miR-629-3p可能是三阴性乳腺癌肺转移的新生物标志物和潜在治疗靶点

摘要

背景

不同的乳腺癌亚型对转移部位有不同的倾向性。值得注意的是，肺部是三阴性乳腺癌（TNBC）首次远处复发的最常见部位。寻找新的肺转移生物标志物对提高TNBC的预后具有重要意义。在这项研究中，我们试图确定基于microRNA（miRNA）的TNBC肺转移生物标记物和治疗靶点。

方法

本研究共招募了669名无新发IV期TNBC的患者。在发现队列中进行了miRNA分析。在训练和验证队列中分别评估候选miRNAs的诊断准确性和预后价值。通过生物信息学分析以及体外和体内试验，进一步评估候选miRNAs的生物学功能以及潜在靶点。

结果

在发现集中，我们发现miR-629-3p在两个转移灶中都特异性上调（折叠改变144.16，P（P） < 0.0001）和原发肿瘤（折叠变化74.37，P（P） = 0.004）。在训练集中，ROC曲线显示miR-629-3p在区分肺转移患者和无复发患者方面具有较高的诊断准确性（AUC 0.865，95%CI 0.800-0.930，P（P） < 0.0001). 尽管miR-629-3p在验证数据集中预测了较差的总生存率和无病生存率，但在多变量分析后没有显示出显著性。值得注意的是，logistic回归分析证实miR-629-3p是肺转移的独立危险因素（OR 4.1，95%CI 2.5-6.6，P（P） < 0.001). 抑制miR-629-3p可显著降低TNBC细胞的活性和迁移，并显著抑制体内肺转移。此外，我们还鉴定了白血病抑制因子受体(LIFR公司)作为miR-629-3p的直接靶点。

结论

miR-629-3p可能是通过LIFR介导的TNBC肺转移的一种新的生物标记物和潜在的治疗靶点。

背景

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1]. 这是一种异质性疾病，分为五种不同的基因亚型[2]. 三阴性乳腺癌（TNBC），其特征是缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）[三]，由于早期复发和远处内脏转移的倾向，显示出最差的临床结果[4]. 重要的是，不同的乳腺癌亚型对转移部位有不同的倾向性[5,6]. 特别是，肺是TNBC首次远处复发的最常见部位，占转移病例的40%[三]. 因此，更好地了解肺转移的分子机制和开发新的靶向治疗对提高TNBC的临床疗效至关重要。

到目前为止，在TNBC特定部位识别预测性转移生物标志物的研究很少[5,7]. 在许多提议的转移机制中[8,9]，microRNA（miRNA）调节的转录动力学已成为一个关键步骤[10,11,12,13]，部分原因是能够同时瞄准多个路径效应器[14,15]. 最近，基于miRNA的抗癌疗法已经被探索出来，可以单独使用，也可以与其他疗法联合使用[16].

在本研究中，手术标本的miRNA表达谱显示，miR-629-3p是一种与TNBC肺转移相关的特异性miRNA，并被证实为不良预后标志物。尽管miR-629-3p已被报道在多种临床侵袭性癌症的细胞侵袭和转移中发挥重要作用[17,18,19,20]miR-629-3p在乳腺癌中的致癌作用尚不清楚。值得注意的是，我们发现白血病抑制因子受体（LIFR）是一种重要的转移抑制因子[21,22,23,24,25,26]是miR-629-3p的直接靶点。

方法

临床标本和研究设计

本研究招募了1999年1月至2013年12月在中山大学肿瘤中心接受根治性手术治疗（乳腺切除术或保乳手术，并进行腋窝评估）的连续患有浸润性TNBC的女性患者。排除了炎性乳腺癌、同期双侧癌、其他恶性肿瘤病史或病理标本档案不完整的患者。病理科在诊断时使用免疫组织化学（IHC）或荧光原位杂交技术评估受试者的ER、PR和HER2状态。TNBC是根据圣加仑专家共识定义的[27]. 两位病理学家独立地重新评估了所有载玻片，任何分歧都以协商一致的方式解决。病理肿瘤分期根据美国癌症联合委员会第七版所述标准进行评估AJCC癌症分期手册根据诺丁汉综合组织学分级系统，将肿瘤分为组织学I–III级。根据国家综合癌症网络的乳腺癌指南进行辅助化疗和放射治疗。这些患者的随访于2015年12月31日完成。简言之，在总RNA分离和质量控制后，将669例TNBC患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）手术标本分配到发现集、训练集或验证集。图1描述了临床研究设计的不同阶段。

图1

临床研究设计。遇见肺转移，肿瘤原发性乳腺癌，微小RNA微小RNA，正常邻近乳腺组织正常，逆转录聚合酶链反应逆转录聚合酶链反应；TNBC公司三阴性乳腺癌

发现集

4例伴有肺转移的TNBC患者接受了肺叶切除或节段切除术。对肺转移瘤（Met）、原发性乳腺癌（肿瘤）和正常邻近乳腺组织（正常）的配对手术标本进行miRNA分析。与正常人相比，Met和肿瘤中表达水平改变的miRNAs被认为与肺转移有关。此外，还准备了另四名10年无病生存期（DFS）TNBC患者的原发肿瘤和相应的正常乳腺组织进行miRNA分析；该组差异表达的miRNAs被认为与促进肺转移无关。

训练套件

从较大的肺转移患者队列中收集的原发性肿瘤(n个 = 68）和无复发的患者(n个 = 对候选miRNA进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析。利用ROC曲线确定miRNA在诊断肺转移中的疗效。

验证集

在由525份TNBC样本组成的验证队列中，评估了候选miRNA对总生存率（OS）、DFS、无远处转移生存率（DMFS）和无局部复发生存率（LRRFS）的预后影响。还评估了候选miRNA与临床病理特征之间的相关性。此外，使用单变量和多变量logistic回归模型评估候选miRNA与远处复发部位之间的相关性。

miRNA分析

使用人类miRNA V19.0微阵列（Platform GPL19730，G4872A；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）进行miRNA表达谱分析，该微阵列由基于Sanger miRBase 19.0版本的2006年人类miRNA探针组成。使用RecoverAll从FFPE组织中提取并纯化总RNA^TM（TM）总核酸分离试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA）符合制造商的说明。使用特征提取版本10.7软件（安捷伦科技公司）将微阵列图像信息转换为光斑强度值。使用GeneSpring软件12.6版（安捷伦科技公司），通过分位数算法对原始数据进行标准化。然后使用对数基数2分析对数变换。成对样本t吨该试验用于识别表达显著改变的miRNAs（倍变>1.5，P（P） < 0.05). 所有微阵列数据均保存在国家生物技术信息中心基因表达总览（GEO）[GEO:GSE80038]。王子2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)用于筛选特异性肺转移相关miRNA以进行进一步分析。

定量实时聚合酶链反应分析

使用TRIzol试剂提取组织样品或细胞的总RNA（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）对miRNA进行逆转录。根据制造商的说明，使用TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行qPCR反应，一式三份。使用7900 HT序列检测系统（Applied Biosystems）或IQ对结果进行量化^TM（TM）5多色实时PCR检测系统（Bio-Read Laboratories，Hercules，CA，USA）。所有引物均由Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）合成。将miRNA的表达归一化为U6小核RNA（snRNA），并使用比较周期阈值（2^−ΔΔC类 _T型)方法[28].

靶基因预测及富集分析

使用miRWalk 2.0数据库预测miRNAs的假定靶基因(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/miRretsys-self.html) [29]它集成了八个预测程序，包括DIANA-microT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR2、RNA22和TargetScan。为了提高预测的准确性，仅保留至少五个程序预测的目标基因用于进一步分析。为了注释候选miRNAs的生物功能，将目标基因列表提交给DAVID生物信息学资源6.8(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)据此进行了基因本体（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径富集分析[30]. 褶皱富集度>1.5的通道和P（P） < 0.05被认为是有趣的。

细胞系和动物

9个人类乳腺癌细胞系（MDA-MB-453、MDA-MB-4 68、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3和HCC-38）和1个正常乳腺上皮细胞系（MCF-10A）从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得。这些细胞根据供应商的说明进行培养，并在购买后6个月内传代。6周龄雌性BALB/c裸鼠（中国广州广东医学科学院动物实验中心）在中山大学实验动物中心的特定无病条件下进行饲养。

转染和稳定工程细胞系

根据制造商的说明，使用Lipofectamine™2000试剂（Invitrogen）将培养在六孔板中的细胞转染miRNA模拟物、antagomiRNA、RNA、短发夹RNA及其相应的阴性对照。所有miRNA寡核苷酸、RNA表达慢病毒质粒或RNA干扰慢病毒质粒均由GeneCopoeia（美国马里兰州罗克维尔）合成，并在附加文件中进行了描述1：图S1。在随后的体内研究中，分别使用pEZX-AM03和pEZX-MR03慢病毒递送系统实现了对MDA-MB-231细胞中miR-629-3p的稳定抑制和MCF-7细胞中miR-629-3p的异位表达。加扰的非沉默载体被用作阴性对照。稳定的选择标记是潮霉素（用于抗miR-629载体）和嘌呤霉素（用于前miR-629载体）。所有载体均由GeneCopoeia构建，并在附加文件中进行了描述2：图S2。

细胞增殖试验

转染的MDA-MB-231和MCF-7细胞以5×10的密度接种^三将每个孔的细胞放入96个平板中，并在37°C下培养24小时。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析在24、48、72和96小时评估细胞活力[31]. 在570 nm处测定吸光度值（SpectraMax 250分光光度计；Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）。

细胞迁移和侵袭检测

使用伤口愈合测定法检测细胞迁移。在细胞接种后24小时，通过用无菌的1ml移液管尖端刮擦，使汇合的单层线性损伤。伤后48小时用倒置显微镜观察并拍摄迁移过程。使用cellSens Dimension软件（Olympus Life Science，Waltham，MA，USA）评估伤口闭合程度。

如前所述，使用transwell小室分析法分析细胞侵袭[31]. 简单地说，将细胞接种到24孔细胞外基质（ECM）培养板插入物中的基底膜基质上（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）。将含有10%FBS的培养基作为化学引诱剂添加到下室。额外48小时后，用棉签轻轻取出非侵入细胞和ECM。位于腔室下侧的侵袭细胞被结晶紫染色，成像，并在五个随机选择的区域进行计数。

荧光素酶分析

确定miR-629-3p是否调节LIFR公司直接通过与预测的3′-非翻译区（UTR）结合位点的相互作用，使用MDA-MB-231细胞进行荧光素酶报告分析。的全长LIFR公司3′-UTR由GeneCopoeia合成，并使用PCR生成的片段克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体（Ambion）中，作为野生型LIFR公司3′-UTR荧光素酶载体（wt-LIFR）。前七个互补核苷酸LIFR公司结合到miR-629-3p的种子区域，通过定点突变（Stratagene，San Diego，CA，USA）产生突变LIFR公司3′-UTR荧光素酶载体（mut-LIFR）。将wt-LIFR和mut-LIFR与miR-629-3p模拟物或干扰寡核苷酸共同转染到MDA-MB-231细胞中。根据制造商的说明，使用双光发光报告基因检测试剂盒（Applied Biosystems）在转染48小时后测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。

蛋白质印迹

如前所述进行蛋白质印迹[31]. 简单地说，从细胞系中提取的蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA），该膜用5%脱脂奶粉封闭，并用一级抗LIFR抗体培养（1:200稀释，ab101228；Abcam，Cambridge，UK）。使用过氧化物偶联二级抗体（1:2000稀释）和增强化学发光Western印迹检测试剂对目标蛋白进行可视化（美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室），并使用生物图像智能量化器1-D（2.2.1版；日本东京Nihon Bio Image Ltd.）对其进行量化。抗β-肌动蛋白抗体（Boster Biological Technology，Pleasanton，CA，USA）被用作蛋白质负荷控制。

动物研究

对于肿瘤生长分析，上述稳定转染细胞（5×10⁶将细胞/小鼠）原位注射到小鼠的乳腺脂肪垫中(n个 = 每组5人）。根据先前的研究，将雌二醇颗粒（0.72 mg，60天释放；美国佛罗里达州萨拉索塔创新研究所）皮下植入MCF7细胞小鼠体内，以诱导肿瘤生长[32]. 每4天测量一次肿瘤的大小，并按照椭球体积公式计算：π/6×长×宽²（毫米^三). 接种后4周，在麻醉下用小鼠切除原发肿瘤。

对于肺转移研究，细胞（1×10⁵细胞/小鼠）重新悬浮在0.1 ml PBS中，并注入小鼠的侧尾静脉(n个 = 每组5人）。使用Xenogen IVIS光谱成像系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，PerkinElmer）监测肺转移的进展。再过8周，用麻醉下的小鼠分离肺部，由三名专业病理专家计算每只小鼠肉眼可见的肺转移结节数，随后在显微镜下通过苏木精和伊红（H&E）染色进行验证[22].

对于组织学分析，玻片用H&E染色以进行显微镜观察。如前所述，采用标准链霉亲和素/过氧化物酶染色法进行IHC[33]. 简言之，在脱蜡和复水后，将载玻片与抗LIFR的一级抗体（1:50稀释度，ab101228；Abcam）在4°C下孵育过夜。使用EnVision进行免疫反应性分析^TM（TM）检测系统（K500711；丹麦Glostrup Dako）。使用Eclipse 80i显微镜（日本大阪尼康仪器公司）对结果进行评估和捕获。

统计分析

所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics 22.0版统计软件包（IBM，Armonk，NY，USA）进行。连续变量（平均值±SD）和二分法变量（频率和百分比）分别采用单向方差分析和χ2检验进行比较。ROC分析检测miR-629-3p预测肺转移的特异性和敏感性。miR-629-3p的最佳阈值由Youden指数确定（通过最大化敏感性和特异性之和）[34]用于区分验证队列中miR-629-3p表达的高低。使用Spearman秩相关系数评估miR-629-3p与临床病理特征的相关性对值。生存分析采用Kaplan-Meier方法和log-rank检验。单变量分析中的重要预后因素包括在多变量分析的Cox比例风险回归模型中。最终模型的HR显示为95%的CI。使用以OR和95%CI表示的logistic回归，在多变量模型中评估远处复发部位的风险因素。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

与肺转移相关的miRNAs

发现阶段的所有样品均符合制造商建议的质量控制参数。如图所示2a个，miRNA的监督分级聚类清楚地区分了正常乳腺组织和肿瘤。此外，肺转移组的miRNA（肿瘤和Met）与无复发组的miRNA（肿瘤）分开聚集。与相应的正常乳腺组织相比，肺转移组中45个miRNA和17个miRNA的表达分别在Met和Tumor中显著改变，其中11个miRNA重叠（图2b、c). 为了区分与肺转移相关的特异性miRNA，排除了三种miRNA（hsa-miR-21-3p、hsa-miR21-5p和hsa-miR 211-3p），因为在无复发组的原发肿瘤中发现它们上调。其余8个失调的miRNAs（图2亿)被证实可能参与肺转移过程，尤其是miR-629-3p，其在Met和Tumor中上调了70倍以上(P（P） < 0.001）（图2厘米). 随后的qRT-PCR重新评估发现集中八个miRNA的表达水平与微阵列结果一致。

图2

三阴性乳腺癌（TNBC）肺转移患者的特异性microRNAs（miRNAs）发生改变。一热图中的层次聚类清楚地区分了正常乳腺组织和肿瘤。样品以列的形式呈现，不同表达的miRNA以行的形式呈现。彩色条形图显示标准化日志的范围₂信号。b条和c（c）描述肺转移患者和无复发患者中miRNAs失调表达模式的维恩图和相应表格。不管预后如何，有三种miRNAs过度表达。肺转移组的转移性（Met）和原发性肿瘤（Tumor）中有8个miRNAs失调，尤其是miR-629-3p，其上调幅度最大(P（P） < 0.001)

miR-629-3p对TNBC肺转移的诊断价值

为了进一步评估发现集的发现，在两个独立的TNBC队列中检测了原发性肿瘤中miR-629-3p的表达水平。附加文件中总结了训练和验证集中患者的特征三：表S1，匹配良好。如图所示3a年miR-629-3p在肺转移组的表达显著高于无复发组(P（P） < 0.001). ROC曲线分析表明，miR-629-3p在区分肺转移患者和无复发患者方面具有较高的诊断准确性（AUC 0.865，95%可信区间0.800–0.930，P（P） < 0.0001）（图3亿). 当miR-629-3p的敏感性和特异性分别为75%和91.3%（尤登指数最大值）时，miR-629-13p相应的相对表达值为0.6（与U6 snRNA表达标准化），这被视为进一步分析的最佳截止值。

图3

miR-629-3p对三阴性乳腺癌肺转移患者的诊断准确性和预后影响。一在训练集中，原发性肿瘤的定量实时聚合酶链反应分析表明，肺转移组miR-629-3p的表达水平显著高于无复发组(P（P） < 0.001).b条ROC曲线分析表明，miR-629-3p是诊断肺转移的重要生物标志物，AUC为0.865（95%CI 0.800–0.930，P（P） < 0.0001).c（c）,d日、和e（电子）miR-629-3p的高表达与总生存率降低相关(P（P） < 0.001），无病生存(P（P） = 0.002）和无远处转移生存(P（P） < 0.001）。然而，在多变量分析中调整混杂因素后，miR-629-3p未能保持显著相关性。（f）miR-629-3p表达在局部无复发生存率方面没有差异(P（P） = 0.116).miR公司微小RNA

miR-629-3p与临床病理参数的关系

在验证集中30.1%的肿瘤中观察到miR-629-3p的过度表达。如表所示1Spearman相关系数表明，miR-629-3p高表达的TNBC患者更有可能发生淋巴转移(对 = 0.139,P（P） = 0.001）以及高级阶段(对 = 0.135,P（P） = 0.002). 值得注意的是，miR-629-3p的表达与淋巴血管侵袭（LVI）之间存在强烈的正相关(对 = 0.241,P（P） < 0.0001).

表1 miR-629-3p与临床病理因素的关系

miR-629-3p对TNBC的预后影响

在验证数据集中评估miR-629-3p的预后影响。随访期中位数为43个月（范围3-199个月），该队列的5年OS和DFS分别为65.6%和57.9%。表中总结了OS、DFS、DMFS和LRRFS的单变量和多变量分析2临床病理变量，包括淋巴结转移、晚期、高分级和LVI，被确定为OS、DFS和DMFS的独立不良预后因素。一方面，值得注意的是，miR-629-3p的高表达与OS的减少有关(P（P） < 0.001），DFS(P（P） = 0.002）和DMFS(P（P） < 0.001）（图3c–e（三c–e）). 另一方面，在miR-629-3p表达方面，LRRFS没有差异(P（P） = 0.116）（图第3页). 多变量分析表明，校正混杂因素后，miR-629-3p未能保持显著相关性。关于miR-629-3p与肺转移的强相关性，进一步探讨了miR-629-13p与其他特定转移部位的相关性。

表2总生存率、无病生存率、远处无转移生存率和局部无复发生存率的预后因素的单变量和多变量分析

miR-629-3p与远处转移部位的相关性

在验证队列中，192名（36.6%）患者发生了远处转移。转移部位的单变量和多变量分析总结见表三多变量分析显示淋巴结转移是双肺的独立危险因素(P（P） = 0.046）和肝脏(P（P） = 0.014）转移。同时，晚期（II/III）独立增加骨转移风险(P（P） = 0.005). 有趣的是，LVI阳性与脑部复发率较高有关(P（P） < 0.001). 值得注意的是，单变量分析表明miR-629-3p的高表达不仅与肺转移有关(P（P） < 0.001），但也增加了脑转移的风险(P（P） = 0.002). 然而，多变量逻辑回归分析表明，miR-629-3p是肺转移的独立危险因素（OR 4.1，95%CI 2.5-6.6，P（P） < 0.001），但对脑转移没有影响（OR 1.6，95%CI 0.8–3.1，P（P） = 0.147).

表3转移部位危险因素的Logistic回归分析

miR-629-3p的GO注释和KEGG通路分析

八个程序预测的miR-629-3p的靶基因列在附加文件中4：表S2。至少有五个程序预测了2267个靶基因。GO注释分析（附加文件5：表S3）表明候选靶点的生物过程显著（富集倍数>1.5，P（P） < 0.05）与细胞增殖、细胞迁移、细胞基质粘附、血管发育和淋巴管发育有关。KEGG分析发现，miR-629-3p的候选靶点组在52条途径中显著富集（富集倍数>1.5，P（P） < 0.05），包括一些众所周知的致癌信号通路，如Ras(P（P） = 0.0002），河马(P（P） = 0.0005），转化生长因子（TGF）-β(P（P） = 0.0009），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）(P（P） = 0.001），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt(P（P） = 0.003）和Wnt(P（P） = 0.041），如附加文件所示6：表S4。

miR-629-3p在体外促进TNBC的增殖、迁移和侵袭

通过qRT-PCR分析，在9个乳腺癌细胞系和1个乳腺上皮细胞系中检测到miR-629-3p的表达。特别值得注意的是，miR-629-3p在四种高转移性TNBC细胞系（MDA-MB-453、MDA-MB-668、MDA-MB-231和BT-549）中表现出显著上调(P（P） < 0.01）（图4a类)提示miR-629-3p可能与亚型特异性和转移的发生有关。根据miR-629-3p的表达水平，进一步使用MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞进行检测。

图4

miR-629-3p促进三阴性乳腺癌（TNBC）的细胞增殖和侵袭。一miR-629-3p在四种高度转移的TNBC细胞系中的相对表达水平显著高于非TNBC细胞系。b条3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵检测结果表明，与干扰寡核苷酸1（Scr1）相比，miR-629-3p抑制剂（抗miR-629）显著抑制MDA-MB-231细胞的活性。然而，与干扰寡核苷酸2（Scr2）相比，miR-629-3p的异位表达显著提高了MCF-7细胞的生存能力。c（c）和d日使用创伤愈合和跨孔分析对细胞迁移和侵袭的分析表明，miR-629-3p的强制上调显著增强了MCF-7细胞的迁移和侵袭能力，而miR-629-13p的抑制显著减弱了MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力。分析的代表性图像显示在右侧面板原始放大倍数×200。所有数据均以SE三次测量的平均值表示*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01

为了分析miR-629-3p对TNBC的生物效应，用miR-629p抑制剂（抗miR-629）或扰民寡核苷酸1（Scr1）转染MDA-MB-231细胞，用miR-629-3p模拟物（miR-628）或扰物寡核苷酸2（Scr2）转染MCF-7细胞。MDA-MB-231和MCF-7中miR-629-3p的相对表达水平，包括miR-629-13p的阳性和阴性对照，如附加文件所示7：图S3。在转染后48小时，MTT分析显示，与Scr1转染细胞相比，抗miR-629显著降低了MDA-MB-231细胞的活性(P（P） < 0.05). 然而，miR-629-3p的异位表达显著提高了MCF-7细胞的活性(P（P） < 0.05），如图所示4b个使用伤口愈合和transwell测定对转移相关的细胞运动性（如细胞迁移和侵袭）的分析表明，miR-629-3p的强制上调显著增加了MCF-7细胞的迁移和侵袭能力，而miR-629-3p的抑制显著减弱了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(P（P） < 0.01），如图4c、d.

miR-629-3p直接靶向LIFR公司

根据miRNA结合位点富集分析，miR-629-3p的假定靶点是肿瘤抑制基因(P（P） = 0.013). TSGene 2.0数据库中最新抑癌基因及其在泛癌中的特征(https://bioinfo.uth.edu/TSGene/download.cgi) [35]已识别LIFR公司作为所有八个程序预测的唯一抑癌基因。

的3′-UTRLIFR公司，包含miR-629-3p推定结合位点，如图所示第5页与与干扰寡核苷酸共转染的细胞相比，与miR-629-3p共转染后，MDA-MB-231细胞中wt-LIFR报告基因结构的荧光素酶活性明显降低(P（P） < 0.05). 相比之下LIFR公司与miR-629-3p的种子区结合可消除miR-629-13p的转录后抑制作用(P（P） > 0.05）（图5亿).

图5

白血病抑制因子受体（LIFR）是miR-629-3p的直接靶点。一假定的序列LIFR公司3′-非翻译区与miR-629-3p的种子区结合。b条野生型荧光素酶活性LIFR公司与干扰寡核苷酸共转染的细胞相比，miR-629-3p共转染MDA-MB-231细胞中的报告基因构建物显示出明显的减少。然而，突变体LIFR公司废除miR-629-3p的转录后抑制作用。c（c）定量实时聚合酶链反应分析表明，用miR-629或LIFR公司短发夹状RNA干扰质粒（shLIFR）导致LIFR公司信使核糖核酸（信使核糖核酸）水平。同时，转染抗miR-629或LIFR公司-表达慢病毒质粒（Lv-LIFR）增加了LIFR公司在MDA-MB-231细胞中与相应的阴性对照进行比较。d日Western blot分析表明，用miR-629、shLIFR或shLIFR+miR-628转染MCF-7细胞可显著降低LIFR蛋白水平(P（P） < 0.05），尤其是shLIFR+miR-629组(P（P） < 0.01). 同时，转染抗miR-629、Lv-LIFR或Lv-LIFR+抗-miR-629可显著增加MDA-MB-231细胞中LIFR的表达(P（P） < 0.05），尤其是在Lv-LIFR+抗miR-629组(P（P） < 0.01). miR-629和shLIFR对LIFR表达的抑制作用相似，也促进了抗miR-628和Lv-LIFR的作用*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01

此外，我们转染了miR-629或LIFR公司-干扰质粒（shLIFR）进入MCF-7细胞，这两种方法都能显著降低LIFR公司mRNA表达(P（P） < 0.01). 同时，用抗miR-629或LIFR公司-表达质粒（Lv-LIFR）增加了LIFR公司在MDA-MB-231细胞中与相应阴性对照进行比较(P（P） < 0.01），如图5厘米.

为了进一步证实LIFR和miR-629-3p之间的联系，我们将miR-629、shLIFR或shLIFR+miR-629MCF-7细胞转染，所有这些都导致LIFR蛋白水平显著降低(P（P） < 0.05），尤其是shLIFR+miR-629组(P（P） < 0.01). 同时，转染抗miR-629、Lv-LIFR或Lv-LIFR+抗-miR-629可显著增加MDA-MB-231细胞中LIFR的表达(P（P） < 0.05），尤其是在Lv-LIFR+抗miR-629组(P（P） < 0.01），如图5天miR-629和shLIFR对LIFR表达的抑制作用相似，也促进了抗miR-628和Lv-LIFR的作用。上述结果证实了LIFR是miR-629-3p的真正靶点。

miR-629-3p促进TNBC体内肿瘤发生和肺转移

将稳定工程化的miR-629-3p抑制MDA-MB-231细胞（Lv-anti-miR-629）和表达前miR-629MCF-7细胞（Lv-miR-628）接种到裸鼠乳腺脂肪垫中。我们发现，由miR-629-3p抑制的MDA-MB-231细胞产生的乳腺肿瘤明显小于由打乱的1-MDA-MB231细胞（Lv-Scr1）产生的肿瘤(P（P） < 0.01). 同样，与打乱的2-MCF-7细胞（Lv-Scr2）相比，MCF-7中miR-629-3p的异位表达显著增加了肿瘤生长(P（P） < 0.01）（图6a–c类).

图6

miR-629-3p促进三阴性乳腺癌（TNBC）的肿瘤发生和肺转移。一,b条、和c（c）将稳定工程化的miR-629-3p抑制MDA-MB-231细胞（Lv-anti-miR-629）和表达前miR-629MCF-7细胞（Lv-miR-628）接种到裸鼠乳腺脂肪垫中。由Lv-anti-miR-629产生的乳腺肿瘤的重量和体积明显小于由打乱的1 MDA-MB-231细胞（Lv-Scr1）产生的肿瘤。同样，与扰乱的2个MCF-7细胞（Lv-Scr2）相比，Lv-miR-629细胞显示出肿瘤生长的显著增加。d日对每只小鼠肉眼可见的肺转移结节的数量进行计数。在MDA-MB-231肿瘤小鼠中，Lv-anti-miR-629显著降低了肺部转移灶的数量。然而，Lv-miR-629增加了MCF-7肿瘤小鼠的肺转移。e（电子）苏木精和伊红染色证实肺转移（原始放大倍数×200）。（f） 箭头在肺切片的代表性大体标本中可见转移性结节。克免疫组织化学分析进一步证实miR-629-3p靶向白血病抑制因子受体(LIFR公司)原发肿瘤和肺转移瘤（原始放大倍数×400；插入，原始放大倍数×200）*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01

为了进一步研究miR-629-3p对体内肺转移的影响，我们将上述MDA-MB-231和MCF-7衍生物注入6周龄雌性BALB/c小鼠的侧尾静脉。如图所示6天，注射MDA-MB-231细胞（Lv-Scr1）的小鼠表现出明显的肺转移，而注射MCF-7细胞（Lv-Scr2）的小鼠则不太可能发生肺转移。通过抑制MDA-MB-231肿瘤（Lv-anti-miR-629）小鼠的miR-629-3p，肺转移灶数量显著减少(P（P） < 在患有MCF-7肿瘤（Lv-miR-629）的小鼠中，miR-629-3p的异位表达增加了(P（P） < 0.01). 肺切片的大体标本和H&E染色如图所示6e和fIHC分析进一步证实miR-629-3p在TNBC原发肿瘤和肺转移灶中靶向LIFR（图6 g） ●●●●。

讨论

在乳腺癌患者中，已初步确定肺转移基因特征[7]. 然而，TNBC肺转移中miRNAs表达改变的确切分子机制尚不清楚。这是首次报道miR-629-3p可作为TNBC肺转移的特异性预测因子。

因为原发肿瘤的特征通常在转移瘤中得以保留[36]，我们推断，促进TNBC高侵袭性表型的关键miRNAs的失调表达将出现在原发性和转移性病灶中。然而，目前的许多文献都集中在识别癌症差异表达基因的过程中考虑整个数据集，而忽略了个体的生物学变异[37]. 因此，我们通过使用来自每个肺转移患者的原发肿瘤、转移灶和正常乳腺组织的配对样本，在微阵列分析中评估miRNA失调，从而允许不同个体中miRNA的异质性。miRNA分析显示，与正常乳腺组织相比，转移性肿瘤坏死杆菌肺转移患者的转移灶和原发癌中miR-629-3p最常见上调。此外，未复发TNBC患者的原发肿瘤和正常乳腺组织中miR-629-3p的表达水平没有差异。然后，我们在两个独立的TNBC队列中证实了miR-629-3p对肺转移的预测能力。此外，在验证队列中，miR-629-3p的高表达与淋巴转移和LVI呈强阳性相关。值得注意的是，我们还评估了miR-629-3p与其他远端器官（包括大脑、肝脏和骨骼）之间的关系。有趣的是，miR-629-3p与脑转移密切相关，但经多变量分析后未能保持显著相关性；这表明miR-629-3p可能以器官特异性方式发挥作用。随后的体外和体内试验支持了我们的发现，即miR-629-3p增加了肺转移的风险。

miR-629-3p表达的异常升高已在包括肝脏在内的各种癌症中得到描述[17]，肺[38,39]、结肠、淋巴瘤、卵巢、前列腺和睾丸[20]，表明miR-629-3p在这些情况下发挥促肿瘤作用。然而，对于miR-629-3p在乳腺癌中的失调机制知之甚少[18,19]. 在本研究中，抗miR-629-3p显著降低MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力（TNBC和转移）。鉴于miR-629-3p在TNBC细胞中的表达水平远高于管腔型乳腺癌细胞，我们假设促进肺转移的信号通路部分由两种不同的乳腺癌亚型共享，其中miR-629p/LIFR轴起着重要作用，而与ER表达无关，这需要进一步研究。尽管miR-629被报道通过miRNA-炎症反馈回路抑制肝细胞癌细胞凋亡[17]，我们没有发现证据表明TNBC细胞中的凋亡受到miR-629-3p的影响（数据未显示）。这种差异表明miR-629-3p的致癌作用在不同的癌症类型中不同，并且这些作用是通过不同的直接或间接靶点介导的。

关于miR-629-3p的有效靶点，Hatziapostolou等人证明了肝细胞癌中涉及miR-629的新型miRNA反馈炎症环路，其通过抑制肝细胞核因子4α启动肝细胞癌的发生[17]. miR-629也被报道调节编号1诱导DNA修复并增加肺癌风险的基因[38]. 为了更准确地识别目标基因，我们使用八个miRNA预测数据库结合GO富集和KEGG通路分析进行了电子分析。因此，预测的靶点在许多已知的致癌信号通路中显著富集，如Ras、TGF-β、Hippo、MAPK、5′-腺苷单磷酸活化蛋白激酶、PI3K-Akt、局灶粘附、Wnt和肿瘤坏死因子，为miR-629-3p在TNBC中的致癌作用提供了令人信服的证据。此外，我们重点研究了几个抑癌基因；其中，寿命经qRT-PCR、蛋白质印迹和萤光素酶报告基因分析评估，是miR-629-3p的一个有前途的候选靶基因。

LIFR属于gp130受体家族，已被公认为多种癌症的抑癌基因[40]包括乳房[21,22,23]，肝细胞[24,25,26]和胰腺癌[41]. 值得注意的是，最近的两份报告强调了LIFR是一种新型的乳腺癌转移抑制因子。Johnson等人证明，LIFR的丢失使休眠乳腺癌细胞增殖并在骨骼中特异性定植。此外，他们发现，积极定植于肺部的乳腺癌细胞也缺乏功能LIFR公司体外对LIF无反应[21]. 同时，Ma等人发现LIFR公司与乳腺癌的肺转移呈负相关，即miR-9的下游和Hippo信号的上游[22]. 此外，我们还注意到Nandy等人的研究[42]他证明miR-125a通过LIFR调节人类原发性乳腺癌细胞中的Hippo信号，从而影响干细胞。有趣的是，在我们研究的发现集中，我们发现在预后良好的TNBC中miR-125b在统计学上下调（折叠变化2.3，P（P） = 0.005). 这些数据可以在GEO数据库中找到，注册号为[GEO:GSE80038]）。此外，LIFR公司据报道，在肝细胞癌中通过负调控PI3K-Akt-基质金属蛋白酶13级联抑制转移[26]. 值得注意的是，在本研究中，KEGG通路分析表明Hippo信号通路(P（P） = 0.00049，折叠富集1.99）和PI3K-Akt信号通路(P（P） = 0.00327，折叠富集1.50）均受到miR-629-3p的显著影响。综上所述，调控LIFR的相互作用miRNAs及其相关通路在未来的研究中具有很大的潜力。

结论

识别预测TNBC致命转移的敏感和特异的生物标记物可以尽早发现复发，从而提高患者的生存率并降低治疗成本。本研究显示miR-629-3p对TNBC肺转移的独立预测作用，并揭示miR-629-13p的抑制通过直接靶向多转移信号通路抑制剂LIFR来减轻实验性乳腺癌的肺转移。因此，未来的研究需要阐明miR-629-3p在介导这些预测途径中的具体作用，并确定miR-629-13p在TNBC中的刺激机制，这对靶向治疗的发展至关重要。