miR-182-5p在小鼠三氯乙烯肝癌发生中的作用

三氯乙烯（TCE）是一种常用的工业溶剂，广泛存在于我们的生活环境中。TCE暴露可诱导小鼠肝细胞癌（HCC），但其潜在机制尚不明确。为了了解miRNA在TCE肝癌发生中的作用，我们通过微阵列检测了暴露于0或1000 mg/kg体重的TCE的B6C3F1雄性小鼠肝脏中的miRNA表达谱。共鉴定出9种差异表达的miRNA，其中miR-182-5p的表达量增加最多。此外，TCE诱导小鼠肝脏miR182-5p上调是剂量依赖性的，并与启动子DNA低甲基化相关。用无毒剂量（0.1和/或0.3 mM）的TCE处理小鼠肝细胞系（BNL CL.2和Hepa1-6）显著增加miR-182-5p的表达水平，同时细胞增殖增加。进一步发现TCE诱导的细胞增殖是由miR-182-5p过度表达介导的。此外，在TCE暴露的小鼠肝细胞中下调的肿瘤抑制基因Cited2被证明是miR-182-5p的直接靶点。综上所述，TCE可能通过DNA低甲基化上调miR-182-5p的表达，从而抑制Cited2，提高细胞增殖率，从而导致肝癌。

三氯乙烯（TCE）是一种挥发性有机化学试剂，广泛用作工业有机溶剂，是空气、土壤、地下水和食品的常见污染物(环境保护局，2012年;Rusyn公司等。2014年). 由于肝脏是TCE的主要靶器官之一，职业工人经常报告TCE引起的肝脏损伤，TCE暴露被怀疑与肝癌风险增加有关（EPA，2012；汉森等。, 2013). 在动物研究中，TCE治疗可诱导小鼠肝癌（HCC），但其机制尚不清楚(布拉德福德等。, 2011;Rusyn公司等。2014年;萨诺等。, 2009).

2012年，国际癌症研究机构（IARC）将TCE归类为人类致癌物（I类），主要基于职业接触与肾癌之间的密切联系(古哈等。, 2012;金等。2014年). TCE通过p450氧化和GSH结合代谢途径代谢。S-（1,2-二氯乙烯基）-我-半胱氨酸（DCVC）是一种由谷胱甘肽结合产生的诱变代谢产物，被认为是TCE诱导的肾癌，尤其是VHL突变的原因(Caldwell和Keshava，2006年). 然而，氧化反应产生的主要肝脏代谢产物三氯乙酸（TCA）似乎是非突变的，这与TCE诱导的小鼠肝肿瘤中Ras基因的负突变一致（EPA，2012）。另一方面，在TCE暴露小鼠的肝脏中发现了异常的DNA甲基化，这表明表观遗传改变可能在TCE肝癌发生中起重要作用(江等。2014年;道等。, 1999,2000).

与DNA甲基化类似，miRNA调控也是一种研究得很好的表观遗传修饰。miRNAs是一组由19–22个核苷酸组成的调节性RNAs，通过与靶mRNAs的3′非翻译区（UTR）结合来抑制蛋白质翻译(Hudder和Novak，2008年). 大量研究表明，miRNAs可以参与调节各种重要的生物过程，如细胞增殖、凋亡和细胞分化(伊努伊等。, 2010;Lema和Cunningham，2010年). miRNA也参与了HCC的发展，在临床HCC样本中经常发现异常的miRNA表达谱(梁等。, 2013;Morishita和Masaki，2015年;太阳等。, 2013). 此外，许多miRNA已被用作肝癌诊断和治疗的生物标记物(查拉等。, 2015;片山等。, 2012;太阳等。, 2013).

本研究的目的是为miRNA在TCE肝癌发生中的作用提供表观遗传学证据。我们首先检测了TCE暴露小鼠肝脏中miRNA的表达谱，然后验证了TCE处理小鼠肝细胞系中miR-182-5p的上调。我们进一步发现，DNA低甲基化可能与TCE诱导的miR-182-5p过度表达有关，后者直接抑制Cited2表达并促进细胞增殖。

材料和方法

化学制品

三氯乙烯（CAS 79-01-6，纯度≥99.5%）购自Adamas-beta（中国上海）。5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza）和TSA分别来自Solarbio（中国北京）和Cell Signaling Technology（丹佛）。将所有3种化学物质都溶解在二甲基亚砜中。除另有说明外，其他化学品均购自西格玛-奥尔德里奇（密苏里州圣路易斯）或赛默科技（中国上海）。

动物实验

动物程序由苏州大学动物护理机构/用户道德委员会（中国苏州）批准。以前曾描述过动物护理和治疗(江等。2014年). 简言之，6周龄的B6C3F1雄性小鼠取自南京大学（中国南京）模型动物研究中心，在22±2°C的温度下进行12小时光照和12小时黑暗循环。检疫1周后，20只雄性小鼠被随机分为4组。小鼠在玉米油中口服100、500和1000 mg/kg体重的TCE，持续5天。每次给药前，将TCE新鲜溶解在玉米油中，以防止蒸汽释放。对照组小鼠同样服用0.2毫升玉米油。根据之前对小鼠进行的为期两年的TCE致癌性研究，我们选择1000 mg/kg体重作为最高剂量水平(1990年国家毒理学计划). 最后一次治疗大约100分钟后，将小鼠处死，将肝脏在液氮中快速冷冻并储存在−80°C下。

细胞培养和治疗

小鼠胚胎肝细胞系BNL CL.2、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肺癌细胞系A549来自中国科学院类型培养收集委员会（中国上海）。将细胞保存在37°C、5%CO、补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素溶液（100 U/ml，旋风）的Dulbecco最小必需培养基（DMEM）中₂大气。对于TCE治疗，细胞与含有不同剂量（0–10 mM）TCE的DMEM培养基孵育48小时(商行等。, 2013). 对于5-Aza和TSA处理，细胞在没有或存在5-Aza（5μM）的情况下培养3天，仅在最后24小时内添加TSA（300 nM）(乔瓦德等。, 2010;Noguer舞蹈等。, 2010;杨等。, 2013).

DNA、RNA和蛋白质提取

使用TIANprep DNA/RNA/蛋白质分离试剂盒（中国北京天根）提取基因组DNA、RNA和蛋白质。总RNA用TRNzol-A+试剂（天根）分离。通过NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）测量分离的DNA和RNA的浓度和纯度。蛋白质浓度通过BCA测定试剂盒（中国Beyotime）进行量化。

微阵列分析

使用Affymetrix基因芯片miRNA 3.0检测microRNA表达谱。按照制造商的标准方案进行样品标记、微阵列杂交和清洗。使用安捷伦扫描仪G2505C（安捷伦科技公司）获取阵列图像，然后通过特征提取软件（安捷伦科技公司10.7.1.1版）进行分析，以获取原始数据。Genersping软件（12.5版；安捷伦科技）用于进行数据分析。通过折叠变化以及P（P）使用计算的值t吨-测试。只有折叠变化≥2.0且aP（P）值≤.05。基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析用于分析差异表达miRNAs的作用。基于3个数据库（Targetscan、PITA、microRNAorg）的交叉预测差异表达miRNA的靶基因。使用DAVID分析GO和KEGG途径的富集(https://david.ncifcrf.gov网址). 微阵列数据保存在国家生物技术信息中心基因表达总览室（登录号：GSE85904）。

定量RT-PCR

Turbo不含DNA^TM（TM）试剂盒用于去除基因组DNA污染。为了表达miRNA，使用miRACLE cDNA合成试剂盒（Genetimes Technology，中国上海）合成第一链cDNA。对于mRNA表达，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒转录cDNA。使用SYBR选定的主混合液，在ABI Prism 7500系统（福斯特市应用生物系统公司）上进行定量PCR（qPCR）。至于内部对照，使用U6小核RNA作为miRNA；mRNA使用GAPDH和Ldha。miRNA引物来自Genetimes Technology Inc.。mRNA引物列于表1使用比较阈值循环（Ct）方法计算折叠变化（2^{−△△计算机断层扫描}). 实验重复至少3次。

亚硫酸氢盐测序（BSP）

根据制造商的指示，使用EZ DNA甲基化金试剂盒（加利福尼亚州奥兰治市的Zymo Research）对每个小鼠肝脏样本的基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。使用的引物列于表1将3个对照或TCE处理样品的PCR产物合并并克隆到pGM-T载体（天根）中。从每个平板中，使用自动测序仪（ABI 3730XL）对通过蓝白筛选选择的至少10个阳性克隆进行DNA测序。

MTT分析、菌落形成分析和EdU标记

用不同剂量的二甲基亚砜或三氯乙烯处理接种在96个平板中的细胞48小时。根据制造商的方案，通过MTT分析（中国武汉博斯特）和EdU标记（中国广州利波比奥）检测细胞增殖。在克隆形成试验中，将细胞重新放置在6孔板中并培养2周。然后，用卡诺伊液固定细胞，并用0.4%结晶紫染色5分钟。菌落数量由Gene Box（英国Syngene）统计。

彗星试验

细胞接种在6孔板中并培养过夜。在暴露于不同剂量的TCE 48小时后，收集细胞。紫外线照射20分钟的细胞作为阳性对照细胞。与0.8%低熔点琼脂糖混合后，将细胞悬液铺在磨砂载玻片上，该载玻片在PBS中预先涂有1%的正常熔点琼脂。将载玻片置于4°C下20分钟，然后将其放入装有裂解缓冲液（2.5 M NaCl，0.1 M Na）的圆筒中₂-EDTA、0.01 M Tris、1%SDS、1%Triton-100和10%DMSO，调节至pH 10.0），在黑暗中4°C下90分钟。将载玻片放入装有新鲜电泳液（300 mM NaOH、1 mM Na）的水平电泳槽中₂-EDTA）用于DNA解旋。30分钟后，在冰水浴中以25 V的电压进行电泳30分钟。然后，用低温Tris–HCl（pH 7.5）清洗载玻片3次，并用50μl吖啶橙溶液（1 mg/ml）染色。通过荧光显微镜（Leica，Germany）拍摄照片，并使用CASP软件量化DNA损伤。

流式细胞术检测细胞凋亡

根据制造商的方案，使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（中国佳美生物科技公司）检测细胞凋亡。在FC500流式细胞术（Becton Dickinson）上，每个样本至少收集了10000个事件。

miRNA转染

miR-182-5p抑制剂、模拟物和阴性对照由上海综合生物技术解决方案有限公司（中国上海）合成。使用转染试剂Entranster进行转染^TM（TM）-R4000（Engreen Biosystems，中国北京），根据制造商的说明。转染48小时后，收集细胞进行mRNA和蛋白表达检测。

蛋白质印迹

样品经过10%SDS–PAGE凝胶处理，然后转移到PVDF膜（德国达姆施塔特默克百万孔）。将膜立即浸入含0.1%吐温-20的TBS中5%的BSA中2 h，然后在4℃下过夜，用抗Cited2（Proteintech，中国武汉）和β-actin（BBI，中国上海）的一级抗体进行探测。洗涤后，用HRP结合的二级抗兔抗体标记斑点。使用增强化学发光+再生剂开发蛋白质，并使用基因工具量化表达水平（英国剑桥Syngene）。

萤光素酶报告基因测定

根据制造商的说明，将Cited2 mRNA的3′-UTR中miR-182-5p的结合位点克隆到pEZX-MT01 miTarget报告载体（Rockville的GeneCopoeia）中。使用基于PCR的重叠延伸方法生成突变结合位点(Sambrook和Russell，2006年). 使用的引物列于表1A549细胞随后与含有野生型/突变的Cited2 3′-UTR和阴性对照模拟物/miR-182-5p模拟物的载体联合转染，用于荧光素酶分析。在转染48小时后收集总RNA和蛋白质，并根据制造商的说明使用Luc-Pair miR荧光素酶检测系统（GeneCopoeia）进行分析。

统计分析

所有图中的误差条表示标准偏差。使用的统计方法是Student的t吨-测试，单向方差分析，然后是Tukey或Dunnett的多重比较测试。A类P（P）数值<.05被认为是显著的。

结果

TCE治疗小鼠肝脏miRNA-182-5p表达上调

miR-182-5p过度表达介导TCE诱导的肝细胞增殖

此外，克隆形成试验表明，TCE处理提高了BNL CL.2（0.3 mM）和Hepa1-6（0.1 mM）细胞系的长期存活能力(补充图2). 相比之下，仅在高剂量（10 mM）TCE暴露的细胞中检测到DNA损伤，且治疗未发现明显的细胞凋亡(补充图3和4).

启动子DNA低甲基化与TCE诱导的miR-182-5p过度表达

肿瘤抑制基因Cited2是miR-182-5p的直接靶点

在蛋白质水平上，所有TCE处理的小鼠肝脏样本中Cited2下调(图4C). 我们进一步发现，TCE诱导的小鼠肝细胞BNL CL.2中Cited2蛋白表达水平的下调被miR-182-5p抑制剂终止(图4D). 荧光素酶报告子分析显示，在转染野生型Cited2报告子的A549细胞中，miR-182-5p模拟物显著降低了荧光素酶的活性，预测的miR-182.5p结合位点的突变完全恢复了荧光素素酶的表达，如图4E和F.

讨论

表观遗传机制被认为与TCE肝癌的发生有关（EPA，2012）。据报道，TCE诱导的小鼠肝脏或肝脏细胞系DNA甲基化的改变(江等。2014年;道等。, 1999,2000;张等。2014年). 在本研究中，我们发现TCE可以诱导小鼠肝脏中miRNA表达的变化。在9个调制的miRNAs中，miR-182-5p和miR-183-5p是miR-183家族的2个成员，在TCE治疗后明显过度表达。在TCE暴露的小鼠肝细胞系中进一步证实miR-182-5p的上调。MiR-182-5p是一种致癌miRNA，据报道在包括肝癌在内的多种肿瘤中过度表达(蒋介石等。, 2013;线路接口单元等。, 2012;王等。2014年). 此外，已发现HCC患者血清miR-182上调，表明该miRNA具有作为诊断和预后标志物的潜力(陈等。, 2015).

DNA甲基化可以调节人类黑色素瘤细胞中miR-182-5p的表达水平(刘等。, 2013). 在这项研究中，miR-182-5p的启动子区域在TCE暴露小鼠的肝脏中被低甲基化并过度表达。作为预测的miR-182-5 p靶基因中的2个，DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3 b在TCE接触小鼠的肝中被下调(江等。2014年). 另一方面，据报道，miR-182模拟物可抑制人类宫颈癌细胞系中DNMT3a的表达(太阳等。, 2015). 因此，TCE诱导的miR-182-5p过度表达可能会抑制Dnmt3a和/或Dnmt2b，从而导致miR-182-5 p启动子区域的DNA低甲基化。

我们的结果表明，TCE可以促进小鼠肝细胞系的细胞增殖和集落形成。此外，miR-182-5p抑制剂使暴露于TCE的小鼠肝细胞的增长率下降，表明miR-182-5 p介导了TCE诱导的细胞增殖。相反，非细胞毒性剂量水平的TCE并未在2个小鼠肝细胞系中诱导可检测到的凋亡和DNA损伤。细胞增殖作为肿瘤发展的一个必要阶段，可能通过增加自发突变或促进自发启动的细胞来促进肿瘤的形成(费特尔森等。, 2015). 据报道，经TCE治疗的小鼠肝脏出现肝细胞增生和肝脏重量增加(拉姆丹等。, 2010;萨诺等。, 2009). 因此，TCE诱导的miR-182-5p过度表达可能通过促进细胞增殖而参与肝癌的发生。

Cited2在肝脏发育中发挥重要作用，并在肝细胞中发挥抑癌作用(张（音译）等。, 2013;曲等。, 2007). 与邻近正常组织相比，原发性HCC样本中Cited2的mRNA表达水平较低(张（音译）等。, 2013). 人肝细胞中的Cited2敲除显著增加细胞增殖并促进G1-S转换(张（音译）等。, 2013). 在本研究中，我们确定Cited2是miR-182-5p的直接靶点，miR-182-5 p对其的下调在TCE诱导小鼠肝细胞增殖中起重要作用。

补充数据

补充数据可在毒理科学在线。

基金

教育部归国留学人员科研基金（批准号：K51390015）；国家自然科学基金（批准号：81570284）；中国博士后科学基金（批准号：2013M541718）；江苏省高等学校优先发展学术项目。

参考文献

作者注释