人类非黑色素瘤皮肤癌中粒头型基因的协同表达和遗传多态性

摘要

背景

类谷粒（GRHL）转录因子与许多不同类型的癌症有关。然而，以前的研究没有试图研究不同基因表达的潜在相关性GRHL公司这方面的基因。此外，关于破坏性突变和/或单核苷酸多态性的信息很少GRHL公司可能与癌症有关的基因。

方法

从人类非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）和邻近正常组织中提取DNA和RNA(n个 = 33对样品）。的表达式GRHL公司通过实时定量PCR检测基因。的规定GRHL公司使用细胞转染方法和双核糖核酸酶报告系统研究miRNA的表达。靶向性深测序GRHL公司利用肿瘤样本和对照组织中的基因来搜索突变和单核苷酸多态性。在额外的NMSC复制队列中，使用焦磷酸测序对单标记rs141193530进行基因分型(n个 = 176). 使用适当的统计和生物信息学方法分析和解释结果。

结果

我们发现两个基因的表达GRHL1型和GRHL3级与从相同个体获得的对照健康皮肤样品相比，肿瘤样品中的–以协调的方式减少。两者都有可能GRHL1型和GRHL3级至少在某种程度上受同一致癌microRNA–miR-21的不同链调控，这至少可以部分解释所观察到的相关性。无新发突变GRHL公司在检测的肿瘤样本中检测到基因。然而，一些单核苷酸多态性在GRHL公司在接受检查的NMSC患者组中，基因频率发生了显著变化。

结论

非黑色素瘤皮肤癌生长伴随着表皮分化基因的协同表达减少：GRHL1型和GRHL3型，可能分别由miR-21–3p和-5p调节。一些潜在的破坏性单核苷酸多态性GRHL公司在NMSC患者中，基因频率发生改变，尤其可能损害GRHL3级编码蛋白的基因或功能。这些多态性的存在可能表明受影响人群中NMSC发展的风险增加。

背景

冗余被认为是开发抗癌新方法的最大挑战之一[1]. 冗余的一个例子与酶的功能有关，不同基因编码的酶可以催化相同的化学反应。这种现象的另一个例子是不同的转录因子可以调节共同靶基因的表达。

在哺乳动物中，各种上皮细胞的适当结构和再生依赖于转录因子类粒头型（GRHL）家族的三个成员，目前称为GRHL1、GRHL2和GRHL3。已经表明，不同的格里尔基因。研究得最好的例子涉及Grhl2号机组和Grhl3号机组小鼠模型中的神经管闭合[2]. 在这种情况下，这两个基因表现出部分冗余的作用，而不是完全功能等效的，这可以用部分重叠的靶基因特异性来解释，因为GRHL2和GRHL3共享它们的一些靶基因，而其他靶基因对每个因子都是独特的[三].

在维持成人皮肤屏障中，基因冗余涉及Grhl1号机组和Grhl3号机组基因，这是最近用小鼠模型证明的。表皮Grhl1号机组-无效小鼠对外源性染料是不可渗透的，这些小鼠是可以存活的[4]. 同样，Grhl3号机组条件敲除小鼠，其中Grhl3型出生后，表皮中的基因被选择性地灭活，没有明显的皮肤屏障缺陷，并能很好地存活到成年[5]. 然而，当两者都Grhl1号机组和Grhl3号机组成年小鼠表皮中的基因同时失活，导致屏障通透性完全丧失，这是致命的[6]. 这种表型可以通过不同GRHL转录因子对不同交联酶表达的调节来解释。

转谷氨酰胺酶（TGM）是一种酶，可催化形成广泛交联的不溶性蛋白质聚合物，以形成表皮角质化的包膜[7]. 在小鼠表皮中，GRHL3调节Tgm1型而GRHL1调节Tgm5型在较小程度上，Tgm1型因此，在Grhl1号机组-无效小鼠和Grhl3号机组条件敲除小鼠总谷氨酰胺转胺酶活性保持足够高，以确保皮肤屏障的通透性。然而，两者的伴随损失Grhl1号机组和Grhl3号机组在表皮中，TGM1和TGM5的水平显著降低，总谷氨酰胺转胺酶活性显著降低，皮肤屏障的通透性丧失，这与生命不相容[6].

所有GRHL都与各种类型的癌症有关（这些发现已在最近的综述中进行了总结[8]). 其中GRHL1和GRHL3与皮肤癌的发生有关。当接受标准的化学皮肤致癌方案时Grhl1号机组-与对照野生型同窝小鼠相比，空鼠患鳞状细胞癌（SCC）的次数更多，发病更早[9]. 在条件反射中观察到类似的表型Grhl3号机组表皮特异性消融敲除小鼠Grhl3号机组出生后[5]. 然而，潜在的分子机制是不同的：Grhl3号机组条件敲除表皮，肿瘤抑制性磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）水平降低，PTEN是GRHL3调节的直接靶点，触发PI3K/AKT/mTOR信号通路的失调[5]; 在中Grhl1号机组^−/−小鼠的潜在分子机制包括异常的角质形成细胞终末分化和亚急性皮肤屏障缺陷，这些缺陷通过在皮肤中诱导促肿瘤的轻度慢性炎症微环境，增加皮肤癌的风险[9,10].

根据最新发现：（i）屏障基因在皮肤癌形成中的作用已被充分证实[11];（ii）这个格里尔基因对于维持表皮屏障很重要，在这种情况下，它们显示出一定程度的冗余[6];（iii）二者都Grhl1号机组和Grhl3号机组在小鼠模型中对皮肤鳞状细胞癌的发展起保护作用[5,9]; 我们假设同时下调GRHL公司基因具有明显的遗传冗余和遗传相互作用，与皮肤癌的形成有关。的简化表达式GRHL3级在人类基底细胞癌（BCC）和皮肤鳞状细胞癌（SCC）中已经观察到，但其他GRHL公司这些研究中没有研究基因[5,12]. 为了验证这个假设，我们分析了所有GRHL1–3号机组人类非黑色素瘤皮肤癌样本的两个亚型中的基因——基底细胞癌和基底细胞癌。我们还寻找了可能影响GRHLs公司表达式。此外，我们在所有GRHL1–3号机组来自同一患者的NMSC样本和对照健康组织中的基因。此外，我们在GRHL公司可能使人类受试者易患NMSC的基因。

方法

患者队列和样本收集

33名波兰NMSC患者被纳入本研究（22名BCC患者和11名SCC患者）。这些患者在波兰华沙玛丽亚·斯克洛多夫斯卡-居里纪念癌症中心和肿瘤研究所的软组织/骨肉瘤和黑色素瘤科接受了手术治疗。该研究得到了当地生物伦理委员会的批准（许可证编号13/2008）。在对整个有边缘的病变区域进行手术切除后，从病灶核心和切除边界的对照正常皮肤上切除小组织样本，并在−80°C下保存，直至使用。附加文件中提供了有关受检患者组和癌组织病理学分类的一般信息1：表S1。

的表达式GRHL公司癌症样本中的基因

RNA提取

根据制造商的说明，使用RNeasy®纤维性组织迷你试剂盒（Qiagen，目录号74704）从所有收集的新鲜组织（切除边缘的癌组织和正常组织）中提取总RNA。使用NanoDrop 2000 UV–vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定RNA纯度。使用2100生物分析仪和RNA 6000纳米试剂盒（安捷伦科技公司）对RNA质量进行评估。优质样品(n个 = 进一步分析包括27对，来自同一患者的癌症和正常组织），RNA完整性数（RIN）高于5。RNA浓度使用Qubit®2.0荧光计和RNA BR测定法（Thermo Fisher Scientific，目录号Q10210）测定。

逆转录和实时聚合酶链式反应

用250 ng总RNA和SuperScript®VILO™Master Mix（Invitrogen，目录号11755050）合成cDNA。The levels of expression ofGRHL公司使用应用生物系统化学分析基因：TaqMan®Fast Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG（分类号4352042）和TaqMan-基因表达分析（分析ID:Hs01119372_m1GRHL1型，Hs00227745_m1用于GRHL2型，Hs00297962_m1用于GRHL3级，Hs03929098_m1用于HPRT1型控制）。在7900HT快速实时PCR系统（应用生物系统）中进行实时定量PCR。基因表达标准化为HPRT1型管家基因和统计学差异被确定为相对表达（2^-∆∆Ct)采用双尾Mann–Whitney U检验，显著性水平<0.05。

miR-21–3p与3′非翻译区（UTR）的相互作用GRHL1型

细胞培养

HaCaT细胞系购自cell Lines Service（目录号300493）。HEK293T细胞是来自Ewelina Szymanska的一份礼物；最近的一篇综述文章解释了这种细胞系的起源[13]. HaCaT和HEK293T细胞在补充有10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号10270–106）和100 IU/mL青霉素-链霉素（Thermo-Fisher科学，目录号15140122）的DMEM-GlutaMAX培养基（ThermoFisher科技，目录号10566–016）中常规培养在95%空气和5%CO的增湿培养箱中₂37°C时。

miR-21–3p模拟物或发夹抑制剂处理的HaCaT细胞

60 nM miR-21–3p模拟物或阴性对照品（Ambion、mirVana分类号MC12979和分类号4464058）或180 nM miR-21–3p发夹抑制剂或阴性对照物（Dharmacon、miRIDIAN分类号IH-301023-02和IN-001005-01）使用Lipofectamine 2000或Lipofeectamine 3000转染试剂（Invitrogen，cat.no.11668019或L3000-008）转染HaCaT细胞。24 h后，用RNeasy Mini Kit（Qiagen，cat.no.74104）收集细胞或在裂解缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100和罗氏1×Complete™蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中进行Western blot分析。cDNA是使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，目录号4368814）合成的。使用TaqMan探针（检测ID:Hs01119372_m1）进行实时PCRGRHL1型，Hs00227745_m1用于GRHL2型，Hs00297962_m1用于GRHL3级，Hs00427620_m1用于TBP（待定）以及用于18S的Hs99999901_s1）。组蛋白脱乙酰酶8-HDAC8型（分析ID:Hs00954359_m1），其表达受miR-21–3p调节[14]，被用作控制目标。每次转染重复进行三次。基因表达标准化为TBP（待定）看家基因与相对表达的统计差异（2）^-∆∆Ct)通过双尾Student t检验确定。对于蛋白质印迹分析，在12%SDS-PAGE凝胶上分离20μg总蛋白，随后转移到PVDF膜上。用5%的非脂肪乳封闭膜，并在封闭缓冲液中与一级抗体孵育。以下抗体用于免疫印迹：抗GRHL1（Sigma，分类号HPA005798）、抗兔IgG、HRP-linked（Cell Signaling，分类号7074）和抗β-肌动蛋白（Sigma-分类号A3854）。通过ImageJ软件对蛋白质丰度进行量化，并根据相应的β-肌动蛋白水平对相关条带进行标准化。使用Student t检验进行统计分析。

HEK293T细胞荧光素酶3'UTR报告子分析

将HEK293T细胞置于24孔板中，并按照制造商的协议，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，cat.no.11668019）瞬时转染50 ng GRHL1_3'UTR、GRHL1_ 3'UTR_mut或阴性对照载体（GeneCopoeia，目录号HmiT055586-MT01和目录号CmiT000001-MT01）。同时，将miR-21–3p模拟物或阴性对照与报告载体共同转染，最终浓度为60 nM。人类的3'UTRGRHL1型使用QuikChange位点定向突变试剂盒（安捷伦科技公司，目录号200518）进行突变。转染24小时后，使用报告裂解缓冲液（Promega）收集细胞。萤火虫和雷尼利亚使用双荧光素酶报告分析系统（Promega，目录号E1910），在室温下，在多模式阅读器Infinite M1000Pro（Tecan）中分析荧光素酶活性。相对荧光素酶活性定义为萤火虫的平均值/雷尼利亚从3个独立的生物重复获得的标准化比率。统计差异用双尾学生的t吨-测试。

miR-21–3p和GRHL1型在癌细胞系中

鳞状细胞癌细胞系购自美国类型培养物收集中心：A-431（分类号CRL-1555）、CAL-27（分类号CRL-2095）、SCC-15（分类号CRL-1623）和SCC-25（分类号CR L-1628）。HaCaT细胞系购自cell Lines Service（目录号300493）。SCC-351细胞系是Agnieszka Kobielak赠送的礼物；该细胞系也称为USC-HN1，来源于美国加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学凯克医学院病理学系Alan L.Epstein的实验室，由其实验室成员首次描述[15]. 所有细胞系均按上述方法培养为HaCaT细胞系。如上所述进行RNA提取、cDNA合成和TaqMan分析。

基因突变和多态性GRHL公司基因

DNA提取、靶点富集和下一代测序

根据制造商的说明，使用QIAamp®DNA Mini Kit（Qiagen，目录号51304）从10至15 mg均质组织（Bio-Gen-PRO均质器）中提取DNA。用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定DNA纯度。使用Qubit®2.0荧光计和dsDNA-BR分析（Invitrogen；目录号Q32853）定量准确的DNA浓度。使用SureDesign HaloPlex Standard Wizard根据目标区域选择自定义探针序列GRHL公司基因，根据UCSC数据库中的hg19/GRCh37组装([16]2009年2月版）；可分析区域的列表在附加文件中提供1：表S2。根据D版协议（2012年8月），使用定制设计的HaloPlex靶富集系统1–500 kb（安捷伦科技公司）的试剂集捕获靶区。简言之，该方案包括以下四个步骤：1）用限制性内切酶在八个平行反应中消化基因组DNA（250 ng）；2） 杂交使消化的DNA片段与包含索引和Illumina测序基序的互补探针循环；3） 使用链霉亲和素珠捕获靶向DNA并结扎循环片段；4） 捕获目标库的PCR扩增。在德国海德堡欧洲分子生物学实验室基因组学核心设施的MiSeq仪器（Illumina）上对样品进行配对测序。

NGS数据处理

数据预处理

对序列读取进行重新同步和修剪，以删除Illumina适配器序列，只保留长度超过36 bp的读取。用Trimmomatic进一步筛选序列[17]对于质量较低的领先/落后基地，钻井质量低于20。随后用Stampy将序列与人类参考基因组（hg19版本）对齐[18]. 此外，由于限制性内切酶切割位点中存在单核苷酸多态性（SNP）的潜在等位基因偏见，最初的5个碱基被修剪。使用带有默认参数的SAMtools mpileup算法调用SNP[19]. 覆盖范围截止值为20。

关联SNP

将检测的NMSC人群中的SNP分布与欧洲人群进行比较（数据来源于1000基因组数据库[20])和关联第页-值用χ确定²–测试或费希尔精确测试。这个第页-用多重比较校正（Bonferroni校正）调整显著性阈值。

单核苷酸多态性在TF结合基序中的预测作用

SNP到DNA元素联盟百科全书（ENCODE）区域的映射[21]和转录因子结合基序是用Nencki基因组数据库Ensmbl功能基进行的[22]. 与DNA序列匹配的基序被记为来自JASPAR数据库的基序各自位置权重矩阵的对数[23]. 对于每个SNP，考虑了原始参考序列和由单个SNP修改的序列（未考虑同一模体中多个SNP的相互作用）。log-odds得分之间的差异被解释为结合能折叠变化的对数；对数比值差被解释为无穷大（当x接近0时，对数（x）接近负无穷大）。

复制队列中外显子SNPs rs141193530和rs41268753的基因分型

复制示例

从177例波兰非黑色素瘤皮肤癌患者（144例基底细胞癌和32例鳞状细胞癌）中随机选择福尔马林固定石蜡包埋材料。这些患者在波兰华沙Maria Sklodowska-Curie纪念癌症中心和肿瘤研究所的软组织/骨肉瘤和黑色素瘤科接受手术治疗，该研究得到了生物伦理委员会的批准；许可证编号13/2008。

DNA提取

使用NucleoSpin DNA FFPE XS（Macherey-Nagel）从FFPE样品（5-10片10μm厚切片）中提取DNA，所有步骤均按照制造商的说明执行。使用Qubit™dsDNA HS检测试剂盒（Invitrogen，目录号Q32854）进行DNA定量。为了获得有用的信息，包括高质量的序列数据，根据制造商的说明，使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix（新英格兰生物实验室，目录号M6630 L）处理FFPE DNA样本。

PCR-RFLP

为了鉴定序列中具有潜在SNP的DNA样本，使用PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）进行了初步选择。用正向引物5'-CTTCAGGGGCAATGAGACGAC-3′和反向引物5'-GCATATGGAACAGC-3′对基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应的退火温度为65℃。为了准确复制模板，使用Q5®高纯度DNA聚合酶（NEB，分类号M0492S），并用英国标准协会HI限制性内切酶（NEB，分类号R0556S），只消化模板而不检测SNP（rs141193530和rs41268753的存在将废除限制性位点5'-GRCGYC-3′）。消化的PCR产物在2.5-3%高分辨率琼脂糖（EurX，波兰，目录号E0302-50）凝胶中溶解，用SimplySafe™（EurX，波兰，分类号E4600-01）染色，并用G:Box（Syngene）可视化。将每个样品的消化的PCR产物与相同量的未消化的产物进行比较。阳性结果的样品（未消化或部分消化的产品）通过焦磷酸测序进行额外的基因分型。

焦深测序

为了明确所选DNA样本中的准确单核苷酸多态性，设计了焦磷酸测序法来测量SNP位点rs41268753（C/T）和rs141193530（C/G）核苷酸掺入的相对定量。基因组DNA模板的PCR扩增引物如下：Fw_5'-生物素化-CTTCAGGGCAATGAGACGAC-3′和Rv_5'–GCACATTGGAACAGC-3′，引物退火温度为65℃。使用内部焦磷酸测序引物5’-ATTGGGATGAACAGCAC–3’对生物素化PCR产物（80 bp）进行焦磷酸序列测定。分析的序列内容为GGGTG[G/C]C[G/A]TCTCC。A&A生物技术公司（波兰格丁尼亚）提供焦深测序服务。

统计分析

为了分析单标记关联，从Exome Aggregation Consortium数据库（ExAC）中获取了欧洲非芬兰对照人群编码区的SNP频率[24]. 为了计算优势比、相对风险、置信区间、显著性水平和其他参数，采用了适合医学研究的统计方法[25]. 附加文件中提供了有关所考虑患者组的一般信息1：表S3。

结果

的简化表达式GRHL1型和GRHL3级人类非黑色素瘤皮肤癌的基因

我们分析了GRHL1–3号机组实时PCR检测基因n个 = 27个NMSC样本（17个基底细胞和10个基底细胞），包括肿瘤和切除边界附近的组织学正常组织。两个被检测基因的表达水平-GRHL1型和GRHL3级与同一患者的对照健康组织相比，基底细胞癌（BCC）样本和鳞状细胞癌（SCC）样本中的–显著减少。我们没有发现GRHL2型在基底细胞癌或鳞状细胞癌中均有表达。有趣的是，在BCC和SCC中，我们观察到GRHL1型和GRHL3级基因，具有Spearman相关系数R² = BCC为0.685，SCC为0.825第页 < 两者均为0.001（图1).

图1

的表达式GRHL公司非黑色素瘤皮肤癌样本中的基因。分析了27例NMSC（17例BCC和10例SCC）的cDNA池；基因表达标准化为HPRT1型。左侧：2的方框图表示^-∆∆CtNMSC亚型[39].每个方框表示分布的第25个和第75个百分位。方框内的水平线表示中值，晶须表示极端测量值。P（P）-这些值来自Mann-Whitney U检验。右侧：相关图GRHL1型和GRHL3级表达式。BCC–基底细胞癌，SCC–鳞状细胞癌，N–切除边缘的正常皮肤，R²–斯皮尔曼相关系数

miR-21–3p可能直接靶向GRHL1型通过与3'UTR的相互作用

表达水平的协调下降GRHL1型和GRHL3级在NMSC样品中，可以指示一种常见的调节机制。我们决定寻找可能靶向这两种基因的miRNAsGRHL1型和GRHL3级使用靶microRNA和TargetScanHuman预测算法[26,27]. 多序列比对检测到的3'UTR中miR-21–3p的SVR评分良好的种子序列GRHL1型（图2a个)这表明GRHL1型是miR-21–3p调节的潜在靶点。先前已经证明miR-21-5p调节GRHL3级[5]因此，在本研究中，我们重点关注GRHL1型miR-21–3p。当pMT01-GRHL1_3'UTR与miR-21–3p模拟物共同转染到HEK293T细胞中时，与阴性对照以及突变报告子或空载体的转染相比，萤火虫报告子的相对荧光素酶活性显著降低（图。第2页). 此外，我们观察到GRHL1型用miR-21–3p模拟物处理的人角质形成细胞中的mRNA（图。2厘米). 然而，GRHL1蛋白量的减少在统计学上并不显著（附加文件1：图S1A）。我们用miR-21–3p抑制剂转染了HaCaT细胞，但我们没有检测到细胞内GRHL1型转录物或蛋白质水平，尽管我们测试了各种抑制剂浓度，最高可达180 nM（附加文件1：图S1B-C）。

图2

miR-21–3p可能直接靶向GRHL1型通过与3'UTR交互。一miR-21–3p在3'UTR中的预测靶位示意图GRHL1型.b条萤火虫/雷尼拉用指示质粒和miR-21–3p或阴性对照miR转染HEK293T细胞24小时后，分析其荧光素酶活性，n个 = 3个生物复制品*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，数据显示为平均值±标准差。C）GRHL公司基因和HDAC8型用miR-21–3p模拟物处理HaCaT细胞（c=60nM；实验重复进行了三次）。HDAC8型作为阳性对照，因为miR-21–3p反向调节其表达，因此HDAC8型用miR-21–3p模拟物处理细胞后，mRNA预计会减少[14].TBP（待定）被用作参考基因，Studentt吨-检验用于确定统计显著性。数据显示为平均值±SD

miR-21–3p和GRHL1型在SCC细胞系中

我们检测了miR-21–3p和GRHL1型在五个SCC细胞系中（图三). 与对照HaCaT细胞系相比，在所有这些细胞系中，我们观察到miR-21–3p水平增加。几乎在所有情况下，这种增长都伴随着GRHL1型表达式。

图3

miR-21–3p和GRHL1型与HaCaT细胞相关的癌细胞系

中的多态性GRHL公司NMSC患者队列中的基因

我们对33例人类NMSC进行了靶向性深测序，并从切除边界控制正常皮肤。以下区域GRHL公司基因测序：所有编码序列、内含子/外显子边界、5′和3′UTR，以及由ENCODE确定的所有潜在调控区域[21]. 这些包括CpG岛、对DNase I敏感性增加的区域、含有染色质的组蛋白修饰的开放染色质区域或一般转录因子的结合区域。可分析区域的完整列表在附加文件中提供1：表S2。该实验没有检测到这些基因中的任何从头突变，也就是说，肿瘤样本中存在的突变，但同一个人的健康对照组织中没有。随后，我们分析了SNP在接受检查的患者组中的分布。为了记录最密切相关的SNP，我们首先将受检NMSC患者的单核苷酸变异频率与1000基因组数据库中欧洲人群的等位基因频率进行了比较[20]. 以前的研究表明，现存欧洲亚群之间的遗传差异很小[28]因此，将欧洲人群作为SNP频率比较的参考。频率发生显著变化的SNP汇总在表中1在所有病例中，患者队列中不太常见的变异的频率增加。

表1接受检查的NMSC患者NGS的统计显著点击数(n个 = 33)

非编码区的单核苷酸多态性GRHL2型和GRHL3级基因

单核苷酸变化可能通过其生物学后果导致癌症发展风险。上游地区的SNPGRHL3型基因（rs55927162和rs56256719）可能影响转录因子与潜在增强子或其他调节元件的结合。然而，我们的生物信息学分析表明，这些SNP并没有显著改变JASPAR数据库中提供的已知转录因子结合基序[23]. 基因内含子区的单核苷酸多态性GRHL2型和GRHL3级基因（rs151171718和rs548650）可能影响初级转录物的剪接。

基因编码区的单核苷酸多态性GRHL3级基因

在我们的NMSC患者队列中，两个非同义SNPs出现频率显著改变：rs141193530位于第11外显子GRHL3级导致P455A氨基酸残基替换的基因，以及GRHL3型导致R573H替代的基因（表1). 我们使用了PROVEAN（蛋白质变异效应分析仪）v1.1[29]评估这些SNP的存在是否会影响蛋白质功能。该分析预测R573H替代为“中性”（PROVEAN预测）或“可容忍”（SIFT预测）。P455A替代被预测为“中性”（PROVEAN预测）或“破坏性”（SIFT预测）。

除了在编码蛋白中引入氨基酸残基替换外，这些SNP的存在可能会损害GRHL3型基因通过影响初级转录物的处理。我们使用了两种算法来搜索外显子剪接增强子（ESE）。ESE救援[30]未检测到任何可能与SNP rs141193530或rs151326764位置重叠的ESE。ESE查找器3.0[31]预测了富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子（SRSF）与含有SNP rs141193530的区域的结合发生一些变化，即：一个SRSF5潜在结合位点的丢失和一个新的SRSF2潜在结合位点。然而，给定ESEfinder算法的多个警告[31]很难确定这些变化是否会影响前mRNA的处理。

有趣的是，SNP rs141193530在最近的一篇文章中被报道，描述了GRHL3级非综合征性唇腭裂伴/不伴腭裂（nsCL/P）和仅伴非综合征腭裂患者的基因研究[32]. 作者的分析得出结论，这种变异要么是“可容忍的”，要么是“良性的”。我们重新分析了作者在附加文件中提供的频率数据1：表S3[32]使用适当的统计方法[25]. 作为参考，我们采用了ExAC数据库提供的欧洲非芬兰人口的频率数据[24]因为现存欧洲亚种群之间的遗传差异很小，可能只有芬兰人所观察到的种群分离株例外[28]. nsCL/P患者队列中rs141193530的频率为0.016，而对照人群为0.00796。如OR=2.0136所示，这种频率差异具有统计学意义；第页 = 0.0038; 95%置信区间：1.2542–3.2329。同样，我们观察到NMSC患者这种变异的频率增加（表2)，什么可能表明这种单核苷酸变化对GRHL3级功能和疾病风险增加。

表2 NMSC患者的单标记关联(n个 = 209）与不同参考组进行比较

为了进一步研究这种SNP是否可能与NMSC的发生有关，我们在复制队列中对SNP rs141193530进行了基因分型，其中包括176名NMSC患者（附加文件1：表S3）。结果如表所示2.

讨论

我们的研究表明，谷穗样家族中的两个基因的表达——GRHL1型和GRHL3型–在人类NMSC中以协调的方式减少。在早期的工作中，我们发现GRHL3级由miR-21-5p调节[5]. 这里我们提供证据表明GRHL1型可能受miR-21–3p调控，尽管我们的研究结果在这方面并不完全一致。该机制得到以下结果的支持GRHL1型和miR-21–3p在鳞癌细胞系中的表达研究（图。三)并且，在GRHL1型通过miR-21–3p模拟物转染，转录水平以及荧光素酶报告子分析（图。2). 然而，我们没有发现细胞转染miR-21–3p模拟物后GRHL1蛋白水平有统计学意义的降低(第页 = 0.1; 其他文件1：图S1A）。这种差异可能是两种方法之间敏感性差异的结果，特别是在我们的实验中，miR-21–3p模拟物转染诱导的相对较小（约30%）的GRHL1型转录水平以及荧光素酶报告活性（图。2). 由于抗体与其他蛋白质发生交叉反应的风险，蛋白质印迹结果的解释更加复杂，因为三种GRHL1–3蛋白显示出非常高的相似性，它们都在HaCaT细胞中表达，并且它们具有几乎相同的分子量，因此在蛋白质印迹之前不能通过电泳将它们分离。此外，我们没有观察到GRHL1型细胞转染miR-21–3p抑制剂后的转录或蛋白质水平，尽管使用了非常高的抑制剂浓度（附加文件1：图S1B-C）。最可能的解释是，miR-21–3p对GRHL1表达的影响很小，因此用miR-21-3p抑制剂处理细胞不足以诱导GRHL1的表达发生统计上显著的变化。由于miR-21–3p水平在正常HaCaT细胞系中相对较低，这也是可能的（图。三)miR-21–3p抑制的作用要弱得多，因此不如miR-21-3p过度表达的作用明显。虽然一般认为miRNA的“乘客”链在miRNA处理过程中降解，但对于一些miRNA，表明-5p/−3p比率随细胞类型、发育阶段或不同疾病状态而变化，这表明链选择是一个严格控制的过程。有实验证据表明，miR-21–3p在紫外线诱导的表皮增强炎症中高水平存在，可能促进或促进肿瘤生长[33]. 因此，两者的表达式GRHL1型和GRHL3型由相同的致癌miRNA（miR-21）调节，尽管其链不同。

miR-21的致癌功能已被充分证明。miR-21型-缺陷小鼠表现出对化学诱导的皮肤癌易感性降低[34]. miR-21-5p的表达[35]和miR-21–3p[33]是由紫外线照射引起的，这是NMSC的一个已知风险因素。有趣的是，miR-21的表达被GRHL3抑制，表明存在调节环[36]. 该研究的作者提出了以下机制：在恶性转化时GRHL3级减少，导致miR-21表达增加，并进一步增强肿瘤发生。人们很容易猜测，由于GRHL3型减少，miR-21水平增加，随后可能导致GRHL1型mRNA。然而，根据不同的出版物，这种机制不太可能，因为GRHL3级击倒没有引起任何变化GRHL1型HaCaT细胞中的表达[6]. 因此，更可能的原因是GRHL1型和GRHL3级NMSC的表达是在环境中进行的，是对紫外线照射的反应，紫外线照射会引起表皮中miR-21-5p和miR-21-3p水平的增加，进而导致GRHL1型和GRHL3型mRNA。有趣的是，在UVB诱导的角质形成细胞中，桥粒蛋白1的转录和蛋白水平都降低[37]，这是GRHL1法规的直接目标[4].

我们的结果进一步阐明了冗余在研究致癌过程中的重要性[1]. 的功能Grhl1号机组和Grhl3号机组成年小鼠表皮屏障维持基因冗余；这两种基因必须同时失活，才能破坏不透水的皮肤屏障[6]. 此外，众所周知，屏障基因在NMSC形成中起着重要的保护作用[11]. 因此，在人类NMSC的背景下GRHL1型和GRHL3级必须同时减少，以延迟表皮细胞分化和/或在皮肤中诱导促肿瘤炎症微环境，从而使皮肤肿瘤进展。我们的观察结果支持了这个假设。

我们没有在任何GRHL公司NMSC样本中的基因，即肿瘤中存在但同一患者健康组织中缺失的突变。该结果与之前的分析一致GRHL3级人类皮肤鳞状细胞癌基因，未发现新发突变[5]. 现在推测这一点还为时过早GRHL公司基因不会在癌症中发生突变，特别是因为它们与许多不同类型的癌症相关[8]，但迄今为止还没有报道过此类突变。

与欧洲人群相比，我们在NMSC患者队列中标记了一些频率发生显著变化的多态性（表1). 其中一些变异很少见（等位基因频率<0.01）。罕见或常见变异是否更有可能导致疾病风险，仍存在争议[38]因此，我们决定在进一步的分析中包括这两种类型的等位基因。

非同义SNP rs141193530位于GRHL3级基因，并在编码的GRHL3蛋白中引入P455A氨基酸残基取代。似乎这种单核苷酸多态性的存在确实可能对细胞的功能有害GRHL3级基因，因为这种多态性与两种截然不同的疾病相关：nsCL/P和NMSC([32]和当前研究）。然而，在这两种疾病中GRHL3级基因起着保护作用。这种SNP可能有害的原因与P455A取代可能会损害GRHL3蛋白的功能有关，尽管我们和其他研究人员使用的算法做出了一些相反的预测([32]和当前研究）。或者，SNP rs141193530的存在可能会影响初级转录物的处理，尽管我们的生物信息学分析没有提供任何证据支持这种可能性。因此，负责SNP rs141193530对细胞功能影响的精确分子机制GRHL3级基因和/或编码的GRHL3蛋白仍有待阐明。

与GRHL3蛋白功能受损或GRHL3级前mRNA，降低GRHL公司健康人表皮中的基因表达（在NMSC发生之前）也可能增加受影响人群中NMSC的风险。这种现象不同于GRHL1型和GRHL3型与邻近健康表皮相比，肿瘤样本中的基因减少Grhl3号机组在SCC样本中观察到mRNA水平Grhl3号机组^+/+（野生型）小鼠，在Grhl3号机组基因[5]. 相反，它与GRHL公司NMSC发病前组织学正常表皮中的基因。以前的研究表明，表皮表达水平显著降低的小鼠模型Grhl1型或Grhl3号机组皮肤SCC敏感性增加[5,9]. 在人类受试者中，这种表达水平的降低可能是由于转录因子与GRHL3级基因，这反过来可能是由结合基序中的SNP引起的。此外，内含子区SNPs的存在可能会影响剪接效率，这也可能导致mRNA水平的降低（表1). 这些可能性需要进一步研究。

结论

目前的结果表明，人类非黑色素瘤皮肤癌的生长伴随着GRHL1型和GRHL3级mRNA。这种减少以协调的方式发生，这表明存在一种共同的监管机制。这两种基因的表达可能至少部分由相同的致癌microRNA:miR-21调节，miR-21的表达是由紫外线诱导的，紫外线是皮肤癌形成的主要原因。我们在GRHL公司人类NMSC样本中的基因与邻近正常皮肤的比较。然而，我们观察到，与普通欧洲人群相比，在接受检查的NMSC患者队列中，一些单核苷酸多态性的发生频率发生了显著变化。这些SNP的存在可能影响编码蛋白的功能、初级转录物的剪接，或者可能改变转录因子与细胞的调控区域的结合GRHL公司基因。因此，这些多态性的存在可能表明受影响人群中NMSC发生风险的改变。