一种热敏Osh蛋白控制PI4P极性

摘要

背景

磷脂酰肌醇脂质在极化细胞生长和迁移过程中提供空间标志。然而，磷脂酰肌醇梯度如何根据细胞外信号和环境条件进行定向尚不清楚。在这里，我们阐明了磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）调控极化分泌的一种意外模式。

结果

我们发现PI4P在芽殖酵母中生长子细胞的质膜上高度富集，在那里发生极化分泌。然而，在重定向分泌流量的热应激条件下，PI4P在母细胞质膜处迅速增加，导致PI4P分布更加均匀。PI4P分布的精确控制通过Osh（氧化甾醇结合蛋白同源性）蛋白介导，Osh蛋白将PI4P结合并呈现给磷脂酰肌醇磷酸酶。有趣的是，Osh3在热应激条件下发生相变，导致细胞内聚集并减少皮层定位。Osh3 GOLD和ORD域都足以形成热应力诱导聚集，表明Osh3高度适应热应力条件。当Osh3功能丧失时，PI4P和胞外成分Exo70的极化分布均受损。因此，一种固有的热应激敏感性PI4P调节蛋白控制着磷脂酰肌醇脂质代谢的空间分布，以根据需要直接进行分泌运输。

结论

我们的结果表明，Osh蛋白对PI4P代谢的控制是控制极化生长和分泌的关键决定因素。

背景

4-磷酸磷脂酰肌醇（PI4P）正在成为质膜（PM）特性和功能的关键决定因素。PI4P在控制PM离子通道和向PM普遍招募多基蛋白方面发挥着重要作用[1]。PI4P甚至可以作为蛋白质靶向特定PM结构域的空间线索或路标。例如，PI4P在神经祖细胞的初级纤毛中高度富集[2,三]。PI4P也在致病丝状真菌的生长尖端富集白色念珠菌，表明极化生长中的进化保守作用[4]。在芽殖酵母中，PI4P组织肌动蛋白细胞骨架，并被提议将p21活化激酶Cla4靶向极化生长位点[5,6]。然而，在PM控制PI4P分布的监管机制尚未完全被理解，甚至存在争议。

磷脂酰肌醇4-激酶III型α（也称为PI4KIIIα）在PM合成PI4P，PI4KA在哺乳动物和哺乳动物中编码STT4型中的基因酿酒酵母[5,7,8]。酵母Stt4 PI4KIIIα蛋白定位于称为PIK（磷脂酰肌醇激酶）斑块的皮层集合，这与其在PM生成PI4P中的基本作用一致[5,9,10]。然而，奇怪的是，PI4P在生长中的子细胞（芽）的PM中富集，而皮层Stt4-PIK斑块在母细胞中广泛存在[9,10]。目前尚不清楚PI4P是如何在生长芽中积累的，以及PI4P在Stt4-PIK斑块所在的母细胞中是如何保持相对较低水平的。在这里，我们讨论Stt4-PIK补丁及其产品PI4P之间的矛盾分布。我们发现Stt4-PIK斑块与母细胞中的皮质内质网（ER）有关。ER和PM之间的连接，也称为ER-PM接触，被认为是保守ORP/Osh蛋白家族进行PI4P介导的非囊泡脂质交换反应的位点[11,12,13,14]。因此，我们发现ORP/Osh蛋白家族的成员对于PI4P在PM的正确分布是必要的。

此外，我们发现环境条件的变化会影响PI4P的利用和分布。已知热休克条件会破坏极化分泌[15]，非泡状PI4P消耗减弱，导致母细胞产生PI4P信号并降低PI4P极性。这种控制至少在部分上是通过使提取PI4P并将其传递给ER-localized PI4P磷酸酶的Osh3蛋白失活来实现的。有趣的是，Osh3是一种热应激敏感蛋白，在热休克时迅速形成细胞内聚集物。值得注意的是，Osh3蛋白的PI4P结合ORD区域足以进行聚集，为根据需要调节PI4P提供了一种快速而直接的机制。我们提出，PI4P代谢的控制可能为指导极化生长和细胞对环境条件变化的反应提供了一种保守的机制。

结果

PI4P极化并受生理信号调节

磷脂酰肌醇在质膜（PM）的脂质代谢由特定的脂激酶和磷酸酶控制（图1a） ●●●●。然而，细胞如何在PM处产生离散的磷酸肌醇信号以响应生理刺激仍知之甚少。磷脂酰肌醇4-磷酸亚型磷脂酰肌糖醇（PI4P）可能在极化细胞生长和细胞信号传导中发挥着特别重要但尚未被认识到的作用。先前的研究报告称，PI4P在芽殖酵母的小（生长）子细胞中富集[16,17,18,19]。然而，这些研究描述了定性观察而非定量测量，并使用了结合PI4P和PI（4,5）P的报告者₂[20]。因此，我们使用经验证的PI4P FLARE（荧光脂质相关报告物），即特异性结合PI4P的SidC的P4C结构域，通过定量显微镜监测了PI4P在PM的分布[21,22]（图1和其他文件1：图S1）。由于PI4P定位于细胞内以及PM，GFP-P4C强度与PM标记物（mCherry-2xPH）共同定位^PLCδ)具体测量（参见附加文件中的示例1：图S1a-b）。在无应力生长条件下（26 °C），与母细胞相比，子细胞PM处PI4P FLARE高度富集（> 5折，图1b、 c，附加文件2：图1c和1d数据集）。这种极化分布表明，PI4P可能是PM的一个里程碑，正如其他带负电荷的脂质（包括PI（4,5）P）所建议的那样₂和磷脂酰丝氨酸[1,23,24,25].

图1

PI4P分布受生长条件调节。一PI4P和PI（4,5）P中涉及的激酶和磷酸酶的示意图₂新陈代谢。热休克引发PI4P-和PI（4,5）P₂-介导的信号反应包括调节的胞吐和胞吞。b条用于测量26时PM GFP-P4C荧光强度的方法的示意图 °C及之后42 °C热冲击。简单地说，使用斐济对子细胞和母细胞进行行扫描，记录子细胞（Fd）和母细胞（Fm）PM处对应GFP-P4C荧光强度的峰值，以计算Fd/Fm比率。c（c）26岁时子代（Fd）和母代（Fm）细胞质膜（PM）处GFP-P4C荧光的定量 °C和10之后 最小值42 °C热冲击。图中显示了单个细胞的Fd和Fm平均值。三个独立实验中分析的细胞总数：26 摄氏度，n个 = 40, 10 最小值42 摄氏度，n个 = 45.误差条显示标准偏差。热休克后Fd和Fm的变化具有统计学意义(t吨测试****第页<0.0001, ***第页 = 0.0002).d日26时子细胞（Fd）和母细胞（Fm）质膜（PM）处GFP-P4C荧光的定量 °C和10之后 最小热冲击，如所述c（c）。图表显示单个单元格的Fd/Fm比率。三个独立实验中分析的细胞总数：26 摄氏度，n个 = 40, 10 最小值42 摄氏度，n个 = 45.误差条显示标准偏差。热休克后Fd/Fm比值的下降具有统计学意义(t吨测试****第页<0.0001)

如果PI4P是PM的一个空间里程碑，那么它的分布应该随着调节细胞极性的生理刺激而改变。热在出芽酵母细胞中引发多种反应，包括肌动蛋白细胞骨架的重组、Rho-GTPase信号传导和母细胞中囊泡运输事件的增加[9,15,26]。短暂热休克（10 42时最小值 °C），子细胞中PI4P的极化富集显著降低。子细胞PM处的GFP-P4C强度下降了两倍（图1c和附加文件2：图1c和d数据集）和母体细胞PM的两倍增加（图1c、 其他文件1：图S1d，附加文件2：图1c和d数据集，以及附加文件三：图S1c和S1d数据集）。因此，热休克后，子细胞和母细胞之间PI4P报告子分布的比率显著下降（五倍）(F类_d日/F类_米 = 26时为7.5 °C与F类_d日/F类_米 = 42时为1.5 °C；图1b–d和附加文件2：图1c和d数据集）。这些反应发生得非常迅速，在2到4个小时内 min（附加文件1：图S1b-d和附加文件三：图S1c和S1d数据集），表明监管系统高度敏感。

接下来，我们研究了母体细胞PM处PI4P信号增加的潜在机制，这可能是由于合成增加和/或水解减少所致。PI4P由Stt4蛋白在芽殖酵母的PM处生成，Stt4蛋白质是磷脂酰肌醇4-激酶III型α（PI4KIIIα）的同源物[5]。因此，GFP-P4C在温度条件下从PM中损失stt4（stt4）热休克后的突变细胞（附加文件4：图S2a）。PI4KIIIα存在于两种不同的蛋白质复合物中。PI4KIIIα复合物I由酵母中的Stt4/Efr3/Ypp1和哺乳动物细胞中的PI4KIIIα/Efr3/TTC7/FAM126A组成（图2a）[8,10,27]。PI4KIIIα复合物II由酵母中的Stt4/Efr3/Sfk1和哺乳动物细胞中的PI4KIIIIα/Efr3/TMEM150组成（图2a）[9,28]。Sfk1是热诱导PI（4,5）P所必需的₂酵母合成和TMEM150蛋白参与PI（4,5）P₂磷脂酶C活化后的再合成[9,28]。我们测试了母细胞PM热诱导PI4P增加是否需要与热诱导PI（4,5）P相关的“信号”Stt4-PI4K复合物II₂合成。令人惊讶的是，热休克在缺乏Sfk1的母细胞的PM处诱导了PI4P信号（图2b） ●●●●。因此，含有Sfk1的Stt4-PI4K复合物II并非绝对需要用于热诱导PI4P从子细胞向母细胞的再分配。Stt4-PI4K复合物I可能也有助于母细胞中诱导的PI4P信号。因此，热诱导的GFP-P4C重新分布在ypp1–7个突变细胞（附加文件4：图S2b和附加文件5：图S2b数据集）。为了支持这些结果，以前的工作表明Ypp1参与了PM处PI4P的大部分合成[10,29]。此外，最近的一项研究表明PI4K复合物I参与刺激诱导的PI（4,5）P₂后生动物细胞中的合成[30]。所以，这两种Stt4-PI4K复合物都可能参与母细胞中热诱导PI4P信号的产生。

图2

Stt4 PIK贴片定位于ER-PM接触部位。一PM.Stt4复合体I（Stt4/Efr3/Ypp1）上存在的两个Stt4 PI 4-激酶复合体的示意图，也称为PIK斑块，在母细胞中富集，对Osh3 PM定位至关重要。ORP/Osh蛋白家族成员被提议在ER-PM接触处介导脂质转移和交换，导致Sac1磷酸酶消耗PI4P。复合物II（Stt4/Efr3/Sfk1）参与刺激诱导的PI4P和PI（4,5）P₂合成。b条母体细胞中热诱导PI4P信号传导不需要Sfk1（Stt4复合物II）。GFP-P4C荧光显示野生型PI4P定位（左侧面板）和sfk1型26处的Δ电池（右面板） °C和42 摄氏度。箭头指出母体细胞PM的PI4P水平增加。比例尺，5 微米。c（c）Stt4复合物I（PIK补丁）与ER相关。表达GFP-Stt4或Ypp1-GFP（绿色）的野生型细胞共同表达ER标记DsRed-HDEL（洋红色）。母（m）和子（d）单元格显示（虚线）。含有Stt4和Ypp1的PIK补丁（用白色勾勒）被自动分割并评分，以便与ER标记共同定位。比例尺，4 微米。d日使用斐济鉴定了GFP-Stt4 puncta（1111细胞7264）和Ypp1-GFP putta（1527细胞13079）的ER.Maxima对PIK斑块定位的高含量定量分析。ER标记物DsRed-HDEL的Maxima阳性被评分为ER相关。结果显示了三个独立实验的平均值和标准偏差

Stt4 PI4K组件定位于ER-PM触点

即使在非应激生长条件下，皮层Stt4 PI4K组件（也称为PIK斑片）也在母细胞中富集[9,10]（图2c） ●●●●。这是令人惊讶的，因为在非应激生长条件下，PI4P在子细胞而非母细胞的PM处富集（图1和其他文件1：图S1）。建议Stt4 PIK补丁可能位于PM和ER之间的触点处[10]，和ER-PM触点与PI4P调节有关[16]。然而，ER-PM触点的Stt4定位尚未得到证实。因此，我们通过更详细地检查PIK补丁定位来研究Stt4-generated PI4P的潜在调控机制。我们使用高含量定量显微镜检查了同时表达GFP标记的PIK斑块蛋白（Stt4或Ypp1）和ER标记物（DsRed-HDEL）的细胞中PIK斑块的分布。PIK斑块被自动分割，随后确定单个PIK斑块内GFP信号强度的最大值。接下来，量化每个GFP最大值（PIK斑块）内DsRed-HDEL（ER）信号的强度。还测量了ER中DsRed-HDEL强度的动态范围，以确定DsRed-HDEL ER信号的最小特异性水平和无ER区域的最大非特异性背景DsRed-HDEL水平。这些测量设置了一个阈值，将单个GFP最大值指定为与ER相关或无ER。

含有Stt4-和Ypp1-的PIK补丁与外周ER广泛吻合（图2c、 白色痕迹显示分段的GFP-Stt4和Ypp1-GFP PIK斑块；> 在所示示例中，80%与DsRed-HDEL重叠，附加文件6：图2c和S2c数据集）。DsRed-HDEL ER标记与高含量实验中确定的80%GFP-Stt4斑块重叠（三个独立实验中1111个细胞中最多7264个，图2d和附加文件7：图2d数据集）。同样，76%的Ypp1-GFP皮质斑块（1527个细胞中最大13079个）与ER相关（图2d和附加文件7：图2d数据集）。网织红蛋白（Rtn1、Rtn2和Yop1）的丢失将内质网形成高度弯曲的小管和具有弯曲边缘的膜片[31]没有改变PIK斑块与皮质ER的相关性。GFP-Stt4与皮质ER片广泛相关（78%重叠），网织红突变细胞中缺乏皮质ER的PM区域明显缺乏GFP-Stt 4(rtn1型∆rtn2型∆第1年∆突变细胞，附加文件4：图S2c和附加文件6：图2c和S2c数据集）。相反，PIK斑块与ER的定位依赖于ER-PM接触形成。在缺乏形成ER-PM接触的ER-localized Scs2和Scs22蛋白的细胞中[16,32]，GFP-Stt4斑块在缺乏皮质ER的PM区域清晰可见(南海2号∆供应链22∆突变细胞，附加文件4：图S2c）。因此，Stt4-PI4K复合物I组合（PIK斑块）与皮质ER广泛相关，这种排列可能影响母细胞中PI4P的代谢。

PM-localized PIK斑块靠近皮质ER中的Scs2和Sac1 PI4P磷酸酶

我们进一步详细研究了Stt4-PI4K复合物I亚单位和Scs2之间的潜在关联。Scs2是VAP-a/B同源基因，是一种尾部锚定的内质网膜蛋白，具有N端细胞质MSP结构域。MSP结构域将蛋白质与FFAT基序结合（酸性道中的两个苯丙氨酸）[33]。使用计算FFAT基序的算法检测Stt4-PI4K复合物I蛋白[33]在Efr3蛋白的C末端发现了一个候选的FFAT样基序（…GENQNDDFKDANED公司LHSLSSRGKIFSST公司₇₈₂). 我们采用了双分子荧光互补（BiFC或分裂GFP；图三和其他文件8：图S3）分析ER-localized Scs2蛋白是否接近PM-localize Efr3蛋白。在共表达Efr3-GFP的细胞中观察到皮层GFP斑块_N个和GFP_C-Scs2融合（图三a） ●●●●。有趣的是，Efr3-Scs2相互作用发生在母细胞而不是子细胞中，发生在皮层内质网结构中而不是细胞质内质网或核内质网区域（图三a） ●●●●。Efr3中的FFAT基序是与Scs2有效关联所必需的，因为在表达截断Efr3的细胞中，分裂的GFP信号强度显著降低^∆法特-绿色荧光粉_N个融合和GFP_C-Scs2（图三a、 b和附加文件9：图3b数据集）。在对照实验中，全长Efr3-GFP_N个和截断的Efr3^∆FFAT-绿色荧光粉_N个融合物均与Efr3-GFP相互作用_C，表明Efr3缺失FFAT基序的截断形式被表达（图三c、 d和附加文件10：图3d数据集）。除Scs2外，Efr3与BiFC评估的ER-localized PI4P磷酸酶Sac1接近（附加文件8：图S3b）。与Efr3类似，Sac1在皮质斑块处显示出同型相互作用（附加文件8：图S3b），表明Sac1可能聚集在皮层ER中。在其他对照实验中，Efr3与Ypp1相互作用，Sac1与Scs2通过BiFC相互作用（附加文件8：图S3b），与公布的数据一致[10,16,34]。因此，ER-localized Scs2在PM接近Stt4-PIK补丁亚单位Efr3，并与ER中的Sac1 PI4P磷酸酶相互作用。这种结构可能允许有效控制Stt4在母细胞PM产生的PI4P。

图3

PIK补丁亚单位Efr3与ER-localized Scs2相互作用。一Efr3 FFAT基序促进Scs2-Efr3相互作用。Scs2与Efr3或Efr3之间的相互作用^∆FFAT由BiFC评分。表达Efr3-GFP的细胞_N个（上面板）或Efr3^∆FFAT-绿色荧光粉_N个（下面板）以及GFP_C-Scs2和ER标记DsRed-HDEL（洋红色）。比例尺，5 微米。b条Efr3-GFP相互作用产生的特定BiFC信号的定量_N个或Efr3^∆法特-绿色荧光粉_N个带GFP_C-ER处的Scs2使用DsRed-HDEL定义感兴趣区域。图表显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。每个点表示图像帧的平均值（带有> 10个单元/帧）；30帧（> 300个细胞）。表达Efr3-GFP的细胞中BiFC信号之间的差异_N个与Efr3相比^∆FFAT-绿色荧光粉_N个带有GFP_C-Scs2具有统计学意义（t检验****第页<0.0001).c（c）Efr3-Efr3交互不需要Efr3 FFAT基序。表达Efr3-GFP的细胞_N个（上面板）或Efr3^∆FFAT-绿色荧光粉_N个（下面板）以及Efr3-GFP_C和PM标记mCherry-2xPH^PLCδ.比例尺，5 微米。d日Efr3-GFP相互作用产生的特定BiFC信号的定量_N个或Efr3^∆FFAT-绿色荧光粉_N个使用Efr3-GFPc，使用mCherry-2xPH^PLCδ指定PM处的Efr3-Efr3相互作用。图表显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。每个点表示图像帧的平均值（> 10个单元/帧）。总帧数：Efr3–Efr3n个 = 33，Efr3^∆FFAT–设备3n个 = 31.结果显示Efr3-GFP之间没有差异_N个与Efr3相比^∆FFAT-绿色荧光粉_N个与Efr3-GFPc联合

Osh3介导的PI4P水解在热休克过程中减弱

我们的结果表明St4PIK补丁定位于ER-PM接触（图2和三)与PI4P监管有关[16]。热休克时，ER-PM触点可能会分解或Stt4可能会移动到无ER-PM区，从而损害Sac1介导的母细胞PI4P水解。然而，在热休克期间，观察到皮层ER结构，Stt4 PIK斑块与皮层ER网络广泛共存（附加文件11：图S4a-b）。然后我们进一步研究了热诱导的母体细胞PM处PI4P信号是如何被触发的。

Scs2结合并招募含FFAT基序的Osh3蛋白[19,35]。Osh3是一个保守的脂交换蛋白家族的成员，即氧甾醇结合蛋白相关蛋白（ORP）。酵母Osh2和Osh6/7蛋白分别在体外结合麦角固醇和磷脂酰丝氨酸，并建议将这些脂质从内质网转移到质膜，以交换PI4P[12,13]（图2a） ●●●●。目前还没有确定Osh3是否为脂质转运蛋白，但Osh3已被证明能结合PI4P并在体外激活Sac1 PI4P磷酸酶[19,36]。我们检测了与PM PI4P池代谢相关的Osh蛋白（通过提取PI4P并将PI4P输送至内质网以交换另一种脂质或直接将PI4P输送至Sac1磷酸酶）是否在热休克期间减弱。在正常生长条件下，Osh3-GFP在皮质斑块处以及细胞质中广泛分布（图4a） ●●●●。热休克后，Osh3-GFP（细胞共同表达PM标记mCherry-2xPH）的皮质定位^PLCδ)Osh3-GFP显著减少，而定位于许多细胞内点状突起（图4a、 b和附加文件12：图4b数据集）。

图4

Osh3调节PI4P的代谢和分布。一Osh3-GFP（绿色）和PM标记mCherry-2xPH的定位^PLCδ（洋红色）第26页 °C及之后10 42时的最小热冲击 摄氏度。热休克后，Osh3从皮质斑块转变为内点状。比例尺，5 微米。b条26岁时细胞皮层Osh3-GFP荧光强度的定量 °C与10 最小值42 °C热冲击。PM标记mCherry-2xPH^PLCδ用于定义感兴趣的皮层区域。图表显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。点表示单个图像帧的平均值（> 10个单元/帧）。分析的总帧数：26 °C（摄氏度）n个 = 48, 42 °C（摄氏度）n个 = 41.热休克后皮质Osh3-GFP荧光降低具有统计学意义(t吨测试****第页<0.0001).c（c）野生型（上面板）和职业安全与健康3∆（下面板）表达PI4P报告基因GFP-P4C的细胞，生长于26 摄氏度。箭头指向母体（m）细胞PM处的PI4P。比例尺，5 微米。d日野生型和野生型皮层GFP-P4C荧光强度的定量职业安全与健康3∆细胞在26岁时生长 摄氏度。参见图1c了解分析细节。图表显示了三个独立实验中单个细胞的Fd/Fm比率，条形图表示平均值和标准偏差(t吨测试****第页<0.0001). 分析的细胞数：WTn个 = 105,职业安全与健康3∆n个 = 117e（电子）表达Osh2-GFP（左面板）或Osh7-GFP（右面板）的细胞生长于26 °C，受到10次热冲击 42时最小值 摄氏度。比例尺，5 微米

我们还研究了Osh3失活是否与母细胞中热诱导的PI4P信号有关。为了支持这一点，PI4P的极化分布在职业安全与健康3∆细胞，即使在非应激条件下，缺乏Osh3的母细胞在PM时GFP-P4C增加（图4c） ●●●●。因此，缺乏Osh3（F_d日/F类_米 = 野生型细胞在26岁时为5.4 °C与F_d日/F类_米 = 2.5英寸职业安全与健康3∆单元格，26 °C；图4d和附加文件13：图4d数据集）。定位于ER-PM接触的其他Osh蛋白（Osh2、Osh6和Osh7）[13]也有助于PI4P极化，因为缺乏这些蛋白的母细胞中PI4P报告子的定位增加（附加文件11：图S4c）。热休克后，Osh2和Osh7仍留在皮质斑块处（图4e） ，尽管结果并没有说明这些蛋白质在热休克时是否减弱。总之，结果表明Osh蛋白对非应激条件下PI4P的极化分布很重要，并提示Osh3失活可能参与了母细胞热诱导PI4P信号的产生。

Osh3蛋白经历热诱导聚集

我们进一步检查了热休克期间形成的细胞内Osh3点。热休克时，Osh3-GFP与Hsp104广泛定位（图5a、 b，附加文件14：图5b数据集）。Hsp104是一种解聚酶，在包括热休克在内的应激条件下起到重新折叠变性蛋白质的作用[37]。因此，在热应力条件下，Osh3可能会发生相变和聚集。因此，热诱导的Osh3-GFP结构没有与高尔基体室、内体、内质网或脂滴广泛共存（附加文件15：图S5a）。在额外的对照实验中，GFP在细胞质中广泛定位，在热休克时没有形成细胞内聚集物（附加文件15：图S5b）。

图5

热应力条件下，Osh3与Hsp104共定位。一表达Osh3-GFP（绿色）和Hsp104-mCherry（品红色）的细胞生长于26 °C（上面板）和10之后 最小值42 °C热冲击（下面板）。比例尺，5 微米。b条26岁时Osh3-GFP和Hsp104-mCherry共同定位的定量 °C和42 °C热冲击。图表显示了三个独立实验的平均值和标准偏差(t吨测试****第页<0.0001). 这些点表示单个图像帧的值（> 10个单元/帧）。分析的帧数：26 °C（摄氏度）n个 = 36, 42 °C（摄氏度）n个 = 36

我们进行了额外的体内试验来表征热诱导的Osh3穿孔的材料状态，以确定它们是相分离液滴还是稳定的蛋白质聚集体。一旦形成，热诱导的Osh3泪点是稳定的，并持续60多年 回到无应力温度（26 °C，图6a、 其他文件16：图6a数据集）。皮层Osh3组件重新出现90–120 转移到非应激温度后的min，与之前报道的芽殖酵母适应热应激和恢复极化生长的持续时间一致[15]。我们还进行了体内FRAP（光漂白后荧光恢复）实验，以表征热诱导Osh3结构的材料状态（图6b–d）。在FRAP分析过程中，相分离的液体冷凝液（液-液滴）倾向于进行动态交换并快速恢复，而稳定的蛋白质聚集体在FRAP实验中没有显示快速恢复率[38,39,40]。热诱导的Osh3-GFP点在光漂白后表现出非常温和的恢复（约为光漂白前水平的20%，图6c、 d，附加文件17：图6c数据集）。此外，在整个实验过程中观察到稳定的点状突起（20 最小值，图6d） 。因此，Osh3是一种热敏蛋白，在热应激条件下与解聚酶Hsp104聚集并共同定位。

图6

热应力条件下的Osh3骨料。一热应激后将Osh3-GFP恢复到质膜，并恢复到非应激状态。表达Osh3-GFP的指数生长野生型细胞在26 °C，切换至42 10°C min，允许在26时恢复 摄氏度。在指定的时间点收集图像。显示了每个时间点没有细胞溶质聚集物的细胞百分比（平均值> 两个独立实验的390个细胞/时间点）。比例尺，2 微米。b条热休克后形成的Osh3-GFP细胞内点的光漂白（FRAP）分析后荧光恢复示意图。黄色方框表示光漂白区域。c（c）短暂热冲击后形成的内部Osh3-GFP点状物的定量FRAP分析。两个独立实验得出的22点（ROI）的平均强度显示在光漂白之前（箭头）和之后（实心黑线）。显示标准偏差（虚线之间的灰色区域）。显示了流动和不流动部分。d日短暂热休克后形成的细胞内有Osh3-GFP斑点的时间推移图像。表达Osh3-GFP的细胞在26 °C并切换到42 10°C 分钟后放置在盖玻片上进行延时FRAP成像。在指定的时间点拍摄图像。黄色方框划定了光漂白的感兴趣区域（ROI），插图显示了一个× 3放大单个光漂白ROI（星号）。箭头所示为Osh3-GFP骨料的示例，该骨料未经光漂白，且在整个实验过程中保持稳定。比例尺，10 微米

令人惊讶的是，Osh3聚集并不需要Hsp104或Hsp42蛋白（附加文件18：Osh3定位数据集）与含Hsp104的Q体的形成有关[41]。热诱导的Osh3聚集也独立于许多应激激活因子发生（附加文件18：Osh3定位数据集），包括Rsp5 E3泛素连接酶活性和热反应蛋白激酶Pkc1和Tor2[15,17]。这让我们问Osh3蛋白本身的一些固有性质是否会触发热诱导聚集，然后我们研究了相关的Osh3蛋白质域。Osh3蛋白的一个显著特征是N末端的GOLD结构域（附加文件19：图S6）。金结构域足以进行热诱导聚集。在非应激条件下，GOLD-GFP融合蛋白在细胞质中广泛定位，但在短暂的热休克（42 摄氏度，10 最小值；其他文件19：图S6a）。然而，出乎意料的是，体内热诱导的Osh3聚集并不需要GOLD结构域。N端截断显示，C端PI4P结合ORD区域也足以进行热诱导聚集。在无压力条件下，作战需求文件^{Osh3号机组}-GFP融合蛋白广泛定位于细胞质和细胞核，但在42℃短暂热休克后形成胞内点状突起 °C（附加文件19：图S6b）。ORD域对温度特别敏感，因为ORD^{Osh3号机组}-GFP和全长Osh3-GFP形成聚集体，即使在短暂转变为37 °C（附加文件19：图S6b）。PI4P极化需要ORD域，因为GFP-P4C定位在表达Osh3截断形式的母细胞的PM处增加，即使在非应激条件下（附加文件19：图S6c）。因此，Osh3蛋白的PI4P结合ORD区域经历热诱导的聚集，并且是母细胞中PI4P调节所必需的。

与体内结果一致，纯化的Osh3 ORD区域（Osh3^588–996)在体外显示出热敏特性。NBD标记的Osh3^588–996蛋白质在42℃短暂孵育后形成点状和大纤维状结构 °C（图7a） ●●●●。这些结构在形状和尺寸上都不均匀，没有显示出相分离液-液滴预期的典型圆形（图。7a）[38,39,40]。然而，热诱导NBD标记的Osh3^588–996在FRAP实验中，结构显示部分恢复（流动分数30–35%；图7b–d和附加文件20：图7c数据集）。此外，有效的光漂白需要连续几轮的紫外线激发，并导致靶区外的荧光强度降低（图7d） 。这些结果表明，提纯的Osh3-ORD在高温下可以形成具有凝胶性质的聚合物。在沉淀分析中，纯化的Osh3^588–99626岁时出现在可溶性上清液部分 °C，但在42℃下短暂培养后可有效造粒 °C（附加文件21：图S7a和附加文件22：图S7a数据集）。同样，NBD标记为Osh3^588–996年26岁时出现在可溶性上清液部分 °C，但在42℃下短暂培养后可有效造粒 °C（附加文件21：图S7b）。因此，Osh3蛋白在体外表现出热敏感性，并在热应激时通过其GOLD和ORD域在体内聚集。有趣的是，其他Osh蛋白在体外表现出对热的敏感性。沉淀分析中，Osh4、Osh6和Osh7（主要由ORD域组成）主要存在于26 °C，但在42℃孵育时成丸 °C（附加文件21：图S7a和附加文件22：图S7a数据集）。因此，即使Osh7在体内热休克时显示皮质定位（图4e） ，Osh蛋白和Osh3可能在热休克时减弱。

图7

Osh3 PI4P结合ORD区域在体外形成凝聚物。一纯化NBD标记的Osh3^588–996拍摄于26岁 °C和42℃孵育后 摄氏度。温度升高时，NBD标记为Osh3^588–996聚集成可见的冷凝液。插图显示一个× 5 Osh3示例的放大倍数^588–996冷凝水。比例尺，10 微米。b条显示NBD标记的Osh3光漂白（FRAP）分析后荧光恢复的方案^588–99642℃孵育15分钟后形成的冷凝物 摄氏度。黄色方框标记了五个连续200 中景：光漂白轮。光漂白后，整个冷凝液的荧光强度降低（见图6d示例）。c（c）NBD标记的Osh3的定量FRAP分析^588–99642℃孵育后形成的冷凝物 摄氏度。来自两个独立实验的8种浓缩物的感兴趣区域（ROI）的平均强度显示在光漂白之前（箭头）和之后（实心黑线）。显示标准偏差（虚线之间的灰色区域）。显示了可移动和不可移动部分。d日NBD标记的Osh3^588–99642℃孵育后形成的冷凝物 将°C放置在盖玻片上进行延时FRAP成像。图像是在指定的时间点拍摄的。图片显示单个NBD标记为Osh3^588–996冷凝物和黄色分区划定了光漂白的感兴趣区域（ROI）。比例尺，2 微米

PI4P代谢控制外囊成分Exo70的定位

我们的研究结果表明，包括Osh3在内的Osh蛋白控制着PM处PI4P的分布。因此，我们研究了Stt4和Osh3在PM处蛋白质极化靶向中的作用。胞外囊亚基Exo70定位于极化生长的位点，包括芽尖和颈部，在那里它结合阴离子脂质，如PI（4，5）P₂也在极化生长的位置富集[24,25]。由于PI4P代谢影响PI（4,5）P₂代谢，PI4P定位的改变可能会影响PM的Exo70定位。与此一致，Stt4 PI4K生成的PI4P对于PM的Exo 70极化靶向是必要的。在Stt4 PI4K短暂失活后（在stt4（stt4）32岁时的突变细胞 10°C （min），Exo70-GFP不再仅在极化生长部位（芽尖和颈部）发现。相反，它也可以在母细胞的PM中观察到，并且在细胞质中更广泛地定位（附加文件23：图S8a）。

为了研究Osh3是否调节Exo70极化，我们检测了野生型对照细胞和职业安全与健康3∆突变细胞。众所周知，热休克会破坏极化分泌[15]42岁时发生短暂热休克 °C导致Exo70去极化定位。有趣的是，通过监测Exo70-GFP定位，缺乏Osh3的细胞表现出对热的超敏反应。在对照细胞中，Exo70-GFP在小乳细胞的顶端以及大乳细胞的芽颈处高度富集（图8a） ●●●●。大约75%的对照细胞表现出针对小乳房细胞尖端的极化Exo70-GFP，之后轻微转变为32 10°C 最小值（图8b和附加文件24：图8b数据集）。相反，Exo70-GFP定位在职业安全与健康3∆突变细胞（图8a） ●●●●。少于30%职业安全与健康3∆突变细胞表现出Exo70-GFP对芽尖的极化靶向性，轻度转移至32 °C（图8b和附加文件24：图8b数据集）。相反，在>中观察到皮层Exo70-GFP点 70%的母细胞缺乏Osh3。此外，即使在26℃的非应力生长温度下，当Osh3损失时，Exo70-GFP对极化生长位点的极化靶向也会受到损害 °C；只有50%职业安全与健康3∆细胞在26岁时表现出极化的Exo70靶向性，而对照细胞的靶向性为75% °C（附加文件23：图S8b-c和附加文件24：图S8c数据集）。

图8

Osh3调节外囊亚单位Exo70的极化定位和几丁质合成酶Chs3的极化分泌。一呈指数增长的野生型或职业安全与健康3从内源性启动子表达Exo70-GFP的∆细胞在32 10°C 分钟，然后放置在盖玻片上，通过旋转圆盘共焦显微镜进行成像。显示Exo70-GFP在野生型和职业安全与健康3∆提供突变细胞。箭头指向缺乏Osh3的母细胞中的非极化Exo70-GFP病灶(职业安全与健康3∆). 显示母（m）和子（d）细胞。比例尺，2 微米。b条10天后小乳房细胞Exo70-GFP极化的定量分析 32时最小值 摄氏度。分析的细胞总数：野生型10 最小值32 °C（摄氏度）n个 = 182,职业安全与健康3∆ 10 最小32 °C（摄氏度）n个 = 146.该图显示了三个独立实验（t检验、**第页<0.002).c（c）呈指数增长的野生型或职业安全与健康3从内源性启动子表达Chs3-GFP的∆细胞在32 10°C 在旋转圆盘共焦显微镜成像之前。显示野生型和osh3型∆提供突变细胞。箭头指向缺少Osh3的细胞中，Chs3-GFP皮质病灶从母婴颈部定位错误(osh3型∆). 显示母（m）和子（d）细胞。比例尺，2 微米。d日10天后指数生长细胞Chs3-GFP母婴颈部定位的定量分析 32时最小值 摄氏度。分析的细胞总数：野生型10 最小值32 °C（摄氏度）n个 = 75,职业安全与健康3∆ 10 最小值32 °C（摄氏度）n个 = 144.图表显示了三个独立实验（t检验**第页<0.002)

异常的Exo70极化表明，极化分泌可能在Osh3功能丧失后受损。为了解决这一问题，我们检测了极化分泌货运蛋白Chs3-GFP在野生型对照细胞和职业安全与健康3∆突变细胞。Chs3是一种几丁质合成酶，通过细胞周期和外源性囊依赖性传递到芽尖和芽颈区域[42,43]; 热应激导致Chs3分泌去极化[42]。通过监测Chs3-GFP PM分布评估，缺乏Osh3的细胞表现出对热的超敏反应。在野生型细胞中，Chs3-GFP PM靶向指定为芽尖和颈部（图8c和附加文件25：图8d数据集）。在显示PM-localized Chs3-GFP的野生型细胞中，大约80%的细胞显示出极化的Chs3-GWP靶向性，之后轻微转变为32 10°C 最小值（图8d和附加文件25：图8d数据集）。相比之下，Chs3-GFP PM定位不再局限于职业安全与健康3∆突变细胞（图8c） ●●●●。在显示PM-localized Chs3-GFP的突变细胞中，只有不到50%的细胞表现出极化的Chs3-GWP靶向性，轻微转变为32 °C（图8d和附加文件25：图8d数据集）。或者，Chs3-GFP的异常放大可能是由于内吞作用受损[43,44]，但是职业安全与健康3∆突变细胞没有显示出强烈的内吞缺陷[45]。与极化分泌缺陷一致，在缺乏Osh3蛋白的母细胞中也观察到去极化芽痕（钙氟白色染色的细胞间隔/分裂富含甲壳素的部位）（附加文件23：图S8d）。因此，PI4P、外囊成分Exo70、分泌性载脂蛋白Chs3和几丁质沉积物的极化分布在职业安全与健康3∆突变细胞。总之，这些结果表明，PI4P代谢控制了PM分泌事件的极化靶向，缺乏Osh3的细胞对轻度热应激反应过度，导致分泌去极化。

讨论

磷酰肌醇代谢控制极化细胞生长

PI4P在快速生长的小乳酵母细胞的质膜中富集（G1/S/G2期间）（图1). 同样，PI（4,5）P₂在酵母的极化生长部位（初芽部位、“shmoo”尖端和分裂沟）也富集[24]。PI4P和PI（4,5）P如何₂梯度的建立尚不清楚。令人惊讶的是，在PM处合成PI4P的Stt4 PI4K主要在母细胞中发现，而在PI4P富集的小芽生子细胞中并不明显[9,10]（图1和2). 如果母体细胞产生的PI4P池迅速翻转，则可以解释Stt4 PI4K及其产物PI4P分布的这种矛盾差异。与这一概念一致，Stt4 PIK贴片广泛定位于PM的区域，靠近含有PI4P磷酸酶Sac1的皮层ER（图2和其他文件8：图S3）。

我们的数据表明，Stt4的分布是通过PIK贴片组分Efr3和ER定位的VAP直向同源物Scs2/22之间的相互作用介导的。Scs2/22蛋白的缺失不会破坏PM处Stt4-PIK补丁的形成，但会损害PIK补丁ER的关联（附加文件4：图S2）。因此，Efr3中FFAT基序的缺失减少了与Scs2的相互作用（图三). 据我们所知，我们的研究首次证明了一种PI4K，即酵母PI4KIIIα同源序列Stt4，存在于ER-PM接触物中。目前尚不清楚哺乳动物PI4KIIIα是否定位于ER-PM接触，但调节PI4KIIIIα活性的磷脂酰肌醇转移蛋白在ER-PM联系中的功能[46,47,48]。PI4P周转也依赖于ER-localized Scs2/22蛋白和Sac1磷酸酶[16,19,49]。因此，PI4P的合成和转换可能发生在ER-PM接触处。最近的一项研究表明，在HeLa细胞中，Sac1在ER-PM接触时不富集[50]。然而，VAP亚型被认为对HeLa细胞ER-PM接触形成没有显著作用[51]。我们的研究结果和先前的工作表明，（i）Scs2/22 VAP直向同源物对皮层ER的形成至关重要，（ii）Sac1磷酸酶存在于皮层ER中，以及（iii）Sac1与出芽酵母细胞中皮层ER中的Scs2结合（附加文件8：图S3）[16,32]。因此，来自HeLa细胞的发现可能并不普遍适用于所有细胞类型的ER-PM接触。

将PI4KIIIα放置在ER-PM连接处并不一定意味着PI4P的合成和降解在ER-PM接触处发生无效循环。相反，Stt4 PI4K在ER-PM接触点的定位可以提供PI4P在这些细胞结构中的调节和功能的见解（图9a） ●●●●。Scs2/22 VAP蛋白结合Osh2和Osh3蛋白并将其募集到ER-PM接触[19,35]。Osh2和Osh3是ORP脂质交换蛋白家族的成员，拟将新合成的脂质从内质网输送至质膜，以交换PI4P（见图2a） ●●●●。Osh2和Osh3蛋白是否在体内内质网和质膜之间传递脂质尚待确定，但Osh3在体外可以结合PI4P[36]并通过Sac1磷酸酶体外刺激PI4P水解[19]。通过在ER-PM接触点定位PI4-激酶和PI4P磷酸酶活性，Osh2和Osh3蛋白可能能够在单个位点执行多轮非囊泡性脂质交换反应，并且这样做还可以控制PI4P水平和在PM的分布。

图9

极化生长与应力条件下PI4P调节的推测模型。一在正常生长条件下，PM-PI4P通过Stt4-PIK贴片的产生和Sac1的Osh蛋白介导的周转在ER-PM接触部位的母细胞中进行调节。Osh3介导的PI4P代谢也可能与PM处未知脂质的交换相耦合，Osh3功能也可能发生在ER-PM接触之外。生长中的子细胞在下午的PI4P水平高于母细胞，这可能是因为新形成的子细胞中缺乏已建立的皮层ER网络。因此，PI4P-和PI（4,5）P₂-受监管的囊泡贩运直接针对生长中的子细胞。Osh蛋白介导的非囊泡脂质交换可能控制母细胞质膜的维持[52].b条在热应激条件下，Osh3在ER-PM接触处的定位和功能受到损害，因为Osh3形成了胞质内聚集体。Osh3-介导的PI4P周转减少导致PI4P增加，可能还有PI（4,5）P增加₂在母细胞中PM处的信号。PI4P和PI（4,5）P损失₂PM处的极化会触发各向同性（非极化）分泌，以及维持PM完整性所需的额外应力响应

重要的是，PI4P可能在膜脂动力学中起到至少两个重要作用：非囊泡脂质交换和囊泡转运。在具有广泛皮层ER网络的母细胞中[31]，PI4P可能在Osh介导的脂质交换过程中被消耗。PI4P与另一种脂质的非囊性交换不会导致PM处的净脂质增加，也可能不会直接推动膜的快速膨胀。然而，PI4P交换反应可能对正确的PM脂质组成和组织至关重要，以确保母体细胞中PM的完整性[17,52]而极化的囊泡运输直接指向生长芽（G1/S/G2期间）[53]。Osh介导的交换反应也可以确保PI4P在母细胞中保持较低水平，从而导致PI4P的极化分布在母子细胞之间。据估计，近90%的Stt4生成的PI4P被Sac1磷酸酶快速消耗[49]; PI4P的大部分转换可能通过Osh介导的反应发生在母细胞中。

相反，PI4P在快速生长的子细胞的PM中很容易获得。PI4P可与PI（4,5）P一起用作空间地标₂以及其他用于靶向极性因子的阴离子脂质，包括Rho家族小GTPases、与其相关的鸟嘌呤核苷酸交换因子以及决定分泌囊泡极化靶向位点的胞外亚单位[9,23,25,54]。与这一观点一致，PI4P和PI（4,5）P₂足以将多基蛋白靶向哺乳动物细胞中的PM[1]。当ER在新形成的子细胞中遗传时，分泌小泡的极化运输继续进行，并驱动PM在生长芽中膨胀，直到G2/M晚期，此时子细胞建立了广泛的皮层ER网络，并从极化生长转变为各向同性生长[31,53]。缺乏广泛的皮层ER网络（和Sac1磷酸酶）可能解释了PI4P是如何在萌芽的子细胞中积累的，这些子细胞似乎没有Stt4 PIK贴片，甚至含有皮层Osh3组装体。母体细胞和子体细胞之间的其他区别可能允许Osh介导的PI4P在母体细胞中调节，但不允许子体细胞。在另一个推测模型中，Osh3可能从母细胞或运输囊泡的颗粒物中提取PI4P，然后将PI4P沉积在子细胞中无ERF的颗粒物区域。

简单地说，PM可被视为与ER相关且无ER。非囊膜脂质交换可能发生在与ER相关的PM区（主要发生在母细胞中），而囊膜转运事件发生在无ER的PM区中（即极化分泌转运到生长芽）（图9a） ●●●●。ER-PM触点被提议作为防止胞吐的物理屏障[55]。这是合理的，因为ER-PM触点紧密相连（10–30 纳米间距），可能无法容纳分泌囊泡（50–100 直径为nm）。然而，少于50%的PM与芽殖酵母中的ER相关，皮层ER网络不断重组[17]。在包括HeLa在内的一些哺乳动物组织培养细胞中，只有2%的PM与ER相关[56]目前尚不清楚内质网如何作为有效的屏障来阻止小泡在PM处的对接和融合。

我们认为ORP/Osh家族成员对PI4P代谢和分布的控制可能与其他因素一起调节胞吐发生的部位。热休克后，芽殖酵母细胞迅速停止向子细胞的极化分泌，并在母子细胞之间转向各向同性运输[15]。这与母细胞中PI4P可用性的快速增加相一致（图1和其他文件1：图S1），可能用于热诱导PI（4,5）P₂合成[9]。Stt4 PI4K在热休克时仍与ER相关（附加文件11：图S4）。相反，Osh3皮层定位降低（图4和5)这表明Osh3的衰减有助于在母细胞中产生PI4P信号。为了支持这一点，Osh3的缺失增加了PI4P的可用性和母细胞中Exo70的定位（图4和8，附加文件23：图S8）。

哺乳动物细胞也可能有类似的调节机制。ORP5和ORP8的消耗导致PI4P和PI（4,5）P增加₂水平[11,14,57,58]。最近的一项研究[58]表明ORP5/8活性根据PI（4,5）P的变化进行调节₂水平。根据PI（4,5）P₂消耗，例如通过Ca²⁺-调节磷脂酶C活性[59,60]ORP5皮质定位丢失，可能是因为ORP5 PH结构域和PI（4,5）P之间的相互作用减少₂在下午[58]。ORP5/8活性的瞬时丧失导致PI（4,5）P的PI4P快速增加₂重新合成以维持PI（4,5）P₂平衡。研究哺乳动物ORP家族成员是否被减弱以产生PI4P和PI（4,5）P将是一件有趣的事情₂对触发调节性胞吐的生理刺激作出反应的信号。

Osh3蛋白质经历热诱导相变

PI4P代谢的控制可确保细胞内稳态，并调节对细胞外刺激的反应，例如环境条件的变化。我们发现Osh3在热冲击下发生相变。这可能有助于在这些条件下，PI4P在PM处快速累积（图9b） ●●●●。热休克后，Osh3从皮层集合转移到含有Hsp104解聚酶的胞质内聚集体（图5a） ●●●●。然而，并不是所有的Hsp104点都含有Osh3，这表明Osh3可能形成一个独特的热敏聚集体子集（图5b） ●●●●。已知越来越多的蛋白质在包括热应激和营养缺乏在内的各种应激条件下会经历相分离和转变（例如液-液相分离、可逆凝胶聚合和聚集）。在芽殖酵母中，这些蛋白包括长时间接触信息素后的Whi3蛋白、AMPK/Snf1调节器Std1对碳源的反应以及葡萄糖饥饿时的Sup35蛋白[61,62,63]。另一项最近的研究发现，Pub1蛋白在不同的应激条件下以不同的状态存在[40]。Pub1在pH值下降时形成可逆的凝胶状冷凝液，并在温度升高时进一步转化为固态聚集体。因此，越来越清楚的是，蛋白质相分离和蛋白质聚集在细胞应激反应中具有重要的生理作用[64].

Osh3蛋白似乎不包含朊蛋白样结构域或谷氨酰胺富集区等影响蛋白质聚集的特征。然而，它确实具有不同的电荷域，可能使其对温度和pH值的变化敏感[40,61]。N端GOLD和C端ORD区域非常基本（pI = 分别为9.5和9.1），而跨越FFAT基序的区域带负电荷（pI = 3.6). 在非应激条件下，PH和螺旋结构域的pI值接近生理细胞溶质PH值（pI = 分别为7.1和7.2）。重要的是，细胞溶质pH值在热休克后随着PMH的升高而降低⁺-ATP酶Pma1是一种热敏蛋白，Pma1抑制剂Hsp30是由热诱导的[26,65]。热休克后细胞溶质pH值的降低可能通过负电荷FFAT区域与正电荷GOLD和ORD区域之间的分子间静电相互作用诱导Osh3聚集（随着细胞质pH值下降，pH和HD区域也将带正电荷）。或者，参与多价相互作用的蛋白质，如Osh3，在环境条件变化时可能容易发生相分离[66]。因此，Osh3聚集可通过与热应激条件下聚集的其他蛋白质的相互作用来促进。奇怪的是，我们的发现表明，在体外温度升高时，Osh3 ORD区域单独可能形成凝胶状缩合物。然而，在热应激条件下，全长Osh3蛋白似乎在体内形成固态聚集体。由于热量也会导致细胞溶质pH值下降，全长Osh3可能会从凝胶状浓缩物快速转化为固体状稳定聚集体，这可能解释了体外和体内Osh3物质状态的差异。根据不同的细胞和环境条件，Osh3可能会发生相变，并具有不同的材料性质（可逆的凝胶状聚合物和稳定的固体状聚集体）。研究ORP/Osh蛋白的相变是否调节额外的脂质信号和膜转运程序，以响应生理和环境条件的各种变化，这将是非常重要的。

结论

我们的结果表明PI4P代谢是控制极化分泌的关键决定因素。重要的是，PI4P的分布可以在质膜上快速调节，以响应环境条件的变化，根据需要直接极化分泌。此外，我们发现PI4P的极化和有效性可能受到一种有趣的生物物理机制的调节，该机制涉及PI4P调节蛋白的热诱导相变。

方法

酵母菌株、质粒、培养基和生长分析

本研究中使用的菌株和质粒的描述见附加文件26：表1和附加文件27：表2。通过同源重组将基因缺失、截短和表位标签引入酵母[67,68]。pRS矢量序列已经在前面描述过[69]。对质粒进行测序，以确保没有因操作而引入突变。标准技术和培养基用于酵母和细菌生长。

活酵母细胞成像

在指定温度下，对合成培养基中的中对数酵母培养物进行荧光显微镜实验。图的图像2c、 其他文件4：图S2c和附加文件11：图S4a是使用配备IX71奥林巴斯显微镜、PlanApo 100X物镜（1.35 NA，奥林巴斯）、DAPI、FITC和罗丹明滤光片以及Cool Snap HQ数码相机（光度计）的DeltaVision RT显微镜系统（Applied Precision）获得的。使用soft-WoRx 3.5.0软件（Applied Precision，LLC）对图像进行去卷积。图像的亮度和对比度被线性调整，并在Photoshop（Adobe）中裁剪以供演示。

所有其他成像数据都是用PerkinElmer Ultraview Vox旋转盘共焦显微镜采集的，该显微镜由连接到横河CSU-X1旋转盘扫描头的Nikon TiE倒置支架、Hamamatsu C9100-13 EMCCD相机、Prior NanoscanZ压电聚焦和Nikon Perfect focus System（PFS）组成。为了测量热休克前后同一细胞中PM PI4P的强度，将表达GFP-P4C的细胞固定在含有培养基和2%琼脂糖的琼脂糖垫上。随后使用BIOPTECHS目标加热器系统（控制器+加热圈）在原位热休克期间通过显微镜观察细胞。对于脂滴可视化，0.1 将mM MDH（单丹酰戊烷，Abgent）添加到中对数细胞培养物中。15之后 在室温下，用PBS清洗细胞一次。在芽痕处几丁质染色，0.05%(w个:v（v）)将钙荧光白（荧光增白剂28，Sigma）添加到中对数细胞培养物中。15之后 在室温下min，用PBS清洗细胞一次。实验中观察到的细胞数量在图和图例中报告。未经调整的原始数据用于高含量的定量分析。图像的亮度和对比度被线性调整，并在Photoshop（Adobe）中裁剪以供演示。

定量图像分析

使用斐济进行定量图像分析[70]。测量母子细胞PM处的PI4P强度（图1和其他文件1：图S1），表达GFP-P4C和PM标记物mCherry-2xPH的细胞^PLCγ26岁时被分析 °C和10之后 42时的最小热冲击 摄氏度。使用斐济，绘制了穿过细胞的线条，并绘制了相应的荧光强度曲线。两个最高的GFP-P4C强度值与mCherry-2xPH一致^PLCγ取母细胞和子细胞的信号峰平均值，并用于计算每个细胞的Fd/Fm比值。

通过高含量成像确定Stt4-ER相关性（图2d） ，使用Find Maxima工具在斐济应用适当的噪声容限设置来确定兴趣点。选择识别出的GFP信号最大值，并测量每个GFP最大值的DsRed-HDEL（ER）信号强度。为了确定GFP最大值的内质网相关性，使用阈值工具确定整个内质网中DsRed-HDEL信号强度的范围，为DsRed-HDEL（ER）信号定义一个最小阈值。同样，确定了无雌激素受体区域的最大背景DsRed-HDEL。总之，这些测量值设置了一个二进制阈值，将单个GFP最大值指定为与ER相关或缺少ER。

拆分GFP[71]使用斐济，利用共表达DsRed-HDEL（ER标记，图三a、 b）或mCherry-2xPH PLC（PM标记，图三c、 d）选择感兴趣的地区。Osh3-GFP信号强度（GFP荧光强度）使用Fiji测量，利用共表达的mCherry-2xPH^PLCδ（PM标记）选择感兴趣的区域。量化Osh3-GFP和Hsp104-mCherry在26 °C和10之后 42时的最小热冲击 °C，使用斐济确定GFP荧光（高于设定阈值）与mCherry信号重叠的像素面积百分比（高于设定的阈值），反之亦然。

FRAP分析

使用具有光动力单元的Ultraview Vox旋转圆盘共聚焦显微镜和具有FRAP模块的Volocity 6.3软件（Perkin Elmer，Seer Green，Beaconsfield，HP9 2FX）进行光漂白实验。体内Osh3-GFP组件使用488-nm激光以100%强度漂白5个斑点周期，斑点周期为50 ms.体外NBD-标记的Osh3^588–996年冷凝液在200℃下漂白5次 ms。漂白区域的位置使用Spot工具定义，并与延时数据一起保存为FRAP模板。模板在斐济开放[70]应用阈值将漂白区域从背景中分离出来，并转换为二进制。模板中定义的区域是单像素位置，但激光漂白的区域大于单个像素，因此为了减少噪声对测量的影响，将区域扩大到5个 × 5像素，然后转换为斐济ROI。延时数据是在斐济开放的，通过减去平均超过100帧的背景图像来校正相机偏差和照明不均匀性，以减少噪音。然后应用ROI，并测量每个区域的平均强度延时数据。通过将荧光的未漂白区域归一化，对延时期间偶然发生的光漂白的漂白区域强度值进行校正。

重组蛋白的表达与纯化

使用细菌表达载体pGEX6P-1（GE healthcare）表达GST-Osh3^588–996和GST-Osh6重组融合蛋白。使用细菌表达载体pRSETB生成his-Osh4和his-Osh 7重组融合蛋白。大肠杆菌菌株BL21或Rosetta pLysS被用作宿主细胞系。用0.25诱导重组蛋白的表达 22时为mM IPTG 摄氏度。收集细胞颗粒并将其重新悬浮在冰镇均质缓冲液（50 mM Tris-HCl pH值 6.8, 300 mM氯化钠，1 mM二硫苏糖醇（DTT），0.1 mM AEBSF和完整的无EDTA蛋白酶抑制剂）。然后在冰镇均质缓冲液中通过超声波破碎细胞。均质细胞在20800×克对于30 用谷胱甘肽-Sepharose纯化GST重组蛋白。GST与Osh3分离^588–996年和Osh6蛋白 U/μl PreScission蛋白酶。用镍-IMAC树脂纯化His-tagged重组蛋白。用透析缓冲液（50 mM Tris-HCl pH值 6.8, 150 mM NaCl和1 mM DTT）三次，然后用存储缓冲液（50 mM Tris-HCl pH值 6.8150个 mM氯化钠，2 mM DTT和50%甘油）并储存在− 80 分析前温度为°C。蛋白质浓度通过Bradford试验（BioRad）测定。

蛋白质沉淀分析

蛋白质沉淀分析（附加文件21：图S7），提纯的Osh3^588–996、his-Osh4、Osh6、his-O sh7或标有Osh3的NBD^588–996（见下文）在指示温度和pH值下培养10 分钟，在50000下离心 20转/分 25时最小 摄氏度。将所得上清液和颗粒组分制备用于SDS-PAGE分析和考马斯染色以检测重组蛋白。扫描凝胶，并使用斐济测定颗粒（结合）和上清液（未结合）组分中融合蛋白的相对数量[70].

Osh3 ORD蛋白的NBD标记

净化Osh3^588–996蛋白质用50 mM PBS pH值6.8150 mM NaCl和50%甘油过夜，然后添加IANBD酰胺(N个,N个′-二甲基-N个-（碘乙酰）-N个′-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）乙二胺）（Thermo Fisher），最终染料与蛋白质的比例为10:1（mol:mol）。允许反应进行2次 室温下h，通过透析淬火至50 mM Tris-HCl pH值 6.8, 150 mM NaCl和0.1%β-巯基乙醇。NBD标记的Osh3^588–996存储在4 分析前为°C。

纯化Osh3 ORD聚集体的荧光显微镜

为了生成图中的热致冷凝物7，NBD标记为Osh3^588–996年稀释至10 50μM mM Tris-HCl pH 6.8150 mM NaCl并在26 °C或42 15°C min。然后立即将体外组装物转移到玻璃载玻片上，使用PerkinElmer Ultraview Vox旋转圆盘共焦显微镜进行成像。