动物模型
所有动物实验和相关细节均按照批准的指南进行,并得到了中国医学科学院北京协和医院动物护理和使用委员会和北京协和医学院的批准。
Balb/c-nu小鼠(雌性,6周龄,体重约20克)购自北京维塔尔河实验动物技术有限公司(中国北京)。用消毒食品和水喂养小鼠。小鼠乳腺癌细胞系4 T1从中国科学院细胞库(中国北京)获得,保存在补充有10%胎牛血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100单元/ml)的Dulbecco最小必需培养基(DMEM)中,并在37°C和5%CO中培养2空气环境。Balb/c-nu小鼠的乳腺肿瘤是通过皮下接种3.5×106400μl PBS中的4个T1细胞。
治疗
肿瘤达到约150毫米后开始治疗三体积。然后,将这4只T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠随机分为三组:对照组、紫杉醇单药治疗组和抗血管生成贝伐单抗(瑞士罗氏阿瓦斯丁)和紫杉醇联合治疗组。每三天对所有小鼠进行一次腹腔注射。对照组使用容量为100μl的无菌生理盐水,紫杉醇单药组使用剂量为10 mg/kg。在联合治疗组中,小鼠分别接受相同剂量的10 mg/kg[11]. 整个治疗过程持续15天。这项研究包括18只携带同种乳腺癌移植物的小鼠。在治疗前和治疗开始后15天对所有小鼠进行扫描。最后一次扫描后,所有小鼠均被颈椎脱位处死。对这三组肿瘤组织进行血管化组织病理学分析。
MRI协议
所有MRI检查均在GE Discovery MR750 3.0T水平孔超导磁体上进行,该磁体与直径为35mm的小动物线圈(GE,Waukesha,USA)耦合。通过腹腔注射体积为150μl的1%戊巴比妥钠对动物进行麻醉。实验期间监测心跳和呼吸频率。图像采集包括常规T2WI、多b值DWI和DCE-MRI。使用自旋回波序列(0、20、50、100、200、400、600、800、1000、1200、1500 s/mm)采集11级b值的多b值DWI2,TR=2500 ms,TE=78 ms,FOV=50 mm,矩阵64×64,层厚1 mm,11层)。DCE-MRI之后是一系列200相动态T1WI 2D FSPGR图像,具有相同的几何结构,时间分辨率为3s。为了获得全方位的图像,所有肿瘤都用五个冠状切片成像。其他DCE-MRI参数如下:TR=9.7 ms,TE=3.7 ms,FOV=50 mm,矩阵192×96,翻转角度30°,层厚2 mm。在第10个基线数据点后,通过导管插入术后的尾静脉管静脉注射0.1 mmol/kg Gd-DTPA。
MRI检查后测量相关参数。模数转换器缓慢的(纯分子扩散),ADC快速的(灌注相关扩散)和f(灌注分数)由多b值DWI的双指数IVIM模型获得。CER的药代动力学参数(对比度增强比),K反式(传输速率常数),K电动自行车(反向速率常数),Ve(电子)(血管外细胞外体积分数)、fPV(血浆体积分数)和AUC90(曲线90s下面积)由DCE-MRI的两室模型获得。
纹理分析
纹理参数是使用先进的研究软件算法TexRAD获得的,这是英国苏塞克斯大学发明的一种图像序列技术。从所有动物的轴位T2加权图像中,感兴趣区域(ROI)被定义为由经验丰富的放射科医生(8年影像分析经验)手动描绘的最大横截面图像中的肿瘤轮廓[12]. 使用0到6mm的不同空间尺度滤波器(SSF)值选择ROI区域,以提取MR纹理特征。0和2的SSF反映了精细的纹理尺度;3、4和5的SSF反映中等纹理尺度;SSF为6反映了粗纹理比例。这些组织的异质性由以下直方图参数表示:平均强度(ROI中所有像素的平均值)、SD(像素与ROI中平均值之间的离散度。高SD表示数据点分布在很大的值范围内。),熵(ROI中像素强度分布的不规则性)、正像素平均值(MPP,所有大于零的像素的平均值)、峰度(直方图峰值和尾部的度量。正峰度表示比高斯(正态)分布更尖峰的直方图。),和偏斜度(直方图不对称性的度量。正偏斜度意味着右侧的尾巴比左侧长,反之亦然。)[9,13]. 这些定量参数与肿瘤组织学特征有关,如血液和氧气供应、坏死和纤维化[14].
组织病理学
最后一次MRI检查后,所有动物都被安乐死。然后,分离肿瘤并用10%福尔马林固定组织。石蜡切片(2mm厚)取自4个T1乳腺肿瘤。此外,还进行了苏木精和伊红染色以及CD31、CD34和VEGF的免疫组织化学染色,以评估新生血管。使用兔抗CD31抗体(ab28364;Abcam,英国剑桥)、兔抗CD34抗体(ab81289;Abcam)和兔抗VEGF抗体(ab52917;Abcan)进行免疫组织化学染色。所有抗体用含有1%牛血清白蛋白(BSA)的三缓冲盐水(TBS)稀释。基于这些测试,计算这些同种移植物的微血管密度(MVD)。
统计分析
上述定量参数从功能MRI中获得,并在SPSS 20.0中进行分析。通过方差分析,将紫杉醇单药治疗和联合治疗的数据与对照组进行比较。通过线性回归分析MRI参数与病理特征数据之间的相关性。
对照组、紫杉醇单药治疗组和联合治疗组治疗前后质地特征值的差异使用Mann-Whitney U检验进行测试[15].
所有测试都是双尾的。P(P)小于0.05的值被认为具有统计学意义。