静脉注射或不静脉注射亚有效剂量的\223»lap（25 mg/kg）（图5亿，箭头）[33]. 仅经过一个疗程（10天）的治疗，我们发现与单独使用两种药物相比，CB-839加ß-lap治疗的小鼠在第60天的肿瘤生长明显延迟。重要的是，我们注意到单独服用CB-839（200 mg/kg）和ß-lap（25 mg/kg）均未显著改变肿瘤生长（图5亿). 附加文件中的瀑布图显示了单个肿瘤4：图S4A。值得注意的是，与车用小鼠相比，联合治疗并没有减轻小鼠重量（附加文件4：图S4B）。未观察到长期或短期毒性，包括溶血和高铁血红蛋白血症。

当小鼠的原始体重下降三分之一，肿瘤体积超过1000毫米时，将其处死^三或肿瘤开始溃疡或阻碍正常运动。Kaplan–Meier曲线显示该药物组合具有显著的抗肿瘤作用（图5厘米). 亚有效剂量的ß-lap（25 mg/kg）治疗的中位生存期为49天，而车辆治疗组的中位存活时间为39.5天（图5厘米). 次有效剂量的CB-839治疗的中位生存时间为42天。与溶媒（HPßCD）治疗组相比，使用\223»-lap和CB-839联合治疗的患者中位生存期延长了24.5天（图5厘米).

重要的是，为了确保我们观察到的抗肿瘤疗效是由于两种药物的靶向作用和体外观察到的相同作用机制所致，我们分析了每种药物单独和联合的药效学特征。简言之，MiaPaCa2荷瘤小鼠在第4天接受单独载体（HPßCD）或200 mg/kg CB-839口服灌胃，每天两次，持续4天，有或没有25 mg/kg IV的单一次有效剂量\223»lap。在最后一次剂量的CB-839和ß-lap注射后30分钟，处死小鼠并采集肿瘤组织。在每种治疗条件下，从多只动物身上测量肿瘤谷氨酸水平（附加文件4：图S4C）。与载体或ß-lap单独治疗相比，CB-839和CB-839加ß-lap治疗的小鼠显示出显著较低的总体肿瘤谷氨酸水平，与GLS1级体内抑制（附加文件4：图S4C）。

然后，我们将免疫印迹肿瘤组织裂解物用于PAR聚合物的形成，作为PARP项目多动症和γH2AX来评估DNA DSBs（图5天，请参阅附加文件中的量化4：图S4D）[33]. 与我们的体外结果一致，我们发现与所有其他组相比，用ß-lap和CB-839联合治疗的小鼠显示出显著增加的PAR和γH2AX形成（图5天). 此外，我们采集了肝脏组织（图中的“正常组织”）5天)暴露于联合处理小鼠后，从小鼠身上发现没有PAR或γH2AX形成的证据（图5天)，与正常组织中对ß-lap缺乏反应一致[24,33]. 值得注意的是，肝脏中含有最高水平的NQO1号机组在小鼠（而不是人类肝脏）中，用作正常组织对核质量办公室1-生物活性药物。

接下来，为了确定治疗后肿瘤的氧化还原状态，我们测量了单独溶媒或CB-839后，无论是否进行30分钟的重叠治疗，肿瘤裂解物的GSH与谷胱甘肽二硫化物（GSSG）的比值。有趣的是，我们发现单臂CB-839或ßlap处理小鼠的GSH与GSSG比率显著降低（图第五版). 此外，通过GSH与GSSG的比值监测，联合治疗导致GSH的下降幅度更大（图第五版). 综合我们的药效学观察和抗肿瘤研究，这些数据表明，调节PDA体内谷氨酰胺代谢会导致抗氧化防御状态显著降低。因此，该药物组合显著致敏NQO1号机组-表达肿瘤，但非相关正常组织，从ßlap诱导ROS，导致DNA损伤，PARP项目过度激活和肿瘤选择性死亡。

讨论

肿瘤细胞表现出独特的代谢改变，影响肿瘤的生物学行为并具有治疗意义[34,35]. 这种改变的一个有充分记录的例子是谷氨酰胺在多种人类肿瘤中的使用增加，包括肺、前列腺、淋巴瘤和PDA[8,15,36,37]. 谷氨酰胺在细胞中具有多效性作用，包括调节自噬、信号转导、合成代谢生长和氧化还原平衡[9]. 在PDA中，突变体KRAS公司通过a促进谷氨酰胺代谢的重新编程获得1-和获得2-介导的转氨途径代替由总账1[8]. 这种转氨途径是通过维持NADPH和GSH水平降低来维持PDA肿瘤中氧化还原平衡所必需的（图1a个) [2,8,9]. 虽然这一认识提供了对PDA代谢的见解，但如何最恰当地利用这种代谢脆弱性仍有待确定。先前的研究表明，仅以该途径为靶点会导致细胞溶解，从而驱动肿瘤中的代偿代谢阻力途径。此外，潜在的全身毒性尚待确定。

谷氨酰胺依赖性转氨途径相关基因(GLS1级,政府1/2,ME1公司)和NQO1号机组，但不是总账1与其他癌症相比，在PDA中高表达（图1亿). 临床PDA病例表现为高GOT1公司到总账1或获得2到总账1肿瘤中的比率具有更差的结果（图1c个，其他文件1：图S1B）。在这里，我们发现该途径的遗传或药理学抑制使PDA对NQO1号机组-生物活性药物，ß-lap。添加ß-lap与GLS1级抑制导致PDA细胞系中肿瘤细胞的特异性和功效增强，而PDA细胞株中通常没有发现GLS1级单独抑制。与之前关于谷氨酰胺在突变株中的差异使用的报告一致KRAS公司与野生型相比KRAS公司癌症[4,8,30,38]，我们发现突变体KRAS公司细胞系，但不是野生型KRAS公司经BPTES预处理后，PDA、肺癌和乳腺癌对ßlap致敏。这些数据表明，与野生型相比，突变型，KRAS公司癌症也可能依赖谷氨酰胺维持氧化还原平衡，尽管这可能不一定涉及所讨论的转氨途径。需要进一步研究来阐明这一机制。

当考虑由以下因素产生的ROS脉冲时NQO1号机组-生物活性药物，如ß-lap’s H所示₂O（运行）₂细胞需要同样强大的抗氧化反应来抑制活性氧的积累。因此，可以想象，抗氧化剂机械的参与率和活性氧的产生率之间的竞争决定了肿瘤中癌细胞的命运NQO1号机组-生物活性药物治疗。值得注意的是，我们之前报道过过氧化氢酶（一种解毒2H的必要酶₂O（运行）₂至2H₂操作+输出₂)与正常组织相比，肿瘤组织中的表达显著下调NQO1号机组肿瘤组织中过氧化氢酶与过氧化氢酶的比值显著增加。此外，添加聚乙二醇化过氧化氢酶显著保护乳腺癌细胞株免受ßlap诱导的致死[25]. 为了维持氧化还原平衡，PDA可以利用谷氨酰胺代谢来补偿过氧化氢酶的减少。事实上，将BPTES添加到NQO1号机组-过度表达的癌细胞会降低NADPH和GSH的抗氧化防御能力，否则会抵消ßlap诱导的ROS爆发，从而导致DNA损伤加剧，PARP项目-驱动NAD+和ATP耗竭，以及代谢灾难。从机制上讲，这与单用致死剂量的ß-lap诱导的caspase-非依赖性、μ-钙蛋白酶介导的细胞死亡途径几乎相同[39]仅在低剂量下，这会增加ß-lap的治疗窗口。

在体内研究中，我们利用了GLS1级抑制剂CB-839，因为该化合物在动物体内的溶解度和稳定性远高于BPTES[11]. 与单独使用两种药物治疗的动物相比，在荷瘤小鼠中使用CB-839加ß-lap的单一方案可减缓肿瘤进展并显著提高生存率。药效学分析表明，体内联合治疗的协同机制与体外结果一致。总之，鉴于这些结果依赖于皮下PDA细胞系衍生的异种移植物，这些结果是有希望的，但在本质上是初步的，因为这些模型可能高估了治疗方案的疗效[40]. 未来的工作将在基因工程PDA小鼠模型中测试联合治疗方案[41]. 然而，我们应该注意到，由于缺氧环境和血供有限，皮下异种移植模型确实代表了胰腺癌研究的一个具有挑战性的微环境。

结论

PDA患者迫切需要新的治疗方法。通过组合GLS1级抑制（例如CB-839）和NQO1号机组-生物活性药物（如β-lap，ARQ761），我们利用PDA对谷氨酰胺氧化还原平衡的依赖性，以及肿瘤选择性过度表达NQO1号机组通过使用一种具有生物活性的独特试剂来诱导细胞死亡。联合治疗GLS1级抑制剂加ß-lap解决了与任何一种药物单独相关的局限性。也就是说，这种组合有望提高这些药物耐受剂量下的疗效；本研究中使用的浓度与患者可达到的浓度相关（NCT01502800、NCT02071862、NCT02071888和NCT02071 927）[11,42]. 此外，我们注意到，基于缺乏PAR和DNA损伤形成，CB-839加ß-lap联合治疗的动物在正常肝组织中没有表现出增加的细胞毒性。这些结果加强了NQO1号机组表达以实现细胞死亡。总的来说，这些发现说明了一种合理的组合策略，通过以下方式来针对PDA对谷氨酰胺的依赖性GLS1级抑制，与NQO1号机组-生物活性药物，并提供概念验证，以保证在更大的临床前背景下进行分析。

方法

细胞培养

A549、MiaPaCa2、DAN-G、SW1990、MPanc96、SUIT2-013-NQO1+/-、HPAFII、ASPC1、PL45、H596、Hs766T、BxPC3、MBA-MD-231+/-和MCF7细胞系从ATCC获得，测试支原体污染，并在含有10%胎牛血清（FBS）的完全Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中生长。H2122和H661细胞系是UTSW的John Minna博士慷慨捐赠的。如前所述，生成了SUIT2-013和MDA-MB-231 NQO1缺陷细胞系和高效细胞系[24]. DMEM（无谷氨酰胺）购自Sigma-Aldrich。FBS购自Fischer Scientific。谷氨酰胺、GSH-还原乙酯、OAA和苹果酸二甲酯购自Sigma。IMR90细胞系在含有10%FBS的MEM中生长。所有细胞在37°下与5%CO孵育₂.

试剂和化学品

ß-Lap在50 mM储备溶液中合成、纯化和制备，如前所述[18]. BPTES和DIC购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。CB-839由Calithera Biosciences（加利福尼亚州旧金山）提供。

存活分析

在克隆形成存活分析中，将细胞以2×10的比例放置在10-cm的平板上⁵每个平板的细胞数，用±BPTES预处理48小时，然后用适当的ß-lap剂量处理2小时。然后将细胞胰蛋白酶化，并将其置于6孔板上，每孔100、500或1000个细胞置于2 mL完整培养基中。增殖7天后，将平板在PBS中清洗，菌落在甲醇/结晶紫中固定；所有克隆测定结果均表示为%存活率（治疗组/对照组，T/C）。使用CellTiter-Glo分析（Promega）评估细胞活力。如上所述，用±BPTES对细胞进行电镀和预处理。然后在6×10的条件下对细胞进行电镀⁴100μL培养基中96 well板中每孔的细胞数。第二天，用适当剂量的ß-lap处理细胞2小时，然后在处理48小时后检查ATP水平；细胞活力表示为相对细胞活力%（T/C）。如前所述，使用7天的DNA分析评估相对细胞存活率，并报告为相对存活率%（T/C）[43]. 结果报告为六份至少三个独立实验的平均值±标准误差（SE）。在这些分析中，这种剂量的ß-lap（4μM，2 h）通常在MiaPaCa2细胞系中产生80-90%的致死率。

谷胱甘肽、NAD（P）H、H₂O（运行）_2,和总ROS分析

以下测定从Promega购买：GSH/GSSG-Glo、NAD/NADH-Glo、NADP/NADPH-Glo和ROS-Glo，并按照制造商的指示使用。使用细胞渗透荧光探针CellROX®（分子探针）检测细胞内总ROS水平，该探针在ROS氧化时发出红色荧光。简单地说，在37°C下用5μM CellROX®和ß-lap培养细胞30分钟，然后在4%多聚甲醛中固定。流式细胞术分析ROS生成。

siRNA敲除

使用Opti-MEM和Lipofectamine RNAiMAX将siRNA瞬时转染到细胞中48小时（Life Technologies），用于以下酶：GLS1、ON-TARGET和GLS1 SMARTpool；GLS1，5′-GAUGGAUUGUUGUAAUGGU-3′；GLUD1，5′-CUCCACUCUUCACAU-3′；GOT1，5′cucuaacccugagccucuu-3′；ME1，5′-GACACUUAGAUUAAGAUU-3′；和GOT2，5′GCCUUUAAGAGAGACACA-3′。所有siRNA均购自Sigma。培养48小时后，用胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies）分离细胞，并接种以进行治疗分析或裂解以分析击倒效率。在Opti-MEM和Lipofectamine中生长48小时的细胞增加了它们对单用siScr组的ßlap的敏感性。

蛋白质印迹

如前所述进行蛋白质印迹[25]. 用于蛋白质检测的主要抗体包括：GLS1（ab93434，Abcam）、PARP1（F-2，Santa Cruz）、PAR（Trevigen，Gaithersburg，MD）、Actin（C-2，SantaCruz，肌动蛋白）、小亚基钙蛋白酶（EPR3324，Abcam）和53BP1（Bethyl Laboratories）。

人类异种移植抗肿瘤，药效学分析

商业化获得无胸腺Nu/Nu裸鼠雌性小鼠（18–20 g）（Harlan）。通过注射2×10产生人类异种移植物⁶将PBS/Matrigel中的MiaPaCa2细胞皮下移植到6周龄小鼠体内。在指定时间用数字卡尺（Fisher Scientific）测量肿瘤，并计算肿瘤体积（长度×宽度² × 0.5). 皮下肿瘤平均大小≥100 mm时开始治疗^三小鼠经口灌胃给予CB-839，静脉注射（逆序）给予ß-lap（如HP \223,CD-\223]-lap）或两者兼用或以载体（HP \223；CD；1:9，v/v；Sigma-Aldrich）作为对照。治疗方案包括五剂ß-lap，每隔一天服用一剂，持续10天。每天两次给予CB-839，连续10天。用无毒剂量（200 mg/kg）的CB-839治疗皮下肿瘤小鼠，同时使用或不使用低效剂量的HPßCD-\223»-lap（25 mg/kg）。当肿瘤达到>1000mm时，处死皮下肿瘤小鼠^三根据IACUC。通过Kaplan–Meier曲线，使用log-rank检验评估总体生存率的统计显著性趋势。在药物治疗期间和之后，每周给小鼠称重三次，未观察到任何毒性。所有动物研究均按照UT西南医学中心动物护理和使用委员会批准的方案进行。

统计

所有图表均绘制为平均值，误差条表示标准偏差。回归分析、方差分析和双尾学生t吨在GraphPad Prism 6中使用Holm/Sidak多重比较校正进行统计显著性测试。第页值通过以下方式表达*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001.