卵巢癌组织和球形培养物中醛脱氢酶同工酶的鉴定

摘要

背景

醛类脱氢酶属于解毒酶的超家族，可保护细胞免受致癌醛类的伤害。在超家族中，ALDH1A1最受关注，因为目前的研究表明其表达与人类肿瘤干细胞有关。然而，ALDH1A1只是目前已知的19个人类ALDH亚家族中的一个。本研究的目的是确定其他主要ALDH同工酶的表达和活性是否与人类卵巢癌和卵巢癌球培养有关。

方法

应用免疫组织化学方法研究ALDH同工酶在临床卵巢组织中的定位。对从癌细胞系和卵巢癌球制备的裂解物进行Western Blot分析，以确认免疫组化结果。使用定量逆转录聚合酶链反应来测量mRNA的表达水平。Aldfluor®测定法用于测量四种肿瘤亚型癌细胞中的ALDH活性。

结果

免疫组织化学染色显示，与正常卵巢组织相比，卵巢肿瘤中ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1同工酶显著过度表达。如免疫组织化学、Western blot分析和Aldefluor®分析所示，ALDH1A1的表达和活性与肿瘤类型相关。黏液性和子宫内膜样卵巢上皮肿瘤中的表达高于浆液性和透明细胞肿瘤。在一些浆液性和大多数透明细胞肿瘤中，基质成纤维细胞中发现ALDH1A1表达。所有研究的ALDH同工酶的RNA表达在子宫内膜样和粘液性肿瘤中也显示出高于浆液性和透明细胞亚型的表达。ALDH酶在无血清培养基中以球形悬浮液形式生长的卵巢癌细胞中的表达表现出肿瘤类型依赖性诱导。

结论

我们的研究结果表明，ALDH酶的表达和活性可能与卵巢肿瘤组织中的特定细胞类型有关，并因细胞状态而异。阐明ALDH同工酶在谱系分化和发病机制中的功能可能对卵巢癌的病理生理学具有重要意义。

背景

卵巢癌占妇科恶性肿瘤死亡人数的一半以上[1]. 2010年，估计有14000人死亡，因此是5人死亡^第个美国女性癌症死亡的最常见原因[2]. 由于大多数卵巢癌患者都是在晚期诊断出来的，尽管手术和化疗成功，80%的患者还是复发了，因此5年生存率只有30%[三]. 因此，特异而敏感的筛查程序和确定对卵巢发病机制至关重要的靶点，对于降低卵巢癌的死亡率至关重要。

卵巢上皮癌是一种多样性很强的肿瘤。根据世界卫生组织（WHO）的标准，卵巢肿瘤可分为良性、低恶性潜能（临界）或恶性[4]. 卵巢癌的组织学分类基于形态学标准，并与女性生殖系统中不同类型的上皮细胞相对应[5]. 上皮性卵巢癌有四种主要的组织学亚型[4]. 浆液性肿瘤是最常见的卵巢肿瘤类型，其上皮细胞类似输卵管上皮细胞，约占原发性上皮性卵巢肿瘤的50%。粘液性肿瘤占上皮性卵巢癌的12-15%。这是一种囊性肿瘤，瘤腔内衬粘液分泌上皮细胞，类似宫颈上皮或结肠上皮。最近的研究表明，一些粘液性卵巢肿瘤可能由于其他器官的转移而被误诊[6]. 子宫内膜样肿瘤和透明细胞肿瘤各占卵巢上皮癌的10%。这些肿瘤被认为是由卵巢内的子宫内膜异位症病灶和子宫内膜异位囊肿引起的[7,8]. 不同的肿瘤亚型以特定通路的失调为特征，对疾病预后和治疗反应具有重要影响[9–11]. 不幸的是，卵巢癌发生和组织学分化的分子机制尚不清楚。

肿瘤干细胞（CSC）模型假设肿瘤中存在细胞层次结构，因此肿瘤细胞子集具有自我更新和生成构成肿瘤的不同细胞的能力[12]. 因此，CSC可能负责肿瘤发生的持续维持，以及不同类型肿瘤的多系分化。然而，很难确定实体肿瘤中代表CSC及其子代的细胞表面免疫表型。不同研究小组发现，迄今为止描述的相同肿瘤类型的细胞表面生物标记物差异很大[13–15]. 最近有报道表明，分化细胞可以获得自我更新能力[12,16]干细胞样癌细胞出现从头开始来自非干细胞在体外和体内[17,18]表明茎和非茎隔室之间存在双向相互转换。通过遗传或药理学方法对细胞状态动力学的扰动有可能改变细胞亚群的比例。因此，肿瘤的“干细胞”及其对治疗操作的反应可能取决于癌细胞群体中的随机状态平衡。早期干细胞研究中发现的球体分析依赖于干细胞在无血清培养基中与生长因子培养时形成球体的能力，以保持未分化状态[19]. 由人类乳腺上皮细胞形成的哺乳动物具有早期祖细胞/干细胞的特征，能够沿着所有三种乳腺上皮谱系分化，并形成复杂的功能性乳腺结构。肿瘤球细胞最近被广泛用作在体外人类癌症CSC研究模型[20–24]. 球形细胞具有自我更新能力，游离的单个细胞具有形成二级球体的连续能力。当移植到非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠体内时，与体积癌细胞相比，数量较少的球形细胞足以形成肿瘤，并显示出巨大的转移能力[20–24].

已发现不同系统中报告的许多球形细胞和干细胞与商业可用试剂盒Aldefluor®测定的ALDH1A1酶活性升高有关[20,25,26]. ALDH1A1酶活性和表达之间存在明显的正相关性[27]表明ALDH1A1的表达或活性可能与其他细胞表面标记物一起用于识别肝细胞癌、前列腺癌和乳腺实性癌中的肿瘤起始细胞[28–30]. ALDH1A1的表达与早期转移和不良临床结局有关[26]. 醛脱氢酶（ALDH）蛋白是一个由19种酶组成的超家族，被发现可以保护细胞免受各种细胞器中的细胞毒性和致癌醛类的伤害，包括细胞核、细胞质、线粒体和内质网[31,32]. ALDH酶在上皮内稳态中也起着关键作用。因此，这些酶的失调与多种癌症有关，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌[33–37]. 在本研究中，我们旨在研究ALDH同工酶的表达在卵巢肿瘤组织的不同组织学亚型之间是否存在差异。我们的重点是ALDH 1、3和7类同工酶，所有这些同工酶都被报道与癌症发展有关[28,33–35]. 此外，作为探索这些ALDH同工酶与干细胞状态下癌细胞之间潜在关联的初步方法，我们还研究了在无血清培养基中以球体形式生长的卵巢癌细胞中这些ALDH-同工酶的表达水平。

结果和讨论

ALDH同工酶的类型特异性表达

我们首先使用同工酶特异性抗体，采用免疫组织化学方法研究存档卵巢组织中不同ALDH同工酶的表达水平。使用ALDH1A1、ALDH1A3、ALDH3A1、ALDH3A2、ALDH4B1和ALDH7A1特异性抗体对一组健康卵巢、良性、交界性和侵袭性卵巢肿瘤进行染色。我们使用的样本的临床病理特征如附加文件所示1：表S1。我们发现ALDH1A3的表达显著增加（表1)，ALDH3A2（表2)和ALDH7A1（表三)在上皮性卵巢肿瘤组织中较健康卵巢上皮细胞多见。使用Dunnett方法进行的多重比较表明，ALDH3A2和ALDH7A1在正常卵巢和侵袭性肿瘤之间存在显著差异，而ALDH1A3染色在正常卵巢与交界性和侵袭性卵巢肿瘤之间存在明显差异。正常、良性和肿瘤间质成分的ALDH同工酶染色无显著差异。ALDH3A1抗体没有阳性染色，ALDH3B1染色在健康卵巢和卵巢肿瘤组织之间没有显著差异（数据未显示）。ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1的组织学肿瘤亚型之间的差异不显著，部分原因是这些实验中样本量较小且不平衡，可能未检测到细微变化。图中显示了针对不同类别组织的ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1抗体的免疫组织化学染色的代表性图1.

表1根据卵巢标本上皮和基质成分的诊断和组织学特征进行ALDH1A3免疫组化染色

表2根据卵巢标本上皮和基质成分的诊断和组织学特征进行ALDH3A2免疫组化染色

表3根据卵巢标本上皮和基质成分的诊断和组织学特征进行ALDH7A1免疫组化染色

图1

存档卵巢组织中ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1的表达。免疫组织化学染色的代表图答：。ALDH1A3；B。ALDH3A2；和C、。卵巢组织中的ALDH7A1。BOT，交界性肿瘤。比例尺代表50μm。

卵巢组织中干细胞标记物ALDH1A1的初始免疫组化染色产生了上述其他ALDH同工酶所未见的特别有趣的模式。因此，我们增加了更多的病例来证实最初的发现，最终结果如下。健康卵巢和卵巢肿瘤之间的染色无显著差异（表4). 然而，我们发现卵巢肿瘤不同组织学亚型之间的表达存在显著差异。子宫内膜样和粘液性肿瘤在上皮性肿瘤细胞中显著过度表达，而浆液性和透明细胞上皮性肿瘤组织中ALDH1A1的表达很低(P（P） < 0.001). Dunnett的多重比较显示，透明细胞肿瘤中ALDH1A1的表达显著低于粘液和子宫内膜样肿瘤。虽然上皮性透明细胞肿瘤细胞的ALDH1A1表达低于其他肿瘤类型，但透明细胞基质成纤维细胞中ALDH1A2的表达高于其他基质肿瘤类型(P（P）============================================================================0.02). 图2显示了不同卵巢组织中ALDH1A1的代表性图像，尤其是18例透明细胞卵巢肿瘤中肿瘤中ALDH1A染色缺失，但基质部分染色增强。

表4根据卵巢标本上皮和基质成分的诊断和组织学特征进行ALDH1A1免疫组化染色

图2

ALDH1A1在存档卵巢组织中的表达。答：。正常卵巢和不同亚型卵巢肿瘤组织中ALDH1A1免疫组化染色的代表图。B。用ALDH1A1染色的15个透明细胞卵巢肿瘤样本的扩展面板，以证明基质成纤维细胞中的主要染色。比例尺表示50μm。

为了评估ALDH同工酶的肿瘤类型特异性表达，我们还进行了定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），以测量肿瘤组织中ALDH的mRNA表达水平ALDH1A1、ALDH1A3、ALDH1 B1、ALDH3A1、ALDH3 A2、ALDH3B1和ALDH7A1型从冰冻肿瘤组织中显微切割出的肿瘤细胞。图中的箱线图三总的来说，子宫内膜样和粘液性肿瘤中所有ALDH同工酶的RNA水平均显著高于透明细胞和浆液性肿瘤。RNA表达模式类似于ALDH1A1的蛋白表达，与透明细胞和浆液性肿瘤相比，在子宫内膜样和粘液性肿瘤中表达更高。然而，由于ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1同工酶没有显示出特别显著的肿瘤类型特异性蛋白表达，可能还有其他转录后机制调节肿瘤组织中不同的ALDH同工酶蛋白水平。

图3

Boxplot显示不同亚型卵巢肿瘤组织中卵巢癌细胞中ALDH同工酶的定量逆转录聚合酶链反应结果。从19个高级别浆液性、5个粘液性、6个透明细胞和5个子宫内膜样肿瘤组织的肿瘤细胞中提取RNA，并进行定量逆转录聚合酶链反应。每个方框包含对应ALDH同工酶有序表达的中间50%的等级，方框内的水平线表示中间值。从方框延伸的行达到最小和最大数据值，但存在标有星号的异常值除外。Kruskal-Wallis P值表示四个组织学组之间ALDH同工酶的中位数等级是否存在显著差异。C、 卵巢透明细胞肿瘤；E、 子宫内膜样卵巢肿瘤；M、 卵巢粘液性肿瘤；S、 浆液性卵巢肿瘤。

Western blot分析评估ALDH同工酶在卵巢细胞系中的表达。如图所示4A、 除ALDH1A3外，大多数ALDH同工酶在卵巢癌细胞系中的表达水平均高于正常人卵巢表面上皮（HOSE）细胞系。只有OVCA433和MCAS表现出较高水平的ALDH1A3表达。与肿瘤组织的免疫组织化学染色结果一样，ALDH1A1在表达模式上表现出强烈的肿瘤类型依赖性。虽然子宫内膜样癌和粘液癌细胞株表现出高蛋白表达，但浆液细胞和透明细胞株几乎没有检测到蛋白表达。值得注意的是，由于我们只有一个子宫内膜样癌细胞系，因此结果可能不能广泛反映这种组织学亚型。

图4

卵巢细胞系中ALDH同工酶蛋白的表达。答：。Western印迹分析用于比较不同ALDH同工酶在正常人卵巢表面上皮（HOSE）细胞系和不同亚型的癌细胞系中的表达，即浆液性、子宫内膜样（ENDO）、粘液性（MUC）和透明细胞（CC）。细胞系（从左起）：HOSE1-15、HOSE7、HOSE2170、SKOV3、OVCA432、OVCA333、TOV112D、MCAS、RMUGL、RMG1和OVCA810。分子量如右图所示。β-actin作为负荷控制。B。Western blot分析用于比较单层（2D）或球形培养的卵巢癌细胞系中ALDH1A1和ALDH7A1的水平。细胞系（从左开始）：RMG1、MCAS、RMUGL、OVCA432、SKOV3和TOV112D。β-actin作为负荷控制。

ALDH1A1在球形悬浮生长的卵巢癌细胞中的表达及活性

免疫组织化学和Western blot结果使我们通过评估ALDH1A1蛋白在卵巢癌球中的表达，进一步研究其作为潜在干细胞标记物的作用。球体试验，证明干细胞在无血清培养基中与生长因子培养时形成球体的能力[19]，已被广泛采用为在体外人类癌症CSC研究模型[20–24]. 我们通过将卵巢上皮癌细胞作为球形悬浮液在标准无血清培养基中培养，对其进行球形检测。我们使用Western blot分析比较了ALDH1A1和ALDH7A1在卵巢癌细胞中的表达，这些细胞在完全培养基中以球形悬浮生长与单层生长。与单层细胞相比，子宫内膜样癌和黏液癌细胞系形成的球体中ALDH7A1蛋白的表达略有增加。对于ALDH1A1的表达，两种黏液癌细胞系在球形培养物中的表达高于单层培养物。子宫内膜样癌细胞系在球形和单层培养中均表达非常高水平的ALDH1A1。透明细胞癌细胞系显示从单层细胞到球形细胞有所增加。相反，浆液性癌细胞系在球体中的ALDH1A1表达没有增加（图4B） ●●●●。

除了蛋白质表达分析外，还使用Aldefluo®分析来测量单层和球形癌细胞中的特定ALDH活性。代表性结果如图所示5，与Western blot分析所得结果平行。黏液癌细胞在球形细胞中表现出强烈的活性增强。子宫内膜样细胞在单层和球形条件下均表现出较强的ALDH活性。透明细胞癌细胞在球形细胞中的活性略有增加，而从腹水样本中提取的浆液癌细胞在两种培养条件下均未显示任何ALDH活性。尽管其他研究表明，Aldefluor®分析也可以测量其他一些ALDH亚型（如ALDH1A3）的活性[34,36]，我们的Aldefluor®检测结果密切反映了癌细胞中ALDH1A1的活性。

图5

不同培养条件下癌细胞中ALDH的活性。Aldefluo®用于评估单层培养或球形培养细胞中的ALDH酶活性。流式细胞术图显示了在不存在或存在二乙氨基苯甲醛（一种特定的ALDH抑制剂）的情况下，反应的ALDH-底物的荧光强度答：子宫内膜样癌细胞株TOV112D；B类：透明细胞癌细胞株RMG1；C、。粘液癌细胞系RMUGL，和医生：从临床腹水中分离的高级别浆液性癌细胞。门控区域指示ALDH⁺细胞。

卵巢癌中ALDH同工酶表达的意义

卵巢癌本质上是异质性的，包括不同组织学亚型和发育阶段的肿瘤[4,5]. 癌症干细胞假说提出存在不同的肿瘤增殖细胞群，这些细胞群负责向不同类型的肿瘤进行自我更新和多系分化[12]. ALDH1A1和最近的ALDH1A3被描述为在不同人类肿瘤和在体外系统[26,28,34,36]. ALDH1A1阳性也与卵巢癌的化疗耐药相关[38,39]. 本研究表明，ALDH1A1主要在粘液和子宫内膜样上皮癌细胞中表达，但在大多数浆液和透明细胞癌细胞中不表达。相反，在后两种卵巢癌的基质成纤维细胞中发现ALDH1A1高表达。在之前的研究中，发现乳腺基质细胞中ALDH1A1的表达水平高于上皮细胞[40]. 尽管可能有人认为基质ALDH1A1染色来自具有间充质特征的癌细胞，正如一组肺腺癌细胞系的蛋白质组分析研究所表明的那样[37]，我们研究中观察到的主要基质染色与ALDH1A1在不同组织学类型的卵巢肿瘤中的表达具有明显的谱系特异性一致。已有大量文献证明，ALDH同工酶的表达和活性水平取决于癌症类型和/或来源细胞[36,40]. 佩努马萨等。。最近报道ALDH1A1在浆液性卵巢肿瘤中的表达降低[41]和李等。。据报道，组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2抑制了高级浆液性卵巢癌中ALDH1A1的表达[42]. 阐明ALDH1A1在卵巢癌谱系分化及其调控中的作用将是非常有趣的。

此外，评估ALDH1A3、ALDH3A2和ALDH7A1同工酶升高在卵巢癌中的功能作用也同样重要。据报道，ALDH1A3亚型是一种新的CSC标记物，在乳腺癌的临床预后中具有潜在的应用价值[34]. ALDH7A1也被发现与前列腺癌骨转移有关[33]. 进一步分析这些新的ALDH同工酶可能对卵巢癌的诊断和预后有重要意义。更深入地了解其在卵巢癌发生发展中的分子机制可能为更有效地治疗卵巢癌铺平道路。

结论

我们对卵巢肿瘤和癌细胞系中不同ALDH同工酶的表达进行了分析。ALDH1A1显示肿瘤类型特异性表达模式，可能表明在卵巢肿瘤组织病理学发展过程中，其在谱系特异性分化机制中发挥作用。需要进一步研究来阐明ALDH1A1和其他ALDH同工酶升高在卵巢发病中的作用。

方法

卵巢临床样本和卵巢细胞系

从在布莱根妇女医院接受手术诊断原发性卵巢癌的妇女或正在接受子宫切除术或妇科良性疾病卵巢切除术的对照受试者中收集福尔马林固定、石蜡包埋的存档正常、良性和癌性卵巢组织。另外15例透明细胞卵巢癌来自日本大阪市综合医院妇产科。所有患者衍生的生物样本均按照美国布里格姆女子医院人体受试者委员会和日本大阪市总医院批准的方案进行收集和存档。在患者书面知情同意的情况下收集样本，并由妇科病理学家进行组织学确认。病例根据国际妇产科学联合会（FIGO）系统分期。正常人卵巢表面上皮细胞（HOSE）和卵巢癌细胞系已在前面描述过[43]. 对因良性疾病行子宫切除术或卵巢切除术的对照组受试者，通过刮取卵巢表面收集正常HOSE细胞。通过HPV E6/E7基因导入使长期HOSE细胞永生化。所有卵巢细胞系均保存在199培养基和MCDB105培养基（1:1）（西格玛，圣路易斯，密苏里州）的混合物中，并添加10%的胎牛血清（Invitrogen，Carlsbad，CA）。

球体分析

根据Dontu进行标准球体分析等…有微小的变化[19]. 在超低附着培养板（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）中，将单个癌细胞重新悬浮在补充有B27（Invitrogen）、20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF（Invit罗gen）以及4μg/ml肝素（Sigma-Aldrich）的NeuroBasal-A培养基（Invitrongen）中。细胞培养1周，在收获前形成球形。

免疫组织化学

将石蜡包埋的卵巢组织块切片，厚度为7μm，安装在Superfrost Plus显微镜载玻片上（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA），并在50°C下干燥至少3小时。使用二甲苯进行脱蜡，并使用分级乙醇系列进行再水化。在压力锅中的抗原提取溶液（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）中进行10分钟的抗原提取。用0.3%H阻断内源性过氧化物酶₂0₂在甲醇中放置20分钟。然后用正常阻断血清阻断切片20分钟，然后用ALDH同工酶特异性抗体孵育过夜。已描述了ALDH1A1、ALDH1A3、ALDH3A1、ALDH3A2和ALDH3B1的特异性抗体[44,45]. ALDH7A1特异性抗体购自Epitomics，Inc（加利福尼亚州伯林盖姆）。与一级和二级抗体孵育后（加利福尼亚州伯灵盖姆向量实验室），使用二氨基联苯胺染色原作为底物的Vectastain Elite ABC试剂盒观察反应（加利福尼亚州伯灵盖姆矢量实验室）。切片用苏木精轻轻复染，并安装在Permount®（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）。染色采用半定量评分系统进行量化。加权评分是通过将染色强度评分范围从3+（最强阳性）到0（无染色迹象）和阳性细胞百分比评分范围从3%（100%染色）到0之间（无细胞染色）相乘得出的。两名经过训练的观察者对幻灯片进行独立评分，并对差异进行比较并取平均值。

RNA分离和定量逆转录聚合酶链反应

使用MD-LMD激光显微解剖显微镜（Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL）对冷冻组织中的卵巢肿瘤细胞（19个高级浆液性、5个粘液性、6个透明细胞和5个子宫内膜样）进行显微解剖。注意，这些样本与免疫组化研究中使用的样本不同。总RNA使用RNeasy Micro Kit（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）进行分离。分别使用高容量cDNA逆转录试剂盒和SYBR®Green PCR试剂盒（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）进行逆转录和实时PCR。表中列出了不同ALDH同工酶的引物5为了计算每个基因的相对表达，2^-ΔΔCT方法用于关联C_T型每个样本的ALDH表达值与C_T型看家基因亲环素A的值[46].

表5定量逆转录聚合酶链反应中使用的引物序列

蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 8，150）从生长细胞中制备总细胞裂解物mM NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠）补充PhosStop磷酸酶抑制剂混合物和完整蛋白酶抑制剂混合物（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司），并使用MicroBCA蛋白质检测试剂盒（伊利诺伊州罗克福德热电科学公司）测量蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离10μg总细胞裂解物，并使用SEMI-DRY转移细胞（加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad实验室）转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。在室温下用5%脱脂干乳在1X TBST缓冲液（10 mM Tris–HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.05%吐温-20）中封闭1小时后，将膜与一级抗体在4°C孵育过夜，然后用1X TBST-缓冲液在室温下清洗。结合抗体由与辣根过氧化物酶结合的二级抗体（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯生物技术公司）和Supersignal west pico试剂盒（伊利诺伊州罗克福特皮尔斯生物科技公司）检测。

Aldefluo®分析

如制造商所述，使用Aldefluo®检测试剂盒（STEMCELL Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）检测ALDH活性。简单地说，将细胞系或球体中分离的单个细胞重新悬浮在含有ALDH底物bodipy-氨基乙醛（BAAA）的Aldefluo®分析缓冲液中，悬浮温度为7.5μM，并在37°C下培养1小时。在15 mM二乙氨基苯甲醛（DEAB）（一种ALDH特异性抑制剂）存在下也进行了相同的反应。使用Accuri C6流式细胞仪（BD-Accuri细胞仪，密歇根州安阿伯）分析染色细胞的荧光强度。与DEAB的反应用于确定测定的基线，即与ALDH活性无关的荧光。样品的ALDH活性是根据超过与DEAB反应定义的阈值的荧光强度来确定的。

统计分析

所有分析均使用MINITAB统计软件（宾夕法尼亚州州立学院MINITAB）进行。ANOVA用于比较不同诊断组和组织学组的平均IHC得分。如果不满足等总体方差假设，则进行非参数Kruskal-Wallis检验，以比较ANOVA得出的结果。当各组之间存在统计显著差异时，使用Dunnett的方法与对照组（诊断用健康组和组织学用透明细胞组）进行多重比较。当差异达到5%水平时，即P≤0.05，则认为差异显著。由于未满足qRT-PCR数据的正态性假设，因此使用Kruskal-Wallis检验根据组织学亚型分析排名qRT-PCR数据，结果以箱线图形式显示。