MiR-1287-5p通过与磷脂酰肌醇3-激酶CB的相互作用抑制三阴性乳腺癌生长，从而使细胞对PI3Kinase抑制剂敏感

摘要

背景

非编码RNA，特别是microRNA被发现是癌症发生和发展的主要调节因子。我们研究的目的是发现和表征功能尚未明确的microRNA在人类乳腺癌发生中的功能。

方法

在一种无偏见的方法中，我们利用一个已建立的乳腺癌（BC）干细胞形成模型系统（“乳腺球检测”）来确定乳腺癌发生过程中的整个miRNome改变。使用BC患者的临床样本评估新确定的miRNA候选物的人类相关性。一个有希望的候选基因miR-1287-5p被进一步研究了其对癌症几个特征的影响。分子作用模式通过全转录组分析、电子预测工具、miRNA-相互作用分析、表型分析和药物敏感性分析进行表征。

结果

在其他几种微RNA中，与正常乳腺组织相比，miR-1287-5p在乳腺球和人类BC组织中显著下调(第页 < 0.0001). 低表达水平与BC患者预后不良显著相关。MiR-1287-5p显著降低体内细胞生长、细胞周期S期细胞、凤尾鱼非依赖性生长和肿瘤形成。此外，我们确定PIK3CB是miR-1287-5p的直接分子相互作用物和BC的新预后因子。最后，PI3Kinase途径化学抑制剂与miR-1287-5p模拟物结合可增加三阴性BC细胞的药理学生长抑制潜力。

结论

我们的数据首次确定miR-1287-5p参与人类BC，并提示对难以治疗的三阴性BC进行治疗干预的潜力。

翻译相关性

由于缺乏对分子和遗传特征的了解，三阴性乳腺癌是一种侵袭性变体，治疗选择有限。微RNA被描述为所有类型上皮性癌症致癌的主要调节因子，使用基于微RNA的治疗方法的临床试验已进入人体试验阶段。对三阴性乳腺癌中哪些microRNA以及microRNAs如何相关的基本了解可能会提高对发病机制的理解，并为新的治疗方案带来潜力。在这项研究中，我们补充了证据表明，其中一种microRNAs，miR-1287-5p，在乳房和乳腺癌组织中表达下调，这些低表达水平与乳腺癌患者生存率低有关。基于这些临床相关观察，我们在细胞系和小鼠中全面表征了miR-1287-5p，并首次将这种微小RNA鉴定为三阴性乳腺癌的肿瘤抑制因子。此外，miR-1287-5p直接与PI3Kinase信号通路的成员相互作用，并使细胞对PI3Kinse抑制剂敏感。我们的研究首次提供了证据，证明miR-1287-5p有助于乳腺癌的发生和miR-1287-5p与PI3K酶抑制剂的递送，这可能是三阴性乳腺癌患者的一种新的治疗策略。

背景

2017年，乳腺癌（BC）占美国女性所有新诊断癌症的近30%[1]. 就临床结果、生物学行为和治疗反应而言，BC是一种异质性疾病[2]. 根据基因组表达模式，BC可分为几个亚型，包括管腔A、管腔B、富含人表皮生长因子受体2型（HER2）、基底样、克劳丁低和正常样亚型[三,4]. 许多研究报告称，与其他类型的基底细胞癌患者相比，基底细胞样基底细胞癌女性的无复发时间和总生存时间更短[5]. 基底样乳腺癌具有所谓的三阴性乳腺癌（TNBC）的许多重叠特征，这是一种常见的免疫组化工作流程定义的类别[5]. TNBC的特征是缺乏雌激素受体（ER-）和孕酮受体（PR-），同时缺乏HER2受体表达。TNBC患者预后不良，无病生存期短，总生存期短并且在最初诊断后的第一年内早期复发或远处复发的风险增加[6]. 由于缺乏对生物学的了解以及缺乏新的药物靶点的识别，TNBC的分子靶向治疗方法很少，包括最近在BRCA1突变肿瘤中建立的PARP抑制剂[7]. 因此，寻找影响TNBC细胞生长和致癌的新分子因素是一项尚未满足的医学需求，需要制定新的策略来预防癌症进展和BC-相关死亡。

MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，通过各自mRNAs的转录后靶向性负调控蛋白编码基因的表达[8]. 这些小的内源性RNA分子，长度约为22个核苷酸，在进化上无处不在，表明它们参与了广泛的遗传调控和免疫相关途径[9,10,11,12]. 已经证明，miRNAs参与实体肿瘤的癌症发病机制，通过调节蛋白质的形成，可以显性或隐性作用[13,14]. MiRNAs也可能作为诊断、预后和预测BC和其他类型癌症疗效的有希望的生物标记物[15,16,17,18]. 所谓的乳房球试验是由Dontu及其同事开发的，是一种体外细胞培养模型，用于在非粘附条件下作为肿瘤球生长的人类乳腺上皮细胞[19]. 这些乳房球是多细胞的三维结构，含有更多的乳腺干细胞和未分化的祖细胞[19]. 肿瘤干细胞（CSC）理论表明，CSC或具有干细胞特征的细胞由于其引发肿瘤和维持肿瘤的能力，在致癌、肿瘤生长、转移和癌症复发中是一个重要因素[20]. 在本研究中，我们的目的是根据干细胞相关乳腺球中的富集情况，确定在BC致癌过程中起作用的新miRNAs。基于基于全球microRNome的分析和无偏见的方法，我们进一步深入探讨了一种尚未表征的miRNA，miRNA-1287-5p，在TNBC致癌过程中的作用。

材料和方法

细胞培养

在本研究中，我们使用了三阴性的BC细胞系SUM159、BT549、MDA-MB-231、MDA-MB-468和HCC1937；内分泌受体阳性的T47D、MCF7和BT474；HER2受体阳性HCC1937和SKBR3[20]. BC细胞株SUM159购自Asterand（美国密歇根州底特律）；KPL-1来自DMSZ（德国布伦瑞克）；BT549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474、T47D、HCC1419、HCC1937、SKBR3和胚胎肾细胞系HEK-293均来自美国型培养物收集（ATCC；美国加利福尼亚州马纳萨斯）。BT549、T-47D、HCC-1419和HCC1937细胞维持在RPMI 1640中（我-谷氨酰胺，Gibco，Darmstadt，德国）10%胎牛血清（FBS）金（英国剑桥Biochrom）和1%青霉素/链霉素（用于所有使用的细胞系：青霉素：10000单位/ml，链霉素：10.000μg/ml，Gibco-）；SUM159细胞在含有1 mmol/L的Ham’s F12中生长我-谷氨酰胺（GE Health Care Life Sciences，Pittsburgh，USA）、2 mmol/L HEPES缓冲液（Gibco）、5μg/ml actrapid胰岛素（Novo Nordisk，Vienna，Austria）、1μg/ml氢化可的松（Sigma Aldrich，Vienna，Austria）、1%青霉素/链霉素（Gibco）和5%FBS金（Biochrom）。MDA-MB-231、MDA-MB-468、KPL-1和HEK-293细胞保存在高糖DMEM（Gibco）、10%FBS金（Biochrom）和1%青霉素/链霉素（Gibco-）中。MCF-7细胞在含有2mmol/L厄尔盐的MEM中生长我-谷氨酰胺（PAA，Pasching，奥地利）、1%丙酮酸钠（Gibco）、1%青霉素/链霉素（Gibco-）和10%FBS金（Biochrom）。BT474在RPMI 1640中培养（带有我-谷氨酰胺（Gibco）、20%FBS金（Biochrom）、1%青霉素/链霉素（Gibco-）和10μg/ml Actrapid胰岛素（诺和诺德）。SKBR3在McCoy的5A改良培养基（Gibco；w/o我-谷氨酰胺、2,2 g/L碳酸氢钠）1%青霉素/链霉素（Gibco）和10%FBS金（Biochrom）。所有细胞系均在5%的CO中生长₂37°C下的增湿培养箱。BC细胞系在奥地利格拉茨医科大学核心设施的细胞库中通过STR分析进行鉴定（试剂盒：Promega，PowerPlex 16HS系统；Cat.No.DC2101，最后测试日期：2016年3月3日）。使用Venor GeM支原体检测试剂盒（德国柏林Minerva Biolabs）进行支原体检测。在获得约70%的融合后，根据制造商的说明，按照标准TRIzol方案（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA USA）分离总RNA。

球体试验（“哺乳动物试验”）

为了确定与乳腺癌发生相关的新的miRNAs，我们制作了如前所述的肿瘤球，并进行了轻微的修饰[19]. 具体而言，使用胰蛋白酶/EDTA将贴壁生长的BC细胞系分离为单个细胞，并使用无血清MEBM（Lonza，Basel，Switzerland）培养基（SFM）辅以1xB27补充剂（Gibco）、20ng/ml人表皮生长因子（EGF；Peprotech，汉堡，德国）、10 ng/ml人类碱性成纤维细胞生长因子（FGF；Petrotech）、20 IU/ml肝素（Baxter，维也纳，奥地利）和1%抗生素/抗真菌溶液（Thermo Fisher Scientific，含有10000单位/ml青霉素、10000μg/ml链霉素和25μg/mL Gibco两性霉素B）。采集球体和相应的粘附生长细胞，提取RNA，使用miRNeasy Kit进行微阵列分析（德国希尔登市齐根）。

MiRNA微阵列分析

为了评估粘附生长细胞中与三种不同BC细胞系中的哺乳动物相比，生物三倍体中粘附生长细胞的差异表达miRNAs，根据制造商的说明，使用miRNeasy Mini Kit（德国希尔登市齐根）分离总RNA。在生物分析仪BA2100（安捷伦；福斯特城，加利福尼亚州）上检查总RNA的质量。所有样本显示RIN（RNA完整性数）>9。根据制造商的协议，对Affymetrix GeneChip miRNA Arrays v3（Affymetix；Santa Clara，CA，USA）进行整个转录组分析。杂交是在格拉茨医科大学医学研究中心的核心设施分子生物学中进行的。原始数据可在基因表达总站（GEO；登录号GSE103218）获得。miRNA表达水平的热图由R软件生成。

患者队列/临床数据

为了比较匹配的正常乳腺和癌症组织样本，由意大利福格森圣吉奥瓦尼罗通多Viale Padre Pio Casa Sollievo della Sofferenza肿瘤实验室提供了131名BC患者的队列。为满足机构要求，获得了道德批准和知情同意。如前所述进行RNA制备和定量PCR[21]. 通过qRT-PCR测定miR-1287-5p的相对表达水平，并比较癌组织与正常组织的表达差异。为了在第二个队列中进行确认，我们下载并分析了癌症基因组图谱项目（TCGA；https://cancergenome.nih.gov网站/)针对BC患者（下载日期：2018年12月）。详细而言，3级Illumina miRNASeq（Illumina测序技术：基因组分析仪）用于miRNA表达分析。我们从“isoform_quantification”文件中导出了每个miRNA成熟形式的“reads_per_million_miRNA_mapped”值。我们从cbioPortal下载了TCGA乳腺浸润癌患者的临床信息(http://www.cbioportal.org/). 对于原发性肿瘤的miRNA-Seq数据，我们从Genomic data Commons data Portal的“Isoform Expression Quantification”文件中推导出成熟形式hsa-miR-1287-5pMIMAT0005878 hsa-miR-4521 MIMAT0019058 hsa-miR 27a-5p MIMAT0004501 hsa-miR-3150b-3p的“reads_per_million_miRNA_mapped”值(https://portal.gdc.cancer.gov网站/). log2转换应用于miRNASeq数据。我们最终获得了916例原发性肿瘤和93例正常邻近组织的miRNA数据。其中有92对匹配的肿瘤-正常对照。为了能够确定正常组织和肿瘤组织中每个miRNA的表达差异，我们首先采用Shapiro-Wilk检验来验证数据是否符合正态分布。因此吨-分别采用非参数Mann-Whitney-Wilcoxon检验来评估miRNA表达与组织类型之间的关系。我们进行了配对和非配对比较。使用方框和胡须图（方框图表示第一个四分位（下限）和第三个四分位数（上限），胡须表示四分位间距的1.5倍）来可视化数据。在R统计环境（版本3.4.1）中进行分析(http://www.r-project.org/). 所有测试均为双侧测试，在0.05水平上具有统计学意义。为了测试miR-1287-5p的预后意义，我们使用了公开的在线工具(http://kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast_mirna)分析来自不同队列的1262例患者数据[22]. 为了分析PI3KCB的预后价值，我们使用了两种公开的在线工具(http://www.oncolnc.org（英文）/对于TCGA数据集），对于验证队列，使用Kaplan-Meier绘图仪(http://kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast)如前所述[23].

miRNAs和mRNAs的定量RT-PCR

为了量化BC细胞系中的miRNA水平，根据制造商的方案，使用miScript II RT Kit（Qiagen）逆转录1μg总RNA。以下miScript引物分析（Qiagen）用于验证粘附生长细胞中的miR-1287-5p，并与miRNA微阵列中的乳腺球进行比较：Hs_miR-1287_1 miScript Primer Assay和Hs_RNU6-2_1 miScript Primers Assay。根据协议，使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen）在LightCycler 480实时PCR系统（德国曼海姆罗氏诊断公司）上进行miScript引物分析。以技术和生物三倍进行测量，RNU6-2被用作管家。使用2^-ΔΔCT根据Livak和Schmittgen的方法[24].

为了检测mRNA表达水平，根据制造商的协议，使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）逆转录1μg总RNA。使用特异于PIK3CB公司,LAYN公司,RAP2B型,座椅模块组件2,可编程逻辑控制器5,CORO2A公司,间隙、和6号机组.附加文件中列出了引物序列1：表S1。根据制造商的标准协议，使用QuantiTect SYBR Green PCR Kit（Qiagen）在LightCycler®480实时PCR系统（Roche Diagnostics）上进行定量RT-PCR。家政基因GAPDH和U6的算术平均值用于归一化，并使用标准2计算相对基因表达水平^-ΔΔCT方法[24]. 每个实验在三个独立的生物复制中进行。

蛋白质提取和蛋白质印迹

使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Sigma-Aldrich）提取BC细胞的总蛋白。在所有细胞蛋白中，20μg重新悬浮在4x Laemmli缓冲液（BioRad，Hercules，CA，USA）中，并在95°C下加热10分钟。蛋白质通过4-15%的Mini-PROTEAN®TGX™预制凝胶（BioRad）分离，转移到硝化纤维素膜（BioRad）上，并用3%的非脂肪干乳在1xTris缓冲盐水（TBS；BioRads）/0.1%吐温-20（Sigma-Aldrich）中封闭膜1小时。进行免疫印迹，检测PIK3CB特异性抗体（mAb#3011，CellSignaling，在Tris缓冲盐水中的1%非脂干乳中以1:1000稀释/0.1%吐温-20）和β-肌动蛋白（AC-15，Sigma-Aldrich，在Tris缓冲盐水中1%非脂干乳中以1:5000稀释/0.1%吐温-20）使用HRP缀合的抗小鼠抗体（Dako，Glostrup，Denmark，稀释度1:5000）或抗兔抗体（Santa Cruz，稀释度1:1000）进行检测。在BioRad ChemiDoc Touch设备上使用增强化学发光检测系统（Super Signal West Pico，Thermo Scientific，Rockford，IL）进行可视化。使用ImageJ（NIH，Bethesda，Maryland）软件对蛋白质表达进行相对定量。因此，测量感兴趣蛋白质的带密度并除以负载控制β肌动蛋白的密度。

miR-1287-5p模拟物/抑制剂的体外瞬时转染

为了实现miR-1287-5p在BC细胞系中的瞬时过表达或减少表达，miR1287-5p模拟物（Syn-hsa-miR-1287-25p miScript miRNA模拟物，50 nM）、抑制剂（Anti-hsa-miR-1287-5p miScript-miRNA抑制剂，50 nM）和推荐的阴性对照物（miScript抑制剂阴性对照物和AllStars阴性对照物，50nM）根据制造商（Qiagen）的方案建议使用。使用快速正向转染方案转染6孔板中的细胞；根据制造商的说明，使用HiPerFect转染试剂方案（Qiagen），使用反向转染方案转染96周板中的细胞。为了确认达到的过度表达或沉默水平，使用定量RT-PCR与相应的对照进行比较。

慢病毒转导的miR-1287前体和成熟型miR-1287-5p的稳定过表达

将MDA-MB-231和SUM159细胞接种在24孔板中的完整生长培养基中培养过夜。24小时后，用含有ViralPlus Transduction Enhancer（1:200，ABM，加拿大不列颠哥伦比亚省里士满）和8μg/ml聚brene（Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯）的完整生长培养基替换培养基。通过添加10μl miR-1287前体（LentimiRa-GFP-hsa-miR-1287病毒前体，ABM）、miR-1287-5p慢病毒颗粒（LentiminRa-GFP-hsa-miR病毒，ABM。用1μg/ml盐酸嘌呤霉素（Gibco）连续筛选稳定转染细胞4周，并用qRT-PCR测定表达水平。

细胞生长测定

为了测试miR-1287-5p表达水平的调控是否影响BC细胞的细胞生长速度，我们通过应用WST-1增殖试验（德国曼海姆应用科学罗氏公司）测量了短期效应（96小时）。将细胞系接种在96孔板中，并使用反向转染方案和HiPerFect转染试剂（Qiagen）在六个技术重复中用模拟物或抑制剂瞬时转染。稳定的慢病毒转导细胞也接种在96周的平板中。细胞培养时间为24至96小时，每24小时，根据制造商的建议在微孔中添加WST-1增殖试剂。使用SpectraMax Plus（Molecular Devices，Germany）在450nm的波长和620nm的参考波长下测量比色变化。分别进行三个独立的生物复制。

为了通过第二种独立的方法确认miR-1287-5p表达水平改变后的细胞生长变化，进行了克隆形成试验（即集落形成试验）。转染24小时后对瞬时转染细胞进行胰蛋白酶处理。胰蛋白酶化后，根据细胞系的不同，计数细胞并将其接种在6孔板中，以100–500个细胞/孔的速度进行集落形成分析。细胞在37°C和5%CO下培养₂10～21天后，细胞固定，染色0.01%(w个/v（v）)结晶紫（Sigma-Aldrich）在20%甲醇和PBS中的溶液。计数菌落数，并以生物和技术三等分进行每个实验。

异种移植实验

为了测量体内miR-1287-5p的作用，我们将稳定过度表达miR-1287-25p的SUM159细胞或对照转导细胞注射到5周龄雌性裸鼠（NU/NU Crl:NU-Fox1nu，Charles River Laboratories；德国苏尔兹菲尔德）中。简言之，1×10⁶将细胞重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS；与基质凝胶、康宁1:1混合）中，然后皮下注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。将miR-1287-5p过度表达的细胞注射到左侧乳腺脂肪垫中，将对照细胞注射到右侧。共有7只小鼠用于体内实验。每隔几天通过卡尺测量监测肿瘤生长情况，并在肿瘤直径达到10 mm之前处死动物。采集肿瘤进行组织学分析，并根据方程式计算肿瘤体积五（毫米^三)=（宽度）² ×长度/2。所有动物工作均按照奥地利联邦科学研究部（BMWF）机构动物护理和使用委员会批准的协议（BMWFW-66.010/0046-WF/V/3b/2016）进行。对于miR-1287前体过表达细胞的实验，异种移植物是由外部公司独立产生的。该实验由一家商业外部机构（德国柏林柏林布赫EPO有限公司）进行，该机构对本研究的其他结果一无所知。1 × 10⁶将SUM159细胞以20μl的体积在乳腺fad-pad中皮下注射给NMRI:nu/nu小鼠（法国巴黎Janvier实验室）。每组7只小鼠接种细胞。所有动物实验都是在德国动物保护法的指导下进行的，并得到了当地主管部门的批准。每天观察小鼠的健康状况。细胞接种4周后处死小鼠，测量肿瘤相对于起始体积的大小。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7分析

根据制造商的说明，采用Caspase-Glo 3/7分析（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）测量Caspase 3和7的活性。对于瞬时转染实验，将BC细胞系接种在96周的平板中，并使用反向转染方案和HiPerFect转染试剂（Qiagen）在五个技术复制品中进行转染。瞬时转染48小时后测量Caspase 3和7的活性。慢病毒稳定转导的细胞也接种在96周的平板中，48小时后测量凋亡。添加底物后，使用发光仪（德国奥尔滕贝格BMG Labtech公司的LumiStar公司）测量发光。

碘化丙啶DNA染色流式细胞术分析细胞周期

使用快进方案（Qiagen）将100000个细胞接种到六孔板中，并在48小时后进行细胞周期分析。将细胞在4°C的75%乙醇中固定过夜，重悬于0.2%FBS/PBS中，RNAse A处理（Qiagen，100μg/mL），用碘化丙啶（PI；Sigma-Aldrich）以40μg/mL的终浓度染色，并在BD LSRII流式细胞仪上通过流式细胞术进行分析。所有分析分三次进行，每个样本统计10000次门控事件。

软琼脂试验

将2500个细胞置于含有0.35%低胶凝温度琼脂糖（Sigma-Aldrich）的完整生长培养基中，再将含有0.5%琼脂（Sigma-Aldrich）的2ml生长培养基置于35mm培养皿中，以测定软琼脂中miR-1287-5p表达改变的细胞集落形成效率。细胞在37°C和5%CO下培养₂最多4周。用在20%甲醇中的0.005%结晶紫（Sigma-Aldrich）对菌落进行染色，并使用显微镜计数菌落数。

体外瞬时siRNA转染

用短干扰siRNA瞬时转染BC细胞株PIK3CB（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位β）（Hs_PIK3CB_5，Qiagen，20nM）根据HiPerFect转染试剂方案（Qiagen），在六孔板中使用快速正向转染方法，在96孔板中采用反向转染方法敲除感兴趣的基因。采用全明星阴性对照siRNA（Qiagen，20 nM）作为阴性对照；使用AllStars Cell Death Control siRNA（Qiagen，20 nM）确认转染效率。

MiR-1287-5p目标识别

为了检测假定的miR-1287-5p靶mRNA，我们将mRNA微阵列应用于稳定miR-1287过度表达的SUM159细胞。根据手册，使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen；Hilden，Germany；Cat.No.217004）从慢病毒转导的SUM159 miR-1287-5p过表达细胞与生物三倍体对照细胞中分离出总RNA。如前所述，对Affymetrix Human Gene 2.0 ST mRNA阵列（Affymmetrix；Santa Clara，CA，USA）进行了整个转录组分析。具体而言，根据制造商的协议，使用Affymetrix WT PLUS试剂盒（Affymetix；加州圣克拉拉；产品目录号703147）扩增250 ng总RNA。此外，使用RNA 6000纳米芯片（安捷伦；福斯特城，加利福尼亚州；Cat.No.5065-4476）在生物分析仪BA2100（加利福尼亚州福斯特城安捷伦）上对cDNA进行质量检查。对约250 ng生成的cRNA进行的检测显示，片段大小大于2000 nt，适合进一步处理。按照手册的建议制备杂交鸡尾酒，并在45°C的温度下在阵列上杂交18小时，同时在杂交炉中旋转。根据手册（射流站协议：FS450_0002），使用Affymetrix GeneChip®射流站450进行清洗和染色（GeneChip®HT杂交、清洗和染色试剂盒；Affymetix，Santa Clara，CA；产品目录号900720）。使用Affymetrix基因芯片扫描仪GCS3000扫描阵列。

用Affymetrix Expression Console EC 1.3.1对杂交对照和预分析进行评估。杂交是在格拉茨医科大学医学研究中心的核心设施分子生物学分部进行的。使用Partek Genomics Suite v.6.6（RMA（背景校正、实验中所有芯片的分位数归一化、log2转换、中值抛光汇总））执行数据预处理和过滤。原始数据可从基因表达总览获取（登录号GSE103388）。

电子目标预测

我们基于全球基因表达分析进行了生物信息学靶点预测，包括前面描述的不同方法[25,26]. 筛选miR-1287-5p（与对照细胞相比）下调至少2倍的转录物的基因表达数据。该子集与从miRWalk 2.0数据库中获得的一系列miRNA-目标预测（包括12种不同的算法）合并[27]. 然后，从ENSEMBL中获得转录子子集的3′UTR序列。随后对这些序列进行筛选，以确定是否存在不同的miR-1287-5p种子匹配类型（8mer、7mer-A1、7mer-m8、6mer和offset 6mer位点）[8].

萤光素酶报告基因测定

为了证实miR-1287-5p与假定靶点PIK3CB的直接相互作用，将预测的PIK3CB 3′UTR结合位点的65 nt区域克隆到含有荧光素酶的pEZX-MT06载体（美国马里兰州Rockville Genecopoeia）中，该载体为野生型miR-1287-25p靶序列或突变序列。使用空对照质粒（Genecopoire）作为参考对照。对于荧光素酶分析，HEK细胞在转染前一天接种在24孔板中。24小时后，用200 ng pEZ-MT06miRNA报告载体（野生型=5′TGGGTGTCTCTCTGAGTCCTGGCAAC）联合转染细胞ATCCAGCA公司AAACTACTGCTTATTCTCCAAAGAATTGG 3′CS-HmiT011246-MT06–01；基因Copoeia），突变质粒（5′TGGGTGTCTCTCTGAGTCCTGGCAAC阿塔塔塔AAACTACTGCTTATTCTCCAAAGAATTGG 3′CS-HmiT011246-MT06-01；GeneCopoeia）或阴性对照（空质粒CS-HmiT011246-MT06–01；GeneCopoeia），和50nM miR-1287-5p模拟或AllStars阴性对照（Syn-hsa-miR-1287-25p miScript miRNA模拟或All-Stars阴性对照，Qiagen），使用Lipofectamine 2000转染试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Scientific）和Opti-MEM还原血清培养基（Thermo科学）。转染24小时后采集细胞，并根据用户手册执行Luc-Pair荧光素酶检测试剂盒2.0。在三个独立的生物复制品中使用光度计（德国奥尔滕堡BMG LabTech的LUMIStar Omega）测量发光度。萤火虫荧光素酶的发光与雷尼利亚计算荧光素酶，并使用空白对照质粒使荧光素酶活性正常化。

PI3K抑制剂敏感性分析

在选择性PI3K抑制剂实验中，未经处理或瞬时转染的BC细胞在96-well板中另外用2μM和10μM BYL719（Alpelisib，一种选择性PI3Kα抑制剂）以及25μM和50μM CAL-101（Idelalisib，选择性p110δ抑制剂）处理。所有抑制剂均通过以下渠道购买Selleckchem.com网站（奥地利维也纳尤比奥）。在应用WST-1分析之前，暴露时间为96小时，并与未经处理的对照细胞进行比较。

统计

所有统计分析均使用SPSS版本23软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。未付费学生的吨测试或Mann-WhitneyU型进行了测试。A双面第页 < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

为了确定在乳腺癌发生中具有未知功能的miRNAs，我们开始在代表不同BC亚型的细胞系中对整个miRNome进行分析，以确定乳腺球和亲本贴壁生长细胞之间的差异（图1a） ●●●●。使用这种方法，我们鉴定了几种差异表达的miRNA，它们在乳腺癌发生中的功能目前尚不清楚（图1b、 c）。其中一个miRNAs，miR-1287-5p，在哺乳动物中表现出最高水平的下调，因此被选择通过对四个BC细胞系（包括两个TNBC细胞系）进行独立的qRT-PCR检测来确认（附加文件2：图S1A）。

图1

一用于分析整个miRNome的细胞系MCF7、BT474和SUM159的单个乳房球的代表性图片。b–c类热图和相应的表格显示了与粘附生长细胞相比，乳房中前10个下调和上调的miRNA的折叠变化。天与相应的正常组织相比，癌组织中miR-1287-5p的表达水平显著降低（下调4.6倍）。e（电子）在1262例乳腺癌患者的独立外部大队列中，低水平的miR-1287是生存的一个负面预后因素（HR=危险比）

为了解释BC细胞系发现与人类癌症的相关性，我们比较了131个匹配癌组织和相应正常邻近组织样本的患者队列中miR-1287-5p的表达水平。显著降低表达水平（4.6倍；第页 < 与正常乳腺组织相比，癌组织中检测到miR-1287-5p（0.001，Wilcoxon试验）（图1d） ●●●●。从TCGA数据集中获得的93个正常组织和916个癌组织的第二个独立队列中证实了癌组织中的低表达水平(第页 < 0.0001，附加文件2：图S1B）。最后，我们探讨miR-1287-5p是否决定BC患者的命运。使用1262名患者的公共平台[22]在这个大型多数据集队列中，低水平的miR-1287-5p被证明是生存的负面预后因素(第页 = 0.016，图1e） ●●●●。我们在乳腺球阵列分析中发现的另外三种miRNAs（miR-27a-5p、miR-4521和miR-3150）也被证实在TCGA数据集的人类BC样本中显著上调或下调（附加文件2：图S1C–E）。

基于我们在临床队列中的发现，我们开始了一系列实验来阐明miR-1287-5p在BC生物学中的作用。首先，我们在11个不同的BC细胞系中测量了miR-1287-5p，并证实了无论潜在的分子亚型如何，该miRNA在所有BC细胞中的表达（附加文件2：图S2A）。

由于BC在潜在生物学、预后和治疗策略方面是一种非常异质性的疾病，因此我们将研究重点放在了三阴性BC（TNBC）上。成功建立瞬态增益后（使用miR-1287-5p模拟；附加文件2：图S3A）和损耗（使用miR-1287-5p抑制剂；附加文件2：图S3B），我们探索了四种独立TNBC细胞系（SUM159、MDA-MB-231、MDA-MB-468和BT549）对细胞生长的影响。与对照细胞相比，miR-1287-5p在72至96小时后的异位过度表达导致生长速度显著降低（附加文件2：图S4A–D）。为了通过第二次独立分析确认此短期细胞生长分析的结果，我们对细胞株SUM159、MDA-MB-231和BT549使用了菌落形成单位（CFU）分析（MDA-MB-468细胞在所用实验条件下未形成任何菌落）。该独立生长试验证实，miR-1287-5p的短暂过度表达导致所有三种细胞系中的菌落数量减少（图2a–f）。此外，使用miR-1287-5p抑制剂，我们获得了相反的效果，与参考对照组相比，观察到越来越多的菌落（图2a–f）。此外，这些生长抑制作用并不局限于TNBC细胞系，因为我们可以在管腔A（MCF7）和HER2阳性（SKBR3）细胞中发现类似的作用（附加文件2：图S5A，B）。

图2

a–f使用菌落形成单位（CFU）分析法在三种不同的三阴性细胞系中短暂过度表达或抑制miR-1287-5p对细胞生长的影响。条形图表示与对照转染细胞相比菌落的相对数量（百分比）(n个 = 3) (一,c、，和e（电子）)，显示了具有代表性的图片(b条,日期：，和（f）). Mir-1287-5p模拟物导致细胞生长显著下降，而Mir-1287-5p抑制剂则产生相反的效果。克–小时通过WST-1增殖试验和(i–l)两种不同三阴性乳腺癌细胞系的CFU检测。miR-1287-5p的稳定过度表达导致细胞株SUM159和MDA-MB-231的细胞生长显著降低*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001

为了进一步证实附加模型系统中瞬时转染实验的结果，我们生成了SUM159和MDA-MB-231细胞系，稳定地过度表达成熟的miR-1287-5p的-5p形式（附加文件2：图S5C，D）。在WST-1分析中，与对照细胞相比，miR-1287-5p的稳定过度表达导致细胞生长速度显著降低（图2g、 h）和CFU测定（图2i–l）。

为了确认体内潜在的抗增殖表型，我们使用成熟miR-1287-5p稳定过度表达的SUM159细胞来评估雌性裸鼠乳腺脂肪垫中的肿瘤生长。宏观肿瘤评估显示，与对照细胞相比，miR-1287-5p过表达细胞中的肿瘤明显更小（图三a–c）。组织形态计量学分析证实，在miR-1287-5p过度表达的BC细胞中，在最大肿瘤直径处评估的肿瘤横截面积显著减少（图三d、 e）。因此，体内实验完全支持我们的体外研究结果，即与miR-1287-5p表达水平不变的细胞相比，miR-1287-25p表达高的BC细胞显示出显著的肿瘤生长减少。

图3

稳定成熟型miR-1287-5p过度表达SUM159细胞的体内异种移植实验。将MiR-1287-5p过表达细胞注射到裸鼠左侧乳腺脂肪垫中，与注射到右侧部位的对照SUM159细胞相比。a–c与对照细胞相比，miR-1287-5p过度表达的细胞产生的肿瘤明显更小。(天)HE染色中检测到的最大肿瘤面积的组织形态计量学测量条形图显示SUM159 miR-1287-5p过度表达细胞中的肿瘤面积明显较小*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001. (e（电子）-（f）)对照细胞和miR-1287-5p过度表达SUM159的典型组织学图片（HE染色，×4倍放大，插入物×40倍放大）

我们继续研究前体miR-1287现象是否与成熟形式的miR-1287-5p具有与一般成熟的-5p和-3p miRNAs相同的作用，这种作用是由其相应的前体miRNAs-内源性生成的。成熟的-5p和-3p形式可能具有相似或相反的生物学效应，其中一种miRNA实际上可以控制前体miRNA的生物学效应。为此，我们生成了两种不同的细胞系（SUM159和MDA-MB-231），其中miR-1287前体稳定过表达（附加文件2：图S5E，F）。WST-1分析、CFU分析和体内肿瘤生长表明，两种受试BC细胞系的miR-1287前体过度表达后，细胞生长显著下降（附加文件2：图S6A–H）表示前体和成熟miR-1287-5p的一致生物功能。

在多个实验和细胞模型系统中一致证明miR-1287-5p表达调节BC细胞的细胞生长后，我们测试了观察到的效应是否受凋亡调节。其他文件2：图S7表明miR-1287-5p表达改变后，未检测到凋亡改变的迹象（即通过效应器caspase3/7活性测量）。瞬时转染miR-1287-5p模拟物或抑制剂的细胞中，Caspase 3/7活性没有显著改变（附加文件2：图S7A）或稳定miR-1287前体（附加文件2：图S7B）和稳定成熟型miR-1287-5p过度表达细胞（附加文件2：图S7C）与对照细胞进行比较。

应用细胞周期分析进一步评估miR-1287-5p在BC细胞中的细胞作用模式。miR-1287-5p的稳定过度表达导致G1期细胞数量增加，S期细胞数量减少（附加文件2：图S8A，B）。在强制瞬时miR-1287-5p过度表达后，在BC细胞系中也观察到这种表型，而miR-1287-25p抑制剂导致相反的表型（附加文件2：图S8C，D）。

应用非锚定生长（软琼脂）试验，这是一种常用的细胞干细胞体外特征，并表明瞬时转染miR-1287-5p模拟物的BC细胞（SUM159和MDA-MB-231）产生的软琼脂集落数量较少，而用miR-1287-5p抑制剂处理的细胞表现出相反的表型（附加文件2：图S9A、B）。同样，成熟形式的miR-1287-5p稳定过度表达细胞在软琼脂中产生的菌落数量显著低于对照细胞（附加文件2：图S9C，D）。

在建立这种表型后，我们重点研究了miR-1287-5p的分子作用模式，并对其可能的相互作用伙伴进行了表征。进行基于微阵列的全转录组分析，将SUM159 miR-1287-5p稳定的过表达细胞与对照细胞进行比较。如前所述其他miRNAs[28]miR-1287-5p过表达抑制了大量在其3′UTR中至少含有一个miR-1287-25p种子匹配的mRNA（附加文件2：图S9E）。基于这些分析结果，我们进一步关注最下调的转录物，因为它们可能是关键的直接交互伙伴。这个策略给我们带来了多达126个miR-1287-5p过度表达细胞中下调的基因（附加文件1：表S1）。基于“材料和方法“第节，我们确定了78个假定的互动伙伴。我们进一步选择了其中六个(PIK3CB公司,LAYN公司,RAP2B型,座椅模块组件2,可编程逻辑控制器5、和CORO2A公司其他文件三：表S2），其中文献检索搜索暗示了对任何类型癌症中肿瘤生长的一般影响。在六个基于阵列的基因中，只有三个可以通过独立的qRT-PCR被独立地证实为显著下调(PIK3CB公司,LAYN公司、和RAP2B型; 其他文件2：图S9F）。在电子分析中，一个很有希望包含8个种子匹配的候选者是PIK3CB公司我们发现，在所有四种TNBC细胞系中短暂过度表达miR-1287-5p后，mRNA和蛋白质水平下调（图4a、 b）。生物信息学预测工具提示miR-1287-5p在3′UTR中的结合位点PIK3CB公司（图4c） 。验证miR-1287-5p和PIK3CB公司交互，是3′UTR的一部分PIK3CB公司将预测与miR-1287-5p相互作用的基因克隆到荧光素酶报告载体中，并与miR-128 7-5p模拟物共同转染到HEK细胞中。荧光素酶显著降低/雷尼利亚观察到的比率PIK3CB公司用合成miR-1287-5p转染但不用扰乱的RNA转染的构建体（图4d） ●●●●。此外，观察到的荧光素酶/雷尼利亚当我们共转染含有3′UTR突变种子序列的荧光素酶报告载体时，减少被消除PIK3CB公司在预测的与miR-1287-5p相互作用的位点使用单交换核苷酸（图4d） ●●●●。为了证明PI3KCB在人类BC中的临床相关性，我们对1005名BC患者的TCGA数据集进行了Kaplan-Meier曲线分析。如图所示4e、 PIK3CB高表达与不良临床结局相关(第页 = 0.0408). 使用另一个公开可用的数据集[23]，我们证实高水平的PIK3CB与低无复发生存率相关(n个 = 3955,第页 < 0.001; 其他文件2：图S10）和整体生存率低(n个 = 1402,第页 = 0.029; 附加文件2：图S11）。

图4

三阴性乳腺癌细胞中miR-1287-5p的靶向鉴定。一qRT-PCR证实PIK3CB公司转染48小时后，强制异位miR-1287-5p过度表达后，所有四个受试三阴性BC细胞系的mRNA。b条Western blot分析证实，转染48小时后，在所有受试细胞系（SUM159、BT549、MDA-MB-231和MDA-MB-468）中瞬时转染miR-1287-5p后，PIK3CB在蛋白水平上显著下调。使用ImageJ对蛋白质通道进行相对定量（通道上方的数量）。c（c）预测的miR-1287-5p相互作用位点位于PIK3CB公司mRNA。如图所示，生成了两个PIK3CB结构（WT=miR-1287野生型相互作用位点，MT=突变相互作用位点）。天联合转染PIK3CB野生型或突变结构和控制HEK细胞中的/miR-1287-5p模拟物后的荧光素酶活性。进行了三个独立的生物学实验，并显示了平均值和标准偏差。e（电子）TCGA数据集中1005名BC患者的高PIK3CB表达与不良临床结局相关*第页 < 0.05

最后，测试是否PIK3CB公司表达现象与miR-1287-5p的细胞效应相关，我们进行了敲除实验PIK3CB公司使用短干扰RNA。成功击倒PIK3CB公司在mRNA上实现（附加文件2：图S10A）和蛋白质水平（附加文件2：图S10B）。PIK3CB水平的降低导致细胞生长下降（图5a、 b）细胞周期从S期向G1期转变（图5c） ●●●●。

图5

a–c短暂沉默假定的miR-1287-5p靶点后，对SUM159、MDA-MB-231和BT549细胞系进行克隆形成分析PIK3CB型与细胞系中的miR-1287过度表达相比，导致类似的表型。PIK3CB沉默后细胞产生较少集落(一,b条)PIK3CB静音也会导致G1相位停止(c（c）)在所有四个细胞系中。d–gSUM159和BT549细胞经两种不同浓度的PI3Kinase抑制剂与对照干扰RNA（10μM的Allstar阴性对照）或miR-1287-5p模拟物（10μM的miR-1287-25p模拟）联合处理(天,e（电子）)CAL101（Idelalisib）和（f）,克BYL719（阿尔卑斯山）。与用干扰控制RNA处理的细胞相比，用miR-1287-5p模拟物处理的细胞对CAL-101和BYL719处理的两种受试细胞系更敏感*第页 < 0.05

为了根据我们的新发现研究TNBC细胞潜在的新治疗脆弱性，我们测试了一种结合miR-1287-5p模拟物和选择性异型体特异性PI3K抑制剂的方法。首先，我们测试了三种不同PI3K抑制剂CAL-101（Idelalisib，GS-1101；选择性p110δ抑制剂）、BYL719（Alpelisib；选择性PI3Kα抑制剂）和GSK2636771（PI3Kβ选择性抑制剂）的剂量依赖性生长抑制作用。对于CAL-101和BYL719，我们在所有四个测试的TNBC细胞系中观察到了剂量依赖性细胞毒性，而对于GSK2636771，其中两个细胞系中没有观察到明显的生长抑制，因此没有进一步随访该抑制剂（附加文件2：图S12C–H和S13A–D）。最后，我们用不同浓度的CAL101和BYL719处理两个TNBC细胞系，每个细胞系都与miR-1287-5p模拟物结合。如图所示5d–g，与仅使用化学化合物（结合miRNA模拟对照）相比，联合治疗可提高TNBC细胞的细胞毒性并降低细胞生长。与miR-1287-5p模拟物转染的细胞相比，转染miR-1287-25p模拟体的细胞对CAL-101和BYL719治疗更敏感(第页 < 0.05).

讨论

在我们目前的研究中，我们从一种无偏见的方法开始，以确定尚未在BC起始和进展中描述的新miRNAs。MiR-1287-5p尚未在BC中进行系统表征，因此对其临床作用和细胞/分子作用模式进行了进一步评估。

关于miR-1287-5p在BC中的作用的数据很少，但这种miRNA的存在和下调似乎与我们的数据一致。之前的一项研究通过miRNASeq分析确定了miR-1287在BC组织中的下调[29]. 另一项最近发表的研究同样表明，miR-1287在BC组织中持续下调，在BC患者的血清样本中也有所降低[30].

miR-1287在BC中的生物学作用尚不清楚。在视网膜母细胞瘤中，miR-1287被发现下调[31]而Wang等人报告称，miRNA-1287在大多数滤泡性淋巴瘤病例中表达增加[32]. 在喉癌中，miR-1287被认为是早期诊断的潜在生物标志物，因为与正常样本相比，它在喉癌样本中下调[33]. 在宫颈癌中，miR-1287似乎被DNA超甲基化灭活[34]. 所有这些研究都支持先前的观点，即miRNA的生物学功能是不同的，因为一个特定的miRNA可以作为肿瘤MiR，也可以作为抑癌miRNA，这取决于细胞和分子背景[14].

与之前为BC报告的数据一致[29,30]，我们在两个独立的外部队列中证实了miR-1287-5p的下调。来自多个细胞和实验模型的实验数据确定了miR-1287-5p在BC中的生长抑制生物效应。此外，通过前体过度表达实验，我们证实了-5p成熟型的观察效果是前主导的生物学作用。如Almeida等人所示，-5p和-3p成熟形式可以表现出相反和不同的功能，并可能产生不同的细胞表型，这是许多miRNA研究中经常忽略的一个重要方面[35]. 虽然我们的一些体外试验（例如WST-1）中的生长抑制作用相当轻微，但在多个模型系统和细胞系中的作用是一致的，并且抑制体内肿瘤形成具有生物学意义。值得注意的是，瞬时转染/稳定转染后的表达水平与观察到的表型的增强并不完全相关，这可以通过瞬时转染中随时间变化的水平、实验之间不同的转染效率、，不同细胞系间靶mRNA表达水平的差异。更复杂的是，内源性竞争性长非编码RNA（ceRNAs）可能在细胞株之间发生变化，因此可能影响转染后miR-1287-5p表达水平与观察到的表型变化之间的非线性观察。

在miR-1287-5p和miR-1287前体过度表达后发现这种一致的表型后，我们试图确定细胞生长和miR-128 7-5p表达之间的分子联系。基于miRNA直接靶向并下调我们感兴趣的基因的假设，我们能够确定miR-1287-5p的几个潜在相互作用伙伴。在电子靶点预测工具中，再加上对已知调节细胞生长的基因的全面文献搜索，将列表缩小到一个有希望的候选基因，PIK3CB公司它是PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）途径的成员，该途径的过度激活有助于人类癌症的进展[36]. 这种信号级联的启动可诱导癌细胞的增殖、运动和存活[37]. IA类PI3Ks是由p85调节亚基和p110催化亚基组成的异二聚体，哺乳动物表现出每个亚基的多种异构体。p110催化亚单位为p110α、β或δ。PIK3CB公司（PI3-激酶p110β/β）是催化亚基的IA类PI3K亚型之一[38].PTEN公司（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是人类癌症中最常见的突变抑癌基因之一，可拮抗PI3K信号通路[39]. 下调PIK3CB公司PTEN缺陷细胞系中的基因导致PI3K途径失活，随后在体内外环境中抑制生长，这表明PTEN缺陷肿瘤依赖于PIK3CB[40]. 与…对比PIK3CA公司，其中大多数激活点突变发生[41]人们对其知之甚少PIK3CB型最近的临床前研究表明，不同的PI3K亚型在细胞信号传导和癌症中发挥着不同的作用，这就是为什么异形选择性抑制剂现在正在成为临床试验中被广泛探索的药物[41,42]. 在最近发表的一项研究中，作者通过肿瘤内注射PIK3CB公司在膀胱上皮癌中，siRNA诱导凋亡并触发PTEN突变肿瘤的消退甚至比PI3Kβ抑制更有效[43].

最后，我们探讨了选择性PI3K抑制剂和miR-1287-5p模拟物处理TNBC细胞的领域。以TNBC中的PI3K/AKT途径为目标是一个持续且快速扩展的知识领域[42]. 我们观察到，通过将miR-1287-5p与选择性抑制剂idelalisb和alpelisib组合，生长抑制作用增强。这两种药物目前都被批准用于非霍德金淋巴瘤（idelalisib）[44]或在BC中测试（alpelisib）[45]. 虽然观察到的影响很有趣，但对这些数据的解释应该谨慎。进一步的临床前测试，包括其他BC亚型（尤其是雌激素阳性亚型）和体内研究，对于进一步遵循这一概念是必要的。

结论

总之，我们证实了先前关于miR-1287在乳腺癌中功能丧失的报道。此外，我们确定了miR-1287-5p的细胞和生物作用，并确定了潜在的分子相互作用伙伴。PI3KCB在乳腺癌中的新作用和潜在的药物联合治疗方法需要进一步研究miR-1287-5p作为BC可能的治疗靶点的作用，以改进TNBC患者的治疗方法。