乳腺侧群细胞的功能和分子特征

摘要

背景

乳腺癌被认为发生在乳腺上皮干细胞中。然而，这些干细胞的身份尚不清楚。

方法

对造血系统和肌肉系统的研究表明，干细胞有能力排出染料Hoechst 33342。具有这种表型的细胞称为侧群（SP）。我们利用血液和肌肉系统的技术来寻找乳腺上皮SP。

结果

从人和小鼠乳腺上皮中分离出的乳腺上皮细胞中，0.2-0.45%形成了独特的SP。SP相对未分化，但在培养时生长为典型的分化上皮克隆。将小鼠SP细胞以有限稀释度移植到清除的乳腺脂肪垫中，产生了上皮导管和小叶泡结构。

结论

这些数据表明人类和小鼠乳腺上皮中存在未分化的SP。纯化的SP细胞是一个活的单细胞群体，保持分化能力在体外和体内对造血细胞的研究表明，SP表型构成了一个通用的干细胞标记。因此，这项工作对乳腺干细胞生物学具有指导意义。

引言

在西方国家，每10名女性中就有一人患有乳腺癌。目前的理论认为癌症是一种干细胞疾病[1]因此，确定乳腺上皮干细胞作为治疗干预和乳腺癌预防的潜在靶点非常重要。对小鼠的移植研究表明，干细胞存在于乳腺导管和小叶结构中，并且可能特别富集于末端芽中，末端芽是新兴导管网络快速生长的尖端[2]. 对小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）逆转录病毒整合位点的分析表明，一个完整的乳腺可以从单个细胞的后代发育而来，但该细胞的身份尚不清楚[三]. 顶芽顶端未分化的帽细胞被认为是干细胞，这主要取决于它们的位置[2]. 形态学研究也表明，分布在乳腺导管内的未分化小轻细胞可能是干细胞[4]. 由于缺乏可用于分离活细胞的适当细胞标记物，确认这些分配的功能数据丢失。在乳腺中发现了两种主要的发育基序（导管和小叶）和两种主要的细胞类型（肌上皮和管腔）。然而，干细胞与这些细胞群之间的关系尚不清楚。

流式细胞术对造血细胞和肌肉细胞的分析表明，Hoechst染料排斥反应定义了两种组织干细胞的侧群（SP）[5,6]. 已经假设SP是一种普遍的干细胞表型[6]. 我们现在已经鉴定出人类和小鼠乳腺上皮SP细胞，并表明它们构成一个未分化的亚群，可以分化为导管和小叶结构，以及肌上皮和管腔上皮细胞类型。

材料和方法

人上皮细胞的分离

将乳房缩小成形术所得的乳房组织手动切割成小块（约0.5 cm立方），并在37°C的摇晃培养箱中用0.5–1 mg/ml胶原酶（I型；英国普尔Sigma）在无酚DMEM（英国吉伯科佩斯利）中消化过夜，并补充5%炭化处理血清。酶消化后，倾析脂肪层，并用DMEM培养基多次清洗上皮颗粒。如哈洛斯所述，通过从140和53μm孔径的聚酯单丝网（英国沃林顿Locker Tex）连续过滤和反冲洗，从红细胞、成纤维细胞和内皮细胞中分离出乳腺类器官（导管和小叶泡结构）等. [7]. 通过在0.25%胰蛋白酶-EDTA（Sigma）中移液，然后通过40μm筛孔（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）过滤，以产生主要为单细胞悬浮液，对汇集的类有机物进行分解。

小鼠乳腺上皮细胞的分离

基本上如Smalley所述收获原代小鼠乳腺上皮细胞等. [8]，修改由Naylor描述等. [9]. 简言之，从8周龄至10周龄处女FVB小鼠中取出第四块乳腺脂肪垫，并进行机械和酶消化，以获得上皮“类有机物”。通过差异电镀去除污染的成纤维细胞，并将有机物酶消化成单细胞。然后直接处理原代细胞进行Hoechst染色，无需干预培养。

小鼠骨髓细胞的分离

解剖FVB小鼠的股骨。用解剖剪刀剪断每块骨头的末端，用一个装有PBS的5毫升注射器和一根25 G的针（比利时鲁汶特鲁莫）从骨头两端冲洗骨髓。用L15/10%FCS清洗稀释后的骨髓并制成颗粒。通过将颗粒重新悬浮在1 ml红细胞裂解缓冲液（Sigma）中，快速上下移液，并在37°C下孵育5分钟，对红细胞进行裂解。如果洗涤后仍存在红细胞（颗粒中呈红色），则再次重复裂解程序。

小鼠乳腺上皮细胞的克隆培养

为了分析形态学和克隆效率，将小鼠乳腺上皮细胞以每瓶2000个细胞的速度在25 cm内培养²含有5×10的组织培养瓶⁵辐照（20 Gy）3T3-L1小鼠成纤维细胞（ATCC，马里兰州贝塞斯达，美国）喂食器。培养物保存在DMEM和火腿F12（Gibco）的1:1混合液中，并添加10%FCS、5μg/ml胰岛素、10 ng/ml霍乱毒素（Sigma）和10 ng/ml表皮生长因子（Sigmo）。如前所述，培养物保存在90%氮气/5%二氧化碳/5%氧气的环境中，以实现最佳克隆生长[8]. 培养8天后，将烧瓶固定在PBS中的0.5%戊二醛中，拍摄克隆体照片，然后用苏木精对烧瓶进行染色，以便计算菌落数。为了评估细胞制剂中成纤维细胞的污染程度，将细胞以克隆密度放置在25 cm²装有表达β-半乳糖苷酶的10T1/2（ATCC）喂料器的烧瓶（以区别于任何污染的成纤维细胞），或在4×10⁴每25厘米²不带进料器的烧瓶，在DMEM/10%FCS中，并保持在5%CO中₂/仅限空气。为了评估造血细胞的污染程度，在先前建立的骨髓源性细胞培养条件下培养小鼠乳腺SP细胞[10].

抗体和试剂

除非另有说明，否则所有试剂均来自Sigma。抗体LL002（抗细胞角蛋白14）、LE61（抗细胞角蛋白18）和LP2K（抗细胞蛋白19）是EB Lane赠送的礼物。抗体33A10（抗上皮膜抗原）和GoH3（抗α6整合素）是来自A Sonnenberg的实物礼物。抗波形蛋白V9和抗α同种型平滑肌肌动蛋白1A4购自Sigma。抗CD45抗体I3/2.3和荧光结合二级抗体购自剑桥生物科学公司（英国剑桥）。抗端粒酶催化亚单位抗体购自Calbiochem（英国诺丁汉）。抗雌激素受体抗体购自DAKO（英国伊利）。

Hoechst 33342细胞染色

小鼠骨髓和上皮细胞在10岁时再次悬浮⁶/将L15/10%FCS中的ml预加热至37°C（DMEM/10%FCS用于人类乳腺上皮细胞），并以5μg/ml的最终浓度添加Hoechst 33342（荷兰莱顿的分子探针）。以20μM的最终浓度将维拉帕米（Fluka；Sigma）添加到样品中，对小鼠乳腺SP细胞的毒性大于对骨髓细胞或人类乳腺SP细胞（数据未显示）。细胞在37°C下培养90分钟，偶尔搅拌。培养后，用冷培养基清洗细胞，并在（2–3）×10下重新悬浮⁶/ml，并将碘化丙啶（分子探针）添加至最终浓度2μg/ml。

流式细胞术

在BD FACSVantageSE细胞分选机（Becton Dickinson）上将细胞分选到试管中、聚-L-赖氨酸涂层载玻片（BDH；Merck Ltd，Lutterworth，UK）上或使用CloneCyto系统将细胞分选到培养板中。该机器配备了两个相干90 C-4氩离子激光器（相干，加利福尼亚州圣克拉拉，美国），一个可见光设置为488 nm，另一个多线紫外光学（333.6–333.8 nm）。Hoechst 33342荧光在424/44 nm和670 nm以上（由610 nm短程二向色镜分离）均通过UV激发进行测量。通过在564-606 nm处测量的碘化丙啶荧光来排除死细胞。

免疫荧光分析

细胞以500/孔的密度被镀在玻璃盖玻片上，盖玻片设置在24孔板上，每个孔有2000个辐照供料器，使用与前面描述的相同的生长条件。8天后，将盖玻片固定在冰镇50:50甲醇：丙酮中5分钟，然后进行染色。或者，直接将细胞分选到多-L-赖氨酸涂层的载玻片上，然后如前所述进行空气干燥和固定。如别处所述，细胞被多重间接免疫荧光染色[8]使用针对表中所示抗原的小鼠和大鼠初级单克隆抗体1以及与异硫氰酸荧光素或德克萨斯红结合的种、类和亚类特异性二级抗体（剑桥生物科学）。没有使用第一抗体对照筛查二级抗体的非特异性结合。其他对照显示，对小鼠乳腺SP细胞染色的一些初级抗体呈阴性。其中包括抗Ep-CAM（Ab4克隆ESA 43；IgG₁)，抗CD34（RAM34；IgG_2a个K） ，抗c-Kit（CD117，克隆2b；IgG_2亿K） 和FLK1（IgG_2a个). 使用蔡司Axiovert倒置显微镜（英国韦尔文花园城卡尔蔡司有限公司）观察着色培养物并拍照。从照片中采集的细胞计数被用来确定明亮染色细胞的百分比。

表1旁观者（SP）比例和激素状态

清除脂肪通道移植

如前所述，将21天龄FVB小鼠移植到无上皮的第四乳脂肪垫中[9,11,12]. 如前所述，以不同数量移植新鲜收获的SP和非SP细胞。在收获或允许宿主动物交配之前，给移植动物8周的时间生长。从交配动物身上移植的脂肪垫在怀孕第17-18天收获。收获的腺体被固定，并被胭脂红染色为完整的坐骑。拍照后，将感兴趣的碎片从整体上解剖出来，嵌入石蜡块中，并用标准组织学技术进行H&E切片和免疫细胞化学处理。

ABC转运蛋白的RT-PCR分析

为了对乳腺上皮细胞中的多药耐药蛋白表达进行RT-PCR分析，使用Rneasy自旋柱分离RNA（英国克劳利QIAGEN有限公司）。根据制造商的说明，使用Sensiscript RT（QIAGEN）和寡核苷酸dT引物对约1000个细胞的RNA进行RT反应。平行进行无酶对照反应。对五分之一的RT或对照反应进行PCR扩增。分析4种ABC转运蛋白（乳腺癌耐药蛋白1、多药耐药相关蛋白1、耐药相关蛋白3和耐药相关蛋白4）的表达；这些引物的序列由Brian Sorrentino提供[6].

结果

人和小鼠SP细胞的鉴定

从9个独立的正常人乳腺样本中分离出的上皮细胞用Hoechst染色并用FACS分析。每种制剂都含有一小部分细胞（0.18±0.23%），这些细胞表现出SP（图。1a个). 20μM维拉帕米阻断了SP群体的形成，这与之前的研究一致，这些研究表明SP表型中ABC转运蛋白家族功能的需求（图。1亿) [5]. 在所有样本中都发现了SP，无论年龄、产次、避孕状况或月经周期（表1).

图1

用5μM Hoechst 33342染色的人类乳腺上皮细胞的流式细胞仪分析。（a）显示侧面人群存在的痕迹（方框）。（b）添加20μM维拉帕米（+v），使副作用人数减少12倍。X（X）轴，Hoechst红色荧光强度（FL5）；Y（Y）轴，赫斯特蓝荧光强度（FL4）。

接下来我们检查了SP是否存在于小鼠乳腺上皮细胞中。17个独立实验的结果表明，0.45±0.22%的小鼠乳腺上皮细胞具有SP表型（图。2a个). 显示乳腺SP表型的细胞比例与同样染色的小鼠骨髓样本中观察到的细胞比例相似（0.14±0.11%）（图。2亿)与之前的研究一致[5]. 图中显示了来自小鼠乳腺上皮和小鼠骨髓的Hoechst染色细胞的代表性流式细胞术痕迹2a、2b小鼠乳腺上皮中SP细胞的可用性增加促使我们转向小鼠模型进行后续研究。

图2

小鼠侧群（SP）细胞分析。Hoechst 33342染色小鼠细胞的流式细胞术分析：（a）小鼠乳腺上皮细胞中的SP（盒），（b）小鼠骨髓细胞中的SP。X（X）轴，Hoechst红色荧光强度（FL5）；Y（Y）轴，赫斯特蓝荧光强度（FL4）。（c）小鼠乳腺上皮细胞SP和非SP细胞ABC转运体盒蛋白的RT-PCR分析。M、 分子量标记；乳腺癌耐药蛋白；多药耐药相关蛋白。谱带大小：Brcp1，327 bp；Mrp1，701 bp；Mrp3301个碱基；Mrp4，222个基点。

SP乳腺上皮细胞标记物

SP表型被认为是通过ABC转运蛋白盒蛋白，特别是ABCG2/乳腺癌耐药蛋白1的作用而产生的[6]. 小鼠乳腺SP细胞的RT-PCR分析证实了乳腺癌耐药蛋白1以及ABC转运蛋白家族的其他三个成员（多药耐药相关蛋白1、多药耐药关联蛋白3和多药耐药相关性蛋白4）在较低水平上的表达（图。2厘米).

对于免疫表型小鼠乳腺上皮SP和非SP细胞，直接将其分类到多聚赖氨酸涂层玻片上，并用间接免疫荧光染色（表2). 结果表明，SP细胞是一个相对未分化的群体，与非SP细胞相比，其表达的细胞角蛋白水平较低，波形蛋白水平较高。波形蛋白的表达并不仅仅局限于成纤维细胞，以前在乳腺上皮细胞中也有描述[13]. SP组分中CD45表达细胞的水平较低，而CD34和Flk1未表达，这表明乳腺SP细胞未受到造血干细胞的显著污染。SP和非SP细胞中表达雌激素受体的细胞比例相似。有趣的是，SP组分富集用于表达端粒酶催化亚单位的细胞[14]. 这些研究的结果虽然还没有统计显著性，但对雌激素受体阳性和雌激素受体阴性肿瘤的起源具有重要的机制意义，需要进一步研究。

表2抗体染色图谱

体外和体内SP细胞的分化

描述在体外乳腺SP的分化潜能，细胞在促进乳腺上皮细胞、造血集落或成纤维细胞生长的条件下进行培养。血液培养条件支持骨髓源性SP细胞的生长，但不支持乳腺源性SP的生长（数据未显示）。同样，成纤维细胞培养条件支持原代小鼠成纤维细胞的生长，但在克隆密度或体积培养条件下，在SP细胞或非SP细胞被镀的培养物中，成纤维母细胞型细胞没有生长（数据未显示）。因此，污染的造血细胞或成纤维细胞似乎不太可能构成小鼠乳腺上皮细胞制剂中SP组分的大部分。相反，SP细胞和非SP细胞在先前为小鼠乳腺克隆培养优化的条件下培养，导致小鼠上皮克隆的生长[8]平均克隆效率分别为4.7±0.55和2.1±1.6%（每个烧瓶培养2000个细胞；n个= 5).

克隆类型的形态和比率与克隆未分类的原代乳腺上皮细胞时发现的A–D型分类一致[8,15]. SP和非SP制剂生长后，观察到相同的克隆类型和A–D型比率。

克隆的双重免疫荧光染色，分别使用抗体LE61和LP2K（抗细胞角蛋白18和抗细胞角素19）；体内乳腺管腔上皮细胞标记物）和LLOO2（抗细胞角蛋白14；乳腺肌上皮细胞标记）[8,15]证明SP衍生克隆和非SP衍生克隆具有相同的染色模式。所有细胞角蛋白18均呈一致强阳性，克隆内的大多数细胞也双重染色为细胞角蛋白14。细胞角蛋白19染色更具异质性。克隆“单层”之下的偶发细胞仅为细胞角蛋白14阳性（数据未显示）。乳腺上皮来源的克隆中细胞角蛋白表达的这种混杂模式与我们之前的数据完全一致，并表明SP细胞在以下情况下分化为经典的乳腺上皮细胞克隆在体外文化。

检查他们的体内分化潜能，将刚分离且未经历任何干预培养期的SP细胞移植到<5×10^三去除内源性上皮的同基因动物乳腺脂肪垫中每个脂肪垫的细胞（“清除”）[11]. 移植后5-8周进行发育，然后动物交配。移植的腺体在妊娠第17-18天收获。

在37个SP移植脂肪垫中，有5个出现了突起。根据Kordon和Smith对乳腺移植外生长类型的分类，这些外生长包括四个小叶肺泡结构和一个导管-小叶外生长（导管和小叶）[三]. 25个非SP移植的脂肪垫中有6个含有副产物，尽管SP和非SP移植率之间的比较可能没有根据（见讨论）。通过SP外生长小叶肺泡结构的切片的H&E染色（图。3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h)结果表明，它们由许多紧密堆积的肺泡组成，中央的肺泡被一层层的肺泡上皮细胞和肌上皮细胞包围。肌上皮和管腔上皮细胞标记物（α-平滑肌肌动蛋白和细胞角蛋白19）的染色分别证实了肌上皮和管腔上皮细胞的身份[8,15].

图3

两个代表性侧群（SP）生长的组织学和免疫细胞化学。（a）,（b）移植小鼠乳腺侧群体细胞的胭脂红染色产物的整体形态。用虚线轮廓表示肺泡结构。巴=750μm。（c）,（d）SP生长的H&E染色切片。（e）,（f）肌上皮细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白SP生长切片的免疫细胞化学染色。（g）,（h）管腔上皮细胞标记细胞角蛋白19的SP生长切片的免疫组织化学染色。（c） –（h）巴=350μm。

讨论

我们已经证明在人类和小鼠乳腺中存在SP细胞。SP细胞未分化，移植后产生导管和小叶结构，包括肌上皮和管腔上皮细胞类型体内在所有研究的人类乳腺样本中都检测到了乳腺SP细胞，尽管年龄、胎次、避孕状况或月经周期天数之间没有相关性。有可能SP频率的细微变化被FACS分析用主要乳腺材料制备过程中固有的实验变量掩盖了。维拉帕米对SP表型的抑制以及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的表达表明，BCRP依赖性转运蛋白功能可能是乳腺SP细胞输出Hoechst染料能力的主要因素[6]. 最近的研究表明，正常人乳腺中BCRP的表达是异质的[16]. 然而，BCRP的表达是否可以作为SP/干细胞的分子标记尚需进一步研究。随着合适试剂的开发，SP/干细胞表型与乳腺癌风险之间的关系可以被探索。

新分离的SP细胞表达管腔（上皮膜抗原和细胞角蛋白19）和肌上皮细胞类型（细胞角蛋白14）的低水平分化标记物。在SP细胞中检测到雌激素受体的表达，表明这些细胞有能力对雌激素的增殖效应作出反应。值得注意的是，SP细胞中端粒酶催化亚单位的表达高于非SP细胞。端粒酶催化亚单位mRNA在乳腺末端导管和小叶的有丝分裂不活跃区域表达，并与其他组织中的干细胞隔室相关[17]. 端粒酶活性的增加是乳腺肿瘤发生中最早的事件之一，并已被证明可以驱动细胞永生化[17,18].

在综述本文的同时，Welm及其同事发表了一份报告，表明Sca-1阳性细胞富含干细胞前体，小鼠乳腺SP细胞表达高水平的Sca-1[19]. 我们的数据证实了他们的观察结果，即小鼠乳腺中存在SP细胞，随后我们发现Sca-1在SP和非SP细胞制剂中的表达存在差异（15.8%SP:1.8%非SP在FVB小鼠的细胞中）。这些百分比与Welm所观察到的B6/129小鼠的百分比相当等. [19]. 与韦尔姆不同等然而，我们直接回收了足够多的活SP细胞，以便分析原代SP细胞移植的潜力和在体外增长潜力。

以下在体外培养时，小鼠SP细胞表达典型的乳腺上皮标记物，包括细胞角蛋白14、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19，表明培养条件促进分化。以前的研究表明，在这些条件下生长的未分类上皮细胞在移植后保留了重新填充乳腺的能力[20]. 然而，克隆类型的特性体内干细胞潜能尚不清楚。当未分类的原代上皮细胞在Hoechst染色前大量培养8天时，未观察到典型的SP FACS图谱（数据未显示）。SP表型的丧失可能是由于培养后SP细胞比例的降低。或者，细胞排除Hoechst染料的能力可以增加在体外培养基中SP组分无法区分。在之前描述的四种上皮克隆类型（A–D型）中，有三种存在相当大的细胞异质性[8,15]并且很可能只有菌落中的一些细胞能够保持乳腺的重新繁殖能力。

在有限稀释条件下移植SP细胞可在低频率下生成小叶泡和导管-小叶结构，这是一个令人鼓舞的发现，因为只使用了2000个细胞。非SP细胞也产生了生长。在当前的研究中，不应直接比较SP移植与非SP移植的相对比率，因为在每个原代细胞制备中生成的SP细胞数量非常少，并且由于Hoechst染色的毒性作用阻碍了原代细胞批次之间的比较（数据未显示）。来源于SP细胞的导管-小叶和小叶-肺泡结构的形态与先前描述的乳腺上皮克隆类型相似体内[三]. 小叶结构的组织学与妊娠晚期一致，从中分离出小叶结构，肌上皮细胞和管腔细胞均在适当的细胞层中表达。这些数据共同表明，乳腺SP细胞保留了充分的分化和发育潜力。

如果SP细胞是纯乳腺干细胞，那么可以预期它们将高度富集，以便在移植后能够重新填充脂肪垫，正如富含Sca-1的细胞所显示的那样[19]. 然而，与Sca-1富集研究的直接比较可能无效。乳腺移植研究的一个假设是，极限稀释时的乳腺生长是克隆性的（每清除脂肪垫14000–20000个细胞）[21]最近的数据表明，这种假设可能是错误的。当含有10%lacZ阳性标记细胞的上皮细胞群体在有限稀释下移植时，发现所有移植生长物都含有lacZ阳性和lacZ阴性细胞的混合物[22]. 由于这些实验中的移植“摄取”率是正常的，这表明成功的移植可能需要多个细胞[22]. 在此背景下，对富含Sca-1的细胞的研究[19]可能无法与SP细胞相比较，因为SP细胞占上皮细胞的0.2–0.45%，而Sca-1细胞的常见率为100倍，占乳腺上皮细胞总数的20%。因此，99.7%的非SP细胞可能含有额外的（Sca-1阳性）细胞，可提高移植率[21]或直接促进多克隆生长。一项关键研究表明，在连续移植后，多克隆MMTV感染的腺体在MMTV整合部位变成单克隆[三]为单一全能性乳腺干细胞的存在提供了证据，但没有表明单一细胞在有限稀释下能够产生完全的外生长。

从长远来看，需要开发识别表面标记物的方法和分离健康SP样细胞的策略，以便能够明确识别假定的干细胞。此外，更好地了解外生长物的克隆组成，可以将乳腺移植用作干细胞富集的定量分析。

结论

我们已经鉴定出人类和小鼠SP细胞。我们发现乳腺SP细胞是总上皮细胞制剂中未分化的亚组分。SP细胞保留分化为典型乳腺克隆的潜能在体外变成正常的小叶和导管结构体内由于造血性SP细胞富含干细胞前体，目前的数据与乳腺干细胞的鉴定直接相关。