miR-200调节PDGF-D介导的前列腺癌细胞的上皮-间质转化、粘附和侵袭

摘要

微RNA与肿瘤进展有关。最近的研究表明，miR-200家族通过靶向锌指E-box结合同源异型盒1（ZEB1）和ZEB2来调节上皮-间充质转化（EMT）。我们实验室和其他实验室的新证据表明，EMT的过程可以由多种生长因子触发，例如转化生长因子β和血小板衍生生长因子D（PDGF-D）。此外，我们最近报道了前列腺癌细胞（PC3 PDGF-D细胞）中PDGF-D的过度表达导致EMT表型的获得，该模型为研究PDGF-D-信号转导和EMT之间的分子相互作用提供了机会。在这里，我们首次报道了PC3 PDGF-D细胞以及接触纯化活性PDGF-D-蛋白的PC3细胞中miR-200家族的显著下调，导致ZEB1、ZEB2和Snail2表达上调。有趣的是，miR-200b在PC3 PDGF-D细胞中的重新表达导致EMT表型的逆转，这与ZEB1、ZEB2和Snail2表达的下调有关，这些结果与上皮标记物的更高表达水平一致。此外，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可抑制细胞迁移和侵袭，同时抑制细胞对培养表面的粘附和细胞分离。从这些结果中，我们得出结论，PDGF-D诱导PC3细胞EMT表型的获得在一定程度上是miR-200抑制的结果，任何上调miR-200的新策略都将成为治疗侵袭性前列腺癌的一种有希望的方法。

在本文末尾可以发现潜在利益冲突的披露。

我介绍

上皮-间充质转化（EMT）是一个让人联想到“癌干细胞样细胞”特征的过程，具有鹅卵石表型的上皮细胞获得具有纺锤状成纤维细胞样形态的间充质细胞特征。这一过程涉及细胞-细胞连接的解体，包括E-cadherin和闭塞小带（ZO）-1的下调和重新定位，β-catenin从细胞膜到细胞核的下调和移位，肌动蛋白细胞骨架重组，以及间充质分子标记物如vimentin、，纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白[1]。通常，上皮细胞通过调节细胞-细胞连接和粘附形成簇，如紧密连接、粘附连接、桥粒和缝隙连接，从而抑制单个细胞的运动。相反，与上皮细胞相比，间充质细胞在细胞间的粘附性较小，具有更强的运动性和侵袭性，这有助于癌细胞的侵袭和转移[2].

在EMT的获得过程中，上皮标记物的丢失是一个关键的过程，由重要的转录抑制因子调节。在过去几年中，已经鉴定出了几种转录抑制因子，包括锌指E盒结合同源异型盒1（ZEB1）、ZEB2/SIP1，一种双手锌指核因子δEF-1家族成员，蜗牛1、蜗牛2/Slug、Twist和E47。ZEB1已被证明是不同细胞系中各种诱导物诱导的EMT的关键介体[三–6]。转录因子ZEB1已被证明通过与目标基因启动子区内的ZEB型E盒（CACCTG）结合来调节基因表达，从而导致染色质凝聚和基因沉默[7]。E-钙粘蛋白的表达受到ZEB1的负调控，ZEB1是EMT过程的基础[8]。最近的研究还表明，ZEB1通过抑制细胞极性因子的表达促进细胞迁移和肿瘤转移[9,10]。ZEB2/SIP1已被证明下调许多编码上皮表型关键蛋白的基因的表达，包括E-cadherin[11]并上调波形蛋白的表达[12]。研究表明，蜗牛2/鼻涕虫在生长因子诱导EMT中起着核心作用[13,14]表明ZEB1、ZEB2和Snail2是EMT诱导中的重要调节因子。

EMT的过程可能由许多生长因子触发，包括转化生长因子β和血小板衍生生长因子（PDGF）-A、PDGF-B和PDGF-D[15–19]。众所周知，PDGF-D可以通过激活其同源受体PDGFR-β来调节许多细胞过程，包括侵袭和血管生成[20,21]。最近的一项研究表明，PDGF-D在人类前列腺癌样本中的表达增加，这表明PDGF-D可能在人类前列腺癌的进展中发挥重要作用[22]。我们最近发现，用PDGF-D cDNA稳定转染PC3细胞可获得EMT表型，这一过程与PC3 PDGF-D-细胞的侵袭性和体内肿瘤生长率的增加相一致[23]。该模型为进一步研究PDGF-D信号转导与EMT之间的分子相互作用以及PC3 PDGF-D-细胞获得EMT表型的确切机制提供了机会。

新的证据表明miR-200家族可以通过靶向ZEB1和ZEB2来调节EMT的过程[4,5,24]。微RNA（miRNAs）是一种小分子（19-24核苷酸）非编码RNA分子，通过与多个靶mRNAs的3′非翻译区（UTR）中的序列相互作用，下调基因表达，从而导致mRNA的翻译抑制或降解[25]。众所周知，miRNAs参与胚胎发育和癌症进展，这一过程与上皮性肿瘤细胞EMT表型的获得有关[26]。此外，最近的研究表明，miR-200可以通过与ZEB1/SIP1 mRNA的3′-UTR序列结合来抑制ZEB1/SIP1的表达，ZEB1和ZEB2可以直接与miR-200基因簇的启动子结合，导致miR-200表达受到抑制，并在EMT期间建立双负反馈环，控制ZEB1/SIP1和miR-200家族的表达[4,24,27]。在这些条件下，发现调节miR-200或ZEB1/SIP1/ZEB2表达的因子对控制EMT非常重要，这些知识可能有助于设计治疗侵袭性前列腺癌的策略。因此，在目前的研究中，我们试图验证我们的假设，即miR-200的缺失是否有助于获得PC3 PDGF-D细胞中观察到的EMT表型，以及miR-200重新表达是否会导致PC3 PDGF-D细胞EMT表型的逆转。我们进一步假设，上述过程可能由ZEB1/ZEB2和蜗牛2转录因子的解除调控表达介导。

我们发现，与亲本PC3细胞相比，PC3 PDGF-D细胞以及接触纯化活性PDGF-D-蛋白的PC3细胞中miR-200的表达显著降低，这与ZEB1、ZEB2和Snail2的过度表达有关，并且用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞导致ZEB1和ZEB2的下调，和蜗牛2，相应的上皮标记上调。PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达导致miR-200的低表达并诱导EMT。从这些结果中，我们得出结论，miR-200的缺失在PDGF-D诱导LNCaP和PC3细胞EMT表型的获得中起着重要作用，并且miR-200重新表达可以导致EMT表型向间充质-上皮转化（MET）表型的逆转。这些结果提供了miR-200在PDGF-D过度表达前列腺癌细胞EMT/MET过程中的机制作用。

M（M）材料和M（M）方法论

细胞系和培养条件

如前所述，通过用相应的空载体pcDNA3-Neo或pcDNA3-PDGF-D:His转染PC3和LNCaP细胞，生成过表达PDGF-D的稳定细胞系[22]分别称为PC3-Neo或PC3-PDGF-D细胞和LNCaP-Neo或LNCaP PDGF-D-细胞。PC3、LNCaP和转染后的细胞系在RPMI 1640（Invitrogen、Carlsbad、CA、，http://www.invitrogen.com网站)补充5%或10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/l谷氨酰胺、10μmol/l HEPES、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。所有细胞均保持在5%的CO中₂-37°C下的增湿大气。

研究试剂和抗体

重组人PDGF-D购自研发系统公司（明尼阿波利斯，http://www.rndsystems.com). 抗蜗牛2、N-钙粘蛋白和波形蛋白的抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利，http://www.cellsignal.com网站)，BD生物科学公司（马萨诸塞州贝德福德，http://www.bdbiosciences.com)和Abcam（马萨诸塞州剑桥，http://www.abcam.com)分别是。抗ZEB1、ZEB2、Twist、Snail1、纤维连接蛋白、视网膜母细胞瘤蛋白和E-cadherin的抗体来自Santa Cruz Biotechnology Inc.（加州圣克鲁斯，网址：http://www.scbt.com). 从Invitrogen购买PDGF-D或ZO-1抗体、Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 594-山羊抗鼠IgG抗体以及Alexa Fuor 594-phalloidin用于F-actin染色的抗体。山羊抗兔IgG（H+L）-辣根过氧化物酶（HRP）缀合物和山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP缀合物从Bio-Rad（Reinach，网址：http://www.bio-rad.com). 抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体购自亲和生物试剂（Golden，CO，网址：http://www.bieragents.com).

小干扰RNA与转染

使用DharmaFECT3 siRNA转染试剂（Dharmacon、Lafayette、CO、，网址：http://www.dharmacon.com). 转染24小时后取出培养基，然后将细胞在含有5%FBS的培养基中再培养24小时。制备细胞裂解物用于Western blot分析，提取总RNA用于实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析。

Western Blot分析

使用细胞质或细胞核提取物或总细胞裂解物进行Western blot分析。通过在含有50 mM Tris–HCl、150 mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、0.5%脱氧胆酸钠、2 mM氟化钠和2 mM Na的RIPA缓冲液中裂解细胞，获得不同实验的总细胞裂解物_三VO4视频₂1 mM EDTA、1 mM EGTA和1×蛋白酶抑制剂混合物。根据我们实验室先前描述的方法制备细胞核和细胞质提取物[28]和Western blotting是按照之前其他地方的描述进行的[28].

miRNA前体（pre-miRNA）和特异性抗-miRNA（抑制剂）的转染

PC3 PDGF-D细胞接种于3×10⁵6孔板中每孔细胞数，转染前miR-200b或miRNA-阴性对照#1（Ambion，Austin，TX，http://www.ambion.com网站)使用DharmaFECT3转染试剂（Dharmacon），最终浓度为20 nM。使用DharmaFECT3转染试剂（Dharmacon），以最终浓度600 nM-200 nM转染LNCaP细胞，最终浓度为miR-200a、miR-200b和miR-200c抗miRNAs（Ambion）。转染3天后，细胞分裂，每3-4天用pre-miR-200b、miRNA抑制剂或对照重复转染一次，每次转染指定时间。

实时RT-PCR

使用Trizol试剂分离总RNA。根据制造商的说明，使用逆转录系统（Invitrogen）逆转录一微克RNA。实时PCR用于定量mRNA表达。ZEB1、ZEB2、Snail2、vimentin、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、sciellin、stratifin、crumbs同源物3（CRB3）、连接蛋白26、F11受体（F11R，连接粘附分子1）和GAPDH的引物序列如支持信息表S所示。本研究中用于E-cadherin的引物顺序在其他地方描述[4]RNA的相对量归一化为GAPDH的表达。对于miRNA分析，根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion）分离总RNA。使用Taqman MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，http://www.appliedbiosystems.com)使用来自Taqman MicroRNA测定（Applied Biosystems）的miRNA特异性RT引物。使用Taqman MicroRNA Assay（Applied Biosystems）的miRNA-specific Taqman MGB探针测定miRNAs水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。

细胞侵袭和迁移检测

使用24孔Transwell渗透支架和8μm孔进行细胞侵袭和迁移试验（Corning，Lowell，MA，网址：http://www.corning.com)并显示在支持信息数据中。

免疫荧光显微镜

免疫荧光染色由我们的实验室按照之前的描述进行[23]。简单地说，细胞用4%多聚甲醛固定，并在0.5%Triton X-100中渗透，然后用10%山羊血清封闭。将细胞与5%山羊血清中的E-cadherin抗体（1:20）、ZO-1抗体（1:50）或波形蛋白抗体（预稀释）孵育1小时，并用Alexa Fluor 594-结合二抗（1:250）染色1小时。对于F-actin染色，细胞在4°C下与0.33μM Alexa Fluor 594卵磷脂孵育1小时。载玻片用含有防臭试剂和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚的固定介质固定。通过荧光显微镜观察细胞，并使用Advanced Sport软件（Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI，http://www.diaginc.com).

细胞附着和分离分析

支持信息数据中显示了细胞附着和分离分析。

数据分析

本研究中的实验代表了三次或更多的重复。数据显示为平均值±标准误差。一个双尾学生的t吨-测试用于组间比较。的值对<0.05被认为具有统计学意义。

R（右）结果

PDGF-D调节PC3细胞中转录因子ZEB1、ZEB2和蜗牛2的表达

由于已知转录抑制因子如ZEB1、ZEB2、Snail1和Snail2是诱导EMT过程的关键调节因子，因此我们首先确定了这些转录抑制因子在细胞培养模型中的表达状态。结果表明，PC3 PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2和Snail2的表达显著上调，伴随着E-cadherin的丢失和vimemtin和N-cadherin表达的增加。此外，我们发现与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中Snail1的表达水平显著降低，Twist的表达水平没有显著差异（图。1安培). 为了进一步确定ZEB1表达的亚细胞定位，我们测试了全细胞裂解物以及细胞质和核提取物中的ZEB1水平。我们发现，全细胞裂解物和PC3 PDGF-D细胞细胞核中的ZEB1水平显著高于PC3 Neo细胞（图。1B年). 这些结果表明，ZEB1主要位于核室中。最重要的是，与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞显示出细长/不规则的纤维母细胞形态，后者显示出上皮鹅卵石样外观（图。1摄氏度). 这些结果与PC3 PDGF-D和PC3 Neo细胞（图。1安培).

PDGF-D的过度表达抑制上皮特异性基因的表达

在这项研究中，我们发现PDGF-D的过度表达显著下调了上皮特异性基因的表达，如编码E-cadherin、EpCAM、sciellin、stratifin、CRB3、connexin 26和F11R的基因（图。2安培)同时，ZEB1和ZEB2的mRNA水平较高（图。2B型).

为了进一步验证ZEB1是否能抑制这些上皮标志物的表达，我们通过用ZEB1特异性siRNA转染PC3-PDGF-D细胞来敲除ZEB1。我们的结果表明，敲除ZEB1显著增加了E-钙粘蛋白、F11R、CRB3和sciellin的mRNA水平（图。2摄氏度)，表明ZEB1负责调节与PC3-PDGF-D细胞中EMT表型的获得相关的基因。此外，图二维和第二版结果表明，用ZEB1 siRNA转染细胞可有效降低ZEB1在mRNA和蛋白质水平的表达；然而，由于目前尚不清楚的原因，我们发现ZEB1的敲除降低了ZEB2的mRNA表达，尽管这一发现与其他研究者的结果一致[29].

miR-200参与PC3 PDGF-D细胞上皮标记基因的调节，部分是通过调节ZEB1、ZEB2和蜗牛2

为了测试miR-200是否有助于调节PC3 PDGF-D细胞中的上皮标记基因，我们首先测定了miR-200在PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞的表达水平。我们发现，与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达显著下调，而miR-16的表达水平没有显著差异（图。3A级).

为了从机理上研究miR-200在EMT过程中对ZEB1和ZEB2的调节作用，我们用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞，随后测定转录抑制因子和上皮标记基因的表达状态。我们发现，在转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中，ZEB1和ZEB2以及Snail2的表达水平均显著低于转染对照miRNA的细胞，这与上皮标记基因的增强表达一致，例如编码E-cadherin、stratifin、EpCAM、F11R和connexin 26的基因（图。第3页,3C公司). 这些结果清楚地表明，miR-200b的缺失有助于ZEB1、ZEB2和Snail2的诱导，导致在PDGF-D过表达的PC3细胞中获得EMT表型期间上皮标记因子的负调控。

miR-200b的再表达诱导PC3 PDGF-D细胞MET的表达

由于miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞导致上皮标记基因表达上调，我们试图评估这些细胞中的EMT表型是否逆转。正如预期的那样，我们发现转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞呈圆形形态，转染3天后粘附在一起（图。4A级). 免疫荧光染色结果显示，E-cadherin的表达显著增加，主要位于细胞-细胞连接处的细胞膜上（图。4B类). 同时，我们发现在miR-200b转染的PC3 PDGF-D细胞中，ZO-1定位于细胞膜紧密连接处。相反，在转染对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞中，ZO-1从紧密连接处被破坏，如图所示4摄氏度此外，在转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中，间充质标记物的表达和分布模式不同。我们发现转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中波形蛋白的表达水平显著降低（图。4D（四维）). 我们还发现F-actin的表达模式存在差异。在转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中观察到具有上皮表型特征的皮质肌动蛋白模式，而在转染对照miRNA的PC3 PDGF-D电池中发现与间充质表型特征一致的肌动蛋白应力纤维（图。第四版). 这些结果表明，在PC3 PDGF-D细胞中发现的miR-200表达缺失有助于ZEB1、ZEB2和Snail2的上调，导致上皮标记基因的表达下调和EMT表型的获得，并且这个过程可以逆转（MET表型的获取）通过在PC3 PDGF-D细胞中重新表达miR-200b。

miR-200b抑制PC3 PDGF-D细胞的粘附和侵袭

为了证明miR-200b是否会影响PC3 PDGF-D细胞的行为，我们测试了细胞迁移和侵袭，发现用miR-200a转染PC3 PDGF-D细胞可显著抑制PC3 PDGD细胞的迁移和侵袭（图。5A级). 众所周知，细胞在生长环境中从基质中脱离并附着到次要位置是转移过程中细胞迁移和侵袭的“标志”。有趣的是，我们发现PC3 PDGF-D细胞表现出更强的分离和附着（图。5亿,5摄氏度). 更重要的是，与用对照miRNA转染相比，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞显著减少了细胞的分离和附着（图。第五天). 这些结果清楚地表明，miR-200b的重新表达通过将EMT表型逆转为MET表型来抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭。因此，我们相信，通过一种新的治疗策略，miR-200b可以在侵袭性人类前列腺癌中重新表达，这将成为未来治疗侵袭性和转移性前列腺癌的有用方法。然而，问题仍然存在，PDGF-D是否实际上负责PC3细胞EMT特征的获得，以及miR-200的抑制是否与该过程有机械联系。因此，我们评估了纯化的活性PDGF-D蛋白处理对PC3细胞的影响。

PDGF-D蛋白治疗抑制miR-200家族成员的表达并诱导EMT特征

为了进一步验证PDGF-D是否确实能够通过调节miR-200家族的表达来诱导PC3细胞的EMT表型，我们测定了miR-200家庭成员的表达水平，并评估了ZEB1、ZEB2、蜗牛2、波形蛋白、，用纯化的PDGF-D活性形式长期处理PC3细胞中的E-钙粘蛋白。用纯化的血小板衍生生长因子-D蛋白处理细胞导致miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达显著抑制（图。6A级)这与从PC3 PDGF-D细胞获得的结果一致。此外，我们还发现PDGF-D蛋白治疗显著增加了ZEB2、蜗牛2和波形蛋白在mRNA水平的表达，随之而来的是E-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达水平降低（图。6亿–第6天). 最重要的是，PDGF-D治疗显著增强了PC3细胞的分离和迁移（图。第六版,第6页)这表明PDGF-D确实负责PC3细胞中EMT表型的诱导，这在一定程度上是通过下调miR-200表达及其靶基因的调节来介导的。

PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达诱导EMT

为了证明PDGF-D能否在不同前列腺癌细胞系中诱导EMT，我们用PDGF-D-质粒转染LNCaP细胞，建立了稳定的过度表达PDGF-D的LNCaP-细胞系。我们发现PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达导致ZO-1（上皮标记物）的表达水平显著降低，波形蛋白和纤维连接蛋白的表达水平更高（图。第7章)同时miR-200b和miR-200c水平较低（图。7亿). 更有趣的是，我们发现LNCaP细胞中PDGF-D的mRNA水平显著低于PC3细胞（图。7摄氏度)而LNCaP细胞中miR-200，尤其是miR-200c的水平显著高于PC3细胞（图。第7天). 众所周知，LNCaP细胞比PC3细胞侵袭性小。为了研究miR-200是否有助于调节LNCaP细胞的侵袭，我们用抗miR-200a、抗miR-200和抗miR-200c转染LNCaP细胞，并进行侵袭试验。结果表明，转染抗miR-200a、抗-miR-200b和抗-miR 200c的LNCaP细胞的细胞侵袭能力显著高于转染抗-miRNA对照的细胞（图。第七版). 这些结果清楚地表明，PDGF-D的过度表达可以诱导EMT，部分是通过调节miR-200家族成员在PC3细胞和LNCaP细胞中的表达来介导的。

天震荡

PDGF-D已被证明在许多肿瘤细胞系中表达[30,31]前列腺肿瘤组织中[21,22]提示PDGF-D在前列腺癌的发生发展中起重要作用。在我们之前的研究中，我们报道PDGF-D的持续过度表达是导致PC3细胞EMT表型获得的原因，在异种移植模型中具有更大的侵袭性特征和更高的肿瘤生长率[23,32]。然而，PDGF-D在肿瘤发生和前列腺癌进展中的机制作用尚待阐明。上皮性肿瘤细胞EMT表型的获得被认为在肿瘤进展过程中肿瘤细胞的侵袭和转移行为增加中起着关键作用，这一过程令人想起“肿瘤干细胞”的特征。转录抑制因子，包括ZEB和蜗牛家族，与各种因素诱导的EMT表型的诱导密切相关。在我们当前的研究中，我们发现在PC3 PDGF-D细胞中，ZEB1、ZEB2和Snail2/Slug的表达水平显著较高，这与这些细胞的EMT特征一致，同时上皮标记物的表达水平较低，如E-cadherin、EpCAM、sciellin、stratifin、CRB3、connexin 26和F11R。

为了进一步了解ZEB1是否能够抑制上述上皮标记物的表达，我们用ZEB1特异性siRNA转染PC3 PDGF-D细胞，从而降低了ZEB1的表达。用ZEB1-siRNA转导PC3 PDGF-D细胞导致E-cadherin、CRB3、sciellin和F11R的高表达水平，所有这些都是上皮细胞的标记。然而，通过特异性siRNA敲除ZEB1不仅降低了ZEB1的表达，而且下调了ZEB2的mRNA水平，这与其他研究人员的研究结果一致[24,29]。综上所述，这些结果表明，转录因子ZEB1、ZEB2和Snail2/Slug可以介导PC3 PDGF-D细胞中观察到的EMT表型的诱导，并且特定转录因子的下调可能被证明有助于逆转EMT表型。

人们还很容易推测，这些转录因子可以通过新的机制在细胞中进行调节。事实上，最近的研究结果表明，miRNA，尤其是miR-200家族，可以通过靶向ZEB1和ZEB2 mRNA的3′-UTR来抑制ZEB1与ZEB2的表达，从而调节EMT的过程[4,5,24,33]。细胞内成熟miRNA的水平由许多复杂步骤调节，其中p68 RNA解旋酶是将初级miRNA加工成miRNA前体所必需的[34]。有趣的是，PDGF-B对Y593处p68 RNA解旋酶的磷酸化已被证明可以介导EMT的诱导[19]提示PDGF-B可以通过磷酸化p68 RNA解旋酶调节miRNAs的表达来诱导EMT。

这一诱人的新证据表明，在EMT过程中，miRNAs对mRNAs的调节促使我们研究miR-200家族是否在PDGF-D诱导的前列腺癌细胞EMT中发挥作用，并进一步评估我们的细胞培养模型系统中的EMT过程是否也受ZEB1、ZEB2、，和蜗牛2转录因子。我们发现，与对照细胞相比，在LNCaP PDGF-D和PC3 PDGF-D细胞以及接触PDGF-D-蛋白的PC3细胞中，miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达水平显著降低，表明miR-200家族可能调节我们模型中的EMT过程。ZEB1包含miR-200a的三个假定结合位点和miR-200b/miR-200c的五个假定结合部位[4,33]，ZEB2含有三个推测的miR-200a结合位点和六个miR-200b结合位点[4]。此外，我们发现PC3细胞中miR-200b的水平是miR-200c的八倍，这表明miR-200a可能在ZEB1和ZEB2表达的负调控中起着核心作用，因此miR-200p的缺失导致ZEB1、ZEB2的上调，导致PDGF-D诱导的EMT的获得。因此，我们选择通过转染研究在PC3 PDGF-D细胞中重新表达miR-200b，以进一步了解ZEB1和ZEB2的调节机制以及miR-200a重新表达对EMT表型的生物学后果。用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞后，ZEB1、ZEB2和Snail2在mRNA和蛋白质水平上的表达均显著降低，同时上皮标记物如E-cadherin、stratifin、CRB3、EpCAM、F11R和connexin 26的表达水平也随之升高。此外，用miR-200b转染的PC3-PDGF-D细胞显示出上皮表型，这表明miR-200b的缺失有助于EMT表型的获得，并且miR-200b的重新表达可能导致EMT表型逆转为MET表型。

EMT的过程与细胞迁移和侵袭有关，在PC3 PDGF-D细胞中miR-200b的重新表达导致EMT表型的逆转。在本研究中，我们发现用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可显著抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭。众所周知，癌细胞的转移过程需要细胞从原发部位分离、灌注、通过血管和淋巴管移位、外渗、附着于次级部位和定植。此外，细胞从基底膜上脱落和再附着在细胞迁移和侵袭以及肿瘤细胞转移中起着关键作用。有趣的是，我们发现PC3 PDGF-D细胞在细胞从培养表面脱落和附着到培养表面方面表现出显著增强。更重要的是，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞显著降低了PC3 PDGF-D细胞粘附和脱离培养表面的能力，并且我们的结果与miR-200b-在PC3 PDGR-D细胞中重新表达的作用一致，EMT逆转为MET特征，具有较小的侵袭性表型。更有趣的是，具有较低侵袭能力的LNCaP细胞具有较低的内源性PDGF-D表达水平和较高水平的miR-200家族成员，并且PDGF-D在LNCaP细胞中的过表达导致miR-200表达下调，这与EMT特征有关。

我们早期的研究结果表明，哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）和核因子（NF）-κB通路在PC3细胞中PDGF-D过表达诱导的EMT诱导中发挥关键作用[23]。在目前的研究中，我们发现miR-200家族成员，尤其是miR-200b的表达缺失，在一定程度上是PC3 PDGF-D细胞中EMT诱导的原因。众所周知，NF-κB通过上调ZEB1和ZEB2的转录抑制功能，在介导不同因子诱导的EMT过程中发挥重要作用[29,35]通过与miR-200启动子的E-box序列结合进而抑制miR-200家族成员的表达[27,33]。更有趣的是，miR-200通过与ZEB1和ZEB2 mRNA的3′-UTR相互作用下调ZEB1与ZEB2的表达[4,27]。此外，mTOR通路可以通过调节糖原合成酶激酶（GSK）-3β磷酸化间接调节NF-κB活性[23]。这些结果还表明miR-200和ZEB1/ZEB2之间存在双负反馈回路，即使在诱导信号停止后，也能维持EMT表型，这可能成为EMT逆转的关键靶点。总之，我们的结果与miR-200b的重新表达可以逆转PDGF-D诱导的EMT表型的发现相一致，在这个过程中，mTOR通路可以通过调节GSK-3β磷酸化间接调节NF-κB活性，从而在miR-200的调节功能中建立一个机制联系，尽管有必要进行进一步的机理研究。

为了进一步证明PDGF-D是否确实可以通过调节miR-200家族成员的表达来诱导PC3细胞的EMT表型，我们分析了用纯化的PDGF-D活性形式长期处理的PC3细胞中miR-200家族成员、转录抑制物和EMT分子标记的表达水平。我们发现，用纯化的血小板衍生生长因子-D蛋白处理细胞导致miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达水平显著降低，在mRNA水平上，ZEB2、蜗牛2和波形蛋白的表达水平显著提高，同时E-cadherin的表达水平也相应降低。最重要的是，PDGF-D治疗显著增强了PC3细胞的细胞分离和迁移，表明PDGF-D-确实是PC3细胞EMT表型的诱导因素，这部分是通过下调miR-200表达和调节靶基因来介导的。然而，我们发现，与PDGF-D转染的PC3细胞相比，PC3细胞长期接触PDGF-D蛋白不足以诱导显著的形态学差异。该观察结果与我们之前的发现一致，即PDGF-D转染的细胞在早期传代中保留了上皮特征，而EMT特征仅在后期传代中可见（传代>7），提示慢性接触高浓度PDGF-D对PC3细胞EMT表型的诱导和维持是必需的。另一种解释可能是，PDGF-D的作用存在一种内源性机制，与PC3 PDGF-D细胞内合成的PDGF-D-相比，当细胞被纯化的PDGF-D外源性处理时，该机制可能不起作用。有趣的是，最近的研究表明，许多生长因子，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和PDGF，都具有脑内信号转导机制[36–39]这可能是PDGF-D过度表达导致EMT的机制之一，如我们的研究所示。

S公司摘要

总之，我们开发了一个细胞培养模型，用于了解EMT的分子调控及其对MET表型的逆转。更重要的是，我们发现PDGF-D可以通过调节miR-200家族成员的表达来诱导EMT，这与ZEB1、ZEB2和蜗牛2的放松调控有关。基于我们的新发现，我们认为通过创新方法在人类前列腺癌中重新表达miR-200b可能有助于设计治疗侵袭性和转移性前列腺癌的策略。

A类确认

这项工作的部分资金来自NIH国家癌症研究所的拨款（5R01CA108535至F.H.S.）。这项工作也部分由Puschelberg基金会资助。

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作者表示没有潜在的利益冲突。

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作者注释