摘要
NF-κB蛋白p65/RelA在协调基因表达以应对各种刺激(包括病毒感染)方面起着关键作用。在染色质水平上,p65/RelA分别通过启动子富集和基因组外显子占据来调节基因转录和选择性剪接。p65/RelA在不同基因中同时控制这些功能的复杂方式尚待完全阐明。在本研究中,我们使用了HTLV-1 Tax癌蛋白,一种NF-κB的有效激活物,来研究其对基因组三维组织的影响,基因组三维组织是基因调控的关键因素。我们发现,Tax重组了3D基因组景观,根据其调控和剪接模式将基因整合在一起。值得注意的是,我们发现两个主基因之间的Tax-induced基因-基因接触NFKBIA公司和RELA公司与它们各自在基因表达和选择性剪接方面的变化有关。通过dCas9-介导的方法,我们证明NFKBIA–RELA公司相互作用是选择性剪接调控所必需的,是由p65/RelA基因内富集引起的RELA公司我们的发现揭示了HTLV-1 Tax的新调控机制,并强调了p65/RelA在3D基因组背景下转录和剪接水平上协调调节NF-κB应答基因的整体作用。
Lay摘要
NF-κB通路对于协调基因表达以应对各种刺激(包括病毒感染)至关重要。大多数研究集中于NF-κB在转录调控中的作用。在本研究中,研究了强NF-κB激活剂HTLV-1 Tax癌蛋白对基因组三维结构的影响。研究发现,细胞中的分类介导NF-κB活化可重构3D基因组景观,并将基因聚集在多基因复合物中,这些复合物通过转录或NF-κ的选择性剪接进行协调调节。转录和选择性剪接中诱导的坐标变化包括NF-κB通路的两个主基因NFKBIA和RELA。这些发现对于理解HTLV-1感染相关的细胞命运决定和疾病发展以及各种人类炎症疾病和癌症中的慢性NF-κB活化具有重要意义。
介绍
基因表达过程涉及多个步骤,包括转录和剪接,它们共同形成转录组并最终决定细胞行为。因此,转录和选择性剪接事件之间的基因到基因协调是细胞对刺激作出适当反应所必需的。病毒等细胞病原体会扰乱这种协调,导致转录组多样性的定量和定性改变,最终会扰乱细胞稳态,促进病毒复制和持久性。因此,更好地理解与转录和剪接协调相关的机制对于理解细胞对病毒感染的反应是必要的。
逆转录病毒人类T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)主要感染T淋巴细胞,导致一系列疾病,包括成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和各种炎症疾病(1). HTLV-1复制最初涉及细胞间传播,随后是感染细胞的克隆扩增,这是病毒和相关疾病持续存在的原因(2). 参与HTLV-1感染的关键病毒蛋白之一是癌蛋白Tax,该蛋白最初被描述为与多种宿主细胞蛋白(包括NF-κB转录因子家族)相互作用的转录激活物。通过劫持NF-κB信号,Tax深刻影响免疫反应、细胞存活和炎症的关键机制,并在HTLV-1发病机制中发挥关键作用(三).
在分子水平上,Tax与多个NF-κB和IκB蛋白相互作用,包括p65/RelA(4),第50页(5),c-Rel公司(4),第100页(6–8),第105页(9),IκBα(10,11)和NEMO(10,12). Tax通过促进抑制蛋白IκBα的降解激活NF-κB途径,该抑制蛋白控制NF-κ的信号振荡动力学(13,14). Tax诱导p65/RelA的结构性核移位,导致靶基因的慢性激活。通过翻译后修改(15),Tax能够形成富含NF-κB p65/RelA和剪接因子SRSF2/SC35的核小体,这些核小体已被提议通过NFκB途径参与Tax介导的基因表达激活(16,17). 在这种情况下,我们最近证明,当Tax被表达时,p65/RelA不仅影响启动子,而且在基因体中富集并诱导选择性剪接变化,从而扩大了NF-κB对转录组多样性的定量和定性影响(18). 转录因子p65/RelA与各种剪接因子相互作用(18–22)包括DDX17,当p65/RelA在接近基因组目标外显子的位置招募时,其调节GC-rich外显子剪接(18). 值得注意的是,Tax-induced alternative splicing主要影响在基因表达水平上未被修饰的基因(18,23). 此外,p65/RelA与其基因组目标外显子的实验性栓系足以局部影响选择性剪接,表明p65/RelA作用于剪接,而与其在目标基因启动子上的活性无关(18). 鉴于NF-κB调节的基因在介导细胞功能和对刺激的反应方面的协调受到严格控制,这些发现提出了p65/RelA这两种不同活性是否协调的问题。
NF-κB应答基因的转录协调是通过复杂的机制相互作用来调节的,包括NFκB信号的振荡动力学(13,14,24)NF-κB亚单位形成的同源或异源二聚体的差异DNA亲和力(25,26)κB位点和侧翼序列的识别(26–28)以及NF-κB的特定共因子和翻译后修饰(29,30). 此外,染色质的3D构象最近已成为NF-κB介导的基因表达调控的关键决定因素(31). NF-κB p65/RelA能够通过与各种转录和染色质重塑因子的相互作用促进DNA循环(32,33). TNF-α上的NF-κB信号传导与特殊转录工厂的形成有关,也被称为NFκB工厂,其中反应编码基因和miRNA基因以协调的方式转录(34). 共转录基因的这种长距离相互作用可以发生在一种层次关系中,有助于响应基因的时间协调调节(35).
值得注意的是,3D染色质构象还与其他各种因素(如RNA结合蛋白、转录延伸率和染色质重塑因子)一起参与了共转录选择性剪接调控(33–41). 活性染色质高度集中在核中心和核斑点周围,核斑点是富含剪接因子和其他RNA加工蛋白的动态亚核结构(42). NS在其附近富含富含GC的基因组序列(43). 特别是,与低GC对应物相比,具有高GC含量的外显子-内含子单元似乎优先定位在与NS相关的核中心(44,45). 重要的是,高GC和低GC外显子-内显子单元显示出不同的剪接模式,它们从一个基因组位置到另一个基因组地点的实验性转移影响了它们的转录和剪接调控,表明基因的核位置决定了它在选择性剪接中的调控(45). 与此相一致,在富含剪接因子RBM20的病灶中,通过跨染色体接触形成多基因复合物被证明具有剪接工厂的功能,这表明基因相互作用网络可能充当调控细胞吞噬应答基因转录和选择性剪接的枢纽(46). 因此,问题是3D染色质构象能否在p65/RELA促进Tax表达的转录和选择性剪接事件的协调中发挥作用。
在这里,我们提供了分子证据,证明Tax诱导细胞基因组3D构象的剧烈变化,伴随着差异基因表达和选择性剪接修饰。特别地,我们证明了跨染色体相互作用涉及NFKBIA公司和RELA公司基因是Tax-induced skipping of exon E6的必需基因RELA公司导致具有独特基因表达激活模式的p65/RelA亚型的表达。通过dCas9的基于工程的方法证明NFKBIA公司-RELA公司接触是由基因组附近p65/RelA的DNA结合引起的RELA公司E6,不影响靶基因表达。这些结果揭示了HTLV-1、NF-κB信号转导和3D基因组构象在细胞功能重编程中的相互作用,证明了p65/RelA依赖性多基因复合物的形成如何协调NFκB相关转录和选择性剪接事件。
材料和方法
细胞培养和转染
人类胚胎肾(HEK)293T-LTR-GFP细胞含有一个整合的GFP报告基因,受病毒HTLV-1长末端重复序列(LTR)控制。HEK293T-LTR-GFP在DMEM+4.5 g/l中培养d日-葡萄糖+丙酮酸+谷氨酸MAX™,补充10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素。通过EVOS®FL成像系统测量GFP荧光来评估Tax、Tax-M22和dCas9-T2a-GFP构建物细胞的转染效率。dCas9的RNA指南(sgRNA)(补充表1)使用UCSC“CRISPR目标”轨迹和序列设计,总体预测分数最高,离目标最低。sgRNAs被克隆到CRIZI质粒的BsmBI位点(由法国里昂CIRI的Philippe Mangeot慷慨捐赠)。为了克隆dCas9-p65,从HEK-293T-LTR-GFP cDNA中扩增出WT-p65,并克隆到dCas9-empty-GFP质粒的BamHI和XbaI位点(由法国奥赛居里研究院的Reini F.Luco慷慨捐赠)。利用HEK293T cDNA扩增的序列产生表达载体pRELA-WT和pRELAΔE6,并在5′处添加V5序列。然后使用NotI和BamHI限制性位点在pXJ41质粒中克隆序列。所有序列均经Sanger测序验证。
使用Jetprime(Polyplus Transfection)对pSG5M-Tax-WT、pSG5M-Tax-M22、pLV hU6-sgRNA hUbC-dCas9-KRAB-T2a-GFP(addgene质粒#71237)、sgRNA-CRIZI、pBabe-Puro-IKBalpha-WT(addgene质粒#15290)、dCas9-p65、dCas9 empty、siRNA-siGL2和-NFKBIA(NM020529上的SASI_Hs01_00118495,Merck)进行转染按照制造商的说明,并在转染后48小时收获细胞。
HTLV-1慢性感染的淋巴细胞C91PL和未感染的Jurkat(均由法国里昂Renaud Mahieux CIRI慷慨捐赠)在添加了25 mM HEPES、10%热灭活FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基(Gibco,Life Technologies)中培养。
RNA-seq分析
RNA-seq数据之前已经发布(18)并以注册号GSE123752存放于NCBI GEO。简言之,在转染后48小时从转染pSG5M-Tax或pSG5M空载体的293T-LTR-GFP细胞中提取poly-A转录物。从生物三倍体中制备RNA-seq文库,并使用illumina HiSeq 2500进行测序。然后使用管道FaRLine和FasterDB数据库分析成对读取(47). HTSeq计数(v0.7.2)(48)和DESeq2(v1.10.1)(49)分别用于计算基因表达水平和计算差异基因表达水平。ΔPSI(拼接序列的差异百分比)的显著性阈值设置为5%(第页<0.01,Fisher精确测试)和0.6(对数)2-基因表达变化(P(P)<0.05,使用Benjamini和Hochberg方法的Wald检验)。使用Bedtools的reldist进行选择性剪接事件(ASE)和差异基因表达之间的相对基因组距离分析。ASE的控制集是使用Bedtools的shuffle功能生成的。
高碳分析和数据处理
Hi-C实验和文库准备是在就地Rao和同事描述的方法,稍作修改(50). 简单地说,使用HindIII酶在37°C和500 U条件下消化细胞过夜,然后使用2000U T4 DNA连接酶在18°C条件下进行生物素填充和近接连接4小时。在反向交联后,使用Covaris S220声波仪纯化DNA并剪切成约300 bp的片段。然后将含有生物素的片段固定在MyOne Streptavidin T1珠上。连接NEXTflex适配器,并使用KAPA HiFi文库扩增试剂盒对片段进行PCR扩增8个周期。使用AMPure XP珠进行双尺寸选择,以分离300-800 bp的片段。对Illumina HiSeq4000进行Hi-C文库测序,2×50 bp配对读取(Genomeast,IGBMC,Illkirch,法国)。使用HiC-Pro管道(版本v3.1.0)将原始读取独立映射到hg19参考基因组,输出统计数据,包括排序读取的总数和过滤后有效交互的数量,显示在补充图S1.
Hic explorer管道(v3.7.2)用于处理Hi-C数据并绘制矩阵(51,52). 矩阵首先相互规范化(hicNormalize),然后进行校正(hicCorrectMatrix),以移除读取次数较少的存储箱,并使用ICE进行平衡(53)分辨率为10k、50k、100k和500k bp。在500k分辨率的对数刻度上绘制校正矩阵(hicPlotMatrix)。在500k分辨率的校正矩阵(hicCompareMetrices)上,使用Tax和CTL细胞之间的log2ratio比较获得微分矩阵。使用hicPlotSVL计算短程和长程接触的比率,阈值距离设置为1e6核苷酸。
使用分辨率为100k的矩阵流水线dcHiC分析A/B隔间的推断以及Tax和CTL矩阵之间隔间的变化(54). 全基因组室强度根据对数计算为(AA+BB)/(AB+BA)2根据特征向量值排序的观察触点与预期触点的比率(hicCompartivalization)。使用冷却工具生成鞍形图(https://github.com/open2c/cooltools)使用顺式-以50k的分辨率从矩阵中获取触点。八个小班由流水线CALDER分配,矩阵分辨率为10k,binning变量设置为50k(55). Deeptools的PlotEnrichment(56)然后使用该函数验证CALDER对ENCODE中HEK293T细胞(ENCFF706GDY、ENCFF219COP、ENCFF800LFN、ENCFW063WXN、ENFF626VTP和ENCFF295FIO)的组蛋白标记H3K27ac、H3K4me3和H3K9me3中的亚组分富集水平的预测。使用Bedtools对Tax和CTL条件下的隔间和小班方向进行了比较(57). Sankey图是使用networkD3包在R中构建的。使用带有Tax与CTL对数坐标的bedtools交叉函数,获得了与Tax引起的小室转变和染色体间变化相对应的基因组区域2以50kbp计算的比率接触矩阵和小班变化分组如下:A.1(A.1.1+A.1.2)、A.2(A.1.1+8.1.2)、B.1(B.1.1+B.1.2)和B.2(B.2.1+B.2.1)。使用ShinyGO 0.76.3对Tax表达细胞中涉及3D染色质接触的启动子进行基因本体分析和基序富集。
拓扑关联域(TAD)的识别是使用hicexplorer软件的HicFindTAD功能进行的,矩阵分辨率为50k。分析的最小和最大窗口长度分别为150k和500k,并且q个-错误发现率(FDR)的阈值设置为0.05。通过将最小差异阈值(delta)设置为0.01来区分假定的边界和周围的箱子。对照(CTL)和Tax表达细胞之间TAD边界的相似性通过使用Bedtools的Jaccard统计来评估,其具有50kb的耐受窗口。通过使用Hicexplorer的hiCMergeDomains函数合并从CTL和Tax条件获得的TAD域,分析了TAD内和TAD间的相互作用。CTCF结合位点(ENCODE ENCF895AOX)用于描绘TAD边界,考虑到彼此之间20 kb内的边界合并为一个边界。随后使用FANC算法验证TAD边界(58),显示出边界识别的显著重叠(83%(3985个中的3296个,P(P)-值<10−4,费希尔试验)。然后利用合并的TAD边界计算Tax和CTL矩阵之间的TAD内和TAD间差分接触(hicDifferentialTAD)。通过Wilcoxon秩和检验,确定了显著的TAD内和TAD间相互作用P(P)-值阈值设置为0.05。床具交叉功能允许将基因解除调控分配给Tax和CTL之间的差异染色质相互作用(log2(obs/exp)为50k)。使用Cytoscape(3.9.1)对ASE、DGE和染色质接触进行网络分析。使用coolpup.py进行堆积分析(59)使用围绕TAX调节基因(1Mbp)的预期/观察信号(箱子大小30 kb)。随机挑选的基因通过床上工具获得(样本)。接触富集水平由中心100×100像素方格内相互作用的平均值估算。
蛋白质印迹
用1×PBS洗涤细胞两次,收获细胞并用裂解缓冲液(10 mM Tris–HCl pH 8,50 mM NaCl,5 mM EDTA,1%NP-40,1%SDS,1 mM DTT,补充蛋白酶抑制剂和10 mM NaF)在冰上培养30分钟。在Bioruptor Plus(Diagenode)上对总蛋白进行超声波处理(位置高,5×30′/30′周期),并将细胞碎片制成颗粒并丢弃。使用20μg总蛋白在NuPAGE™4–12%Bis–Tris蛋白凝胶上进行SDS-PAGE电泳,并使用Trans-Blot®TurboTM印迹系统转移到硝化纤维素膜上。膜在含有5%非脂肪乳的1×TBS-Tween中饱和1 h,并在4°C下与稀释在含有5%非脂乳的1 x TBS-Tween中的一级抗体孵育过夜。使用的主要抗体如下:RELA(sc-109,Santa Cruz)、Tax(1A3,Covalab)、Vinculin(ab129002,abcam)、IkBa(L35A5细胞信号技术)。在1×TBS–Tween中清洗膜三次,并与HRP结合的二级抗体孵育1小时,然后清洗三次。HRP底物(Immobilon Forte(Millipore))在Chemidoc(BioRad)上读取化学发光之前沉积在膜上。
RNA提取、PCR和实时定量PCR
使用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA。根据制造商的说明,使用dsDNase(Thermo Scientific)处理2.5μg总RNA,并使用Maxima First Strand cDNA Synthesis(Thermo-Scientistic)逆转录。使用GoTaq聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)以7.5 ng cDNA为模板进行PCR,在琼脂糖凝胶电泳上进行并使用Geldoc(BioRad)进行读取。使用7.5 ng cDNA在LightCycler 480 II上使用SYBR®Premix Ex Taq TM II(Tli RNaseH Plus)进行定量PCR。检查熔融曲线是否存在非特定产品缺失。使用ΔΔCt方法计算技术副本或三份副本的相对表达水平,并将其归一化为GAPDH表达,将对照组的值设置为1(Δ△Ct)。使用公式2确定替代外显子的包含率-ΔΔCt(调节外显子)/2-ΔΔCt(构成外显子)。PCR在以下热循环条件下进行:在95°C下初始变性30 s,然后在95°C下进行40个变性循环10 s,在64°C下进行退火/延伸步骤10 s,最后在95°C5 s和65°C下循环60 s。寡核苷酸序列列于补充表S1.
染色质免疫沉淀
2 × 107将细胞在室温下用1%甲醛交联10分钟。通过添加最终浓度为0.125 M的甘氨酸来阻止交联。收集细胞,并在4°C的裂解缓冲液中培养30分钟(1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、140 mM NaCl、50 mM HEPES–KOH pH 7.5、1 mM EDTA,补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)。将细胞核造粒并重新悬浮在剪切缓冲液中(10 mM Tris–HCl pH 8.0,1 mM EDTA,2 mM EDTA,0.1%SDS,补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)。使用Covaris S220将染色质剪切到100–500 bp的平均片段大小(峰值功率:140;占空比:5;周期/突发:200,20分钟)。使用稀释缓冲液中稀释的25μg染色质(1%Triton X-100,0.01%SDS,150 mM NaCl,10 mM Tris–HCl pH 8,1 mM EDTA,补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)进行免疫沉淀,并与5μg抗RELA(#36369,活性基序)、抗HA(H3663,Sigma-Aldrich)孵育或对照兔或鼠IgG(分别为10500C和10400C,ThermoFisher)在4°C下旋转过夜。染色质抗体复合物通过与30μl Dynabeads®蛋白A/G 1:1混合液(ThermoFisher)在4°C下旋转培养2小时来回收。使用以下缓冲液在4°C下旋转清洗络合物5分钟:清洗1(1%Triton X-100,0.1%NaDOC,150 mM NaCl,10 mM Tris–HCl pH值8),清洗2,洗涤4(0.5%NP-40,0.5%NaDOC,250mM LiCl,20mM Tris–HCl pH 8,1mM EDTA),洗涤5(0.1%NP-40,150mM NaCl,20mM Tris–HCl pH 8,1mM EDTA),并用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris pH 8.0,1mM EDTA)洗涤两次。免疫沉淀染色质在洗脱缓冲液(1%十二烷基硫酸钠、200 mM氯化钠、100 mM氯化氢钠)中洗脱三)添加100μg蛋白酶K并在65°C下培养过夜,可逆转交联。通过酚-氯仿萃取纯化免疫沉淀染色质,并使用SYBR®Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(Takara)对LightCycler 480 II(德国曼海姆罗氏)进行定量PCR,使用制造商推荐的热循环条件。数值表示为相对于对照IgG免疫沉淀获得的信号的倍增。用于定量ChIP实验的引物可在补充表S1.
染色体构象捕获(3C)
1 × 107在室温下用1%甲醛(ThermoFisher)交联细胞10分钟。通过添加甘氨酸5分钟至0.125 M的最终浓度来停止甲醛交联。用冷PBS洗涤细胞两次并收获细胞。使用裂解缓冲液(50 mM Tris–HCl pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%NP-40、1%Triton X-100、5 mM EDTA,并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒)在冰上裂解细胞颗粒20分钟。通过离心收集细胞核,并在1.2倍限制性缓冲液中清洗(取决于使用的限制性酶),然后在500μl相同缓冲液中再次悬浮。对于核膜渗透,将SDS添加到0.3%的最终浓度,然后在37°C搅拌(800 rpm)下培养1 h。通过在37°C、900 rpm下添加Triton X-100至最终浓度2.5%,中和SDS 1h。通过在37°C下以900 rpm添加50 U DpnII或ApoI 3 h,然后再添加50 U,并在37°C900 rpm下过夜培养,实现消化。通过琼脂糖凝胶电泳在反向交联和纯化的小份样品上评估消化效率(数据未显示)。限制性内切酶在65°C下以900 rpm孵育20分钟后失活。通过在7 ml 1×结扎缓冲液中稀释限制反应,将消化后的染色质直接结扎。通过添加50 U T4 DNA连接酶并在16°C下以750 rpm孵育3小时,然后再添加50 U并在16°C下以750 rpm孵育过夜来进行连接。通过琼脂糖凝胶电泳在反向交联和纯化的小份样品上评估连接效率(数据未显示)。通过添加30μg蛋白酶K并在65°C、900 rpm下过夜培养,可逆转交叉链接。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化3C模板。
使用半巢式引物进行3C-PCR(补充表S1)和两轮PCR。在第一轮中,使用50 ng 3C模板,并使用Phusion Green HSII High-Fidelity PCR Master Mix扩增,最终引物浓度为0.5μM,使用以下程序:在98°C下变性3 min,然后20×(98°C 10 s,引物特定退火温度30 s,72°C 45 s)以及72°C下10分钟的最终拉伸。在进行第二轮3C-PCR之前,通过凝胶琼脂糖电泳对第一轮3C-PCR进行分析,以检查是否存在任何显著的扩增带。使用与第一轮相同的引物进行第二轮3C-PCRRELA公司观点,以及更接近限制位点的不同引物NFKBIA公司观点。使用Phusion Green HSII High-Fidelity PCR Master Mix和0.5μM的最终引物浓度,使用以下程序扩增1μl第一轮PCR:在98°C下变性3 min,然后是25×(98°C 10 s,引物特定退火温度30 s,72°C 45 s)和在72°C下延伸10 min。使用Thermofisher Phusion tm计算器确定最佳退火温度(www.thermofisher.com/tmcalculator网站). 用凝胶琼脂糖电泳分析3C-PCR产物。
环状染色体构象捕获(4C-seq)和数据处理
对于环状染色体构象捕获,执行与3C相同的协议。50μg 3C模板在37°C、500 rpm、1×缓冲液B(ThermoFisher)中用50 U秒限制性内切酶(Csp6I,ThermoFisher)消化2 h。通过琼脂糖凝胶电泳对纯化的小份样品进行消化效率评估(数据未显示)。限制性内切酶在65°C下以900 rpm孵育20分钟后失活。第二次结扎是在稀释条件下进行的,方法是添加50 U T4 DNA连接酶,并在16°C下以750 rpm孵育2 h,然后在16°C下再以750 rpm孵化50 U和2 h。通过琼脂糖凝胶电泳在反向交联和纯化的等分试样上评估连接效率(数据未显示)。4C模板通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化,然后进行额外的JetSeq™Clean纯化。
4C测序引物(补充表S1)按照前面描述的设计(60)并在小部分4C模板上测试,以确定每个引物对的线性范围、效率、最小引物二聚体扩增和最佳退火温度。4C文库分两步PCR制备。第一步是根据引物线性,使用100–400 ng模板扩增每个视点特定的连接片段。Expand™Long Template PCR System(Roche)与以下热循环程序一起使用:94°C下变性2 min,然后16×(94°C 15 s,底漆特定退火温度1 min,68°C 3 min)和68°C下最终延伸7 min。所有第一步PCR引物列于补充表S1。根据制造商的说明,进行多个PCR反应,汇集在一起,并使用JetSeq™Clean纯化进行纯化。使用Expand™Long Template PCR System(Roche)对5μl纯化的第一步PCR产物进行第二个PCR步骤(用于添加照明适配器、索引和测序序列),并采用以下热循环程序:在94°C下变性2 min,然后是20×(94°C 15 s,60°C 1 min,68°C 3 min)以及在68°C下5分钟的最终拉伸。所有第二步PCR引物列于补充表S1根据制造商的说明,使用JetSeq™Clean纯化法纯化.4C模板。用D500屏幕胶带(安捷伦)在2200 Tapestation(安捷伦特)上测定文库数量和纯度。对Illumina Nextseq 550进行4C文库测序,并进行150 bp的单端读取(Genomeast、IGBMC、Illkirch、法国)。
使用fourSig管道对每个复制和视点的4C-seq数据进行计算分析(61)使用以下参数:window.size=5、iterations=1000、fdr=0.001和fdr.prob=0.01。对于每个视点,使用deepTools中的multiBamsummary和Bamcompare将三个重复的输出相互规范化(56). 使用Fisher检验确定CTL和Tax条件之间的差异染色质接触。使用pygenometrack(版本3.6)生成数字(62).
结果
税收重塑3D基因组
为了测试3D染色质构象是否在p65/RELA促进病毒致癌基因HTLV-1 Tax的转录和选择性剪接事件中发挥作用,我们首先评估了Tax对3D染色质组织的影响。为此,我们对有和无Tax表达的HEK293T细胞进行Hi-C分析,进行了无偏染色质相互作用映射。使用HiC-pro管道分析Hi-C数据(63)高绘图率证明,这确保了高质量的实验(补充图S1). 我们在对照(CTL)和Tax-expressing细胞中发现了1.6亿多个相互作用,包括2000多万个跨染色体接触(补充表S2). 与之前关于染色体区域的研究一致(64,65),Hi-C接触图显示顺式-与跨染色体相互作用(图1安培). 而CTL和Tax-expressing细胞的Hi-C图谱显示出相似的体积特性(图1安培和补充图S2),我们注意到Tax表达式的短程(<1Mb)交互频率减少,而长程(>1Mb(补充图S3A-B). 这些变化在不同的热度中尤为明显(图1安培,右侧面板)。
图1。
Tax重塑了基因组的3D染色质构象。(A类)热图显示了控制细胞(CTL)和表达Tax蛋白(Tax)的细胞染色体的标准化Hi-C相互作用频率图。上面的面板用对角线描述了所有染色体矩阵,对角线表示染色体内的接触,而非对角线区域则表示染色体间的相互作用。下面板以500 kb的分辨率缩放整个11号染色体。右侧面板表示Tax和CTL条件之间的温差热图,以及日志2色标指示的比率。(B类)税务和CTL条件下的A区和B区。隔间A和B分别显示为红色和蓝色。面板显示了隔间A和B(青色方形)之间的所有可能切换。x轴表示基因组坐标,y轴表示标准化的隔室评分。(C类)Hi-C数据的鞍形图,显示同型(A–A和B–B)和异型(A-B和B–A)顺式-交互频率。右侧面板显示了日志中Tax和CTL之间的差异鞍形图2比率触点。(D类)与控制单元(CTL)相比,表达Tax(Tax)的单元中的切换单元的百分比。(E))Sankey图显示了在Tax和CTL条件下每个小班之间切换的基因组片段的比例。(F类)圆形图显示不同的跨染色体接触(对数2FC≥2)由Hi-C数据确定,该数据涉及将小室从控制细胞切换到Tax-expressing细胞。(G公司)维恩图显示了在控制单元格和表示Tax的单元格中确定的TAD边界的重叠。(H(H))根据Tax表达式显示不同TAD内和TAD间联系的TAD百分比。(我)对照细胞和Tax表达细胞中TAD内和TAD间相互作用的观察到的超预期(obs/exp)相互作用频率的箱线图。obs/exp比值用对数值表示。
Hi-C接触矩阵的主成分分析(PCA)使我们能够评估Tax对基因组亚区A和B的影响,这两个亚区分别对应于常染色质和异染色质区域(图1B年). 从CTL和Tax样本计算的特征向量高度相关(皮尔逊检验,R(右) = 0.948,P(P)-值<0.0001)(补充图S3C),表明在两种实验条件下,A和B隔室的基因组位置没有普遍变化,以同型隔室相互作用(AA和BB)为主(图1摄氏度). 然而,Tax-expressing细胞表现出增加的异型隔室相互作用和减少的AA接触(图1摄氏度),表明税收削弱了A隔间的划分。CTL和Tax表达细胞之间的细胞室分布对比分析显示13%的细胞室转换(A到B和B到A,图一维)这表明病毒癌蛋白在结构上影响着大的异染色质和常染色质区域。
跨染色体相互作用与与不同表观遗传调控相关的亚室域的定义有关(50). A1亚区被确定为高度活跃的染色质区域,与核斑点密切相关(66,67)而B1和B2通常富含抑制标记,如H3K27me3和H3K9me3(50,55). 我们使用了CALDER算法(55)推断CTL和Tax-expressing细胞中的八个小室(图1E级和补充图S3E、F). 使用HEK 293T细胞的公开ChIP-seq数据集,我们证实了对照细胞中预测的亚区A.1.1和A.1.2显著富集活性标记H3K27ac和H3K4me3,而区室B.2.1和B.2.2对应于H3K9me3嵌入区(补充图S3E). 然后,我们通过考虑4个大的小室,对两种实验条件下的小室注释进行了比较:A.1(A.1.1+A.1.2)、A.2(A.1.1+8.1.2)、B.1(B.1.1+B.1.2)和B.2(B.2.1+B.2.1)。如图所示,在Tax表达细胞中观察到了小室转变1E级和补充图S3F这些转变涉及从活跃亚区到不活跃亚区的转变,其中一些与差异跨染色体相互作用相吻合(图1楼). 总的来说,这些数据表明Tax促进了3D基因组的实质性重组,该重组可能遵循动态染色质调节。
接下来我们研究了Tax对拓扑关联域(TAD)的影响。为此,我们使用HiC-explorer管道评估TAD分离分数,该分数测量每个Hi-C矩阵中左右区域之间的分离程度。我们将两个边界之间的最小距离设置为50kb,并使用公开的CTCF结合位点来帮助识别假定的TAD边界(ENCFF895A0X)。我们的分析显示,对照细胞和Tax-expressing细胞共有3539个TAD,这表明样品之间的TAD边界基本上没有改变(图1克). 然而,我们观察到40.3%和23.4%的TAD分别在TAD内和TAD间有不同的染色质接触(图1小时). 值得注意的是,我们发现Tax-expressing细胞中TAD间接触在统计学上显著增加(单向方差分析,P(P)= 0.004; 图1I公司)表明Tax是宿主3D染色质结构的有力修饰剂。
分类诱导的3D染色质接触与基因表达和选择性剪接的变化相关
接下来,我们试图评估Tax诱导的3D染色质重塑的功能意义。包括CTL和Tax(+)细胞选择性剪接事件在内的基因表达谱已经发表(18). 使用严格阈值分析差异基因表达(DGE)(glm-adjustedP(P)-值<0.05,Log2-倍数变化≥0.6)和选择性剪接事件(ASE)(P(P)<0.01校正Fisher检验,ΔPSI≥0.05),我们发现523个基因的全基因表达发生改变,1104个基因在Tax表达时产生交替剪接转录物(图2安培). 共鉴定出1345个Tax-induced alternative剪接事件,主要由跳过的外显子(SE)组成(图2B型). 与之前发布的数据一致(18,23),在DGE和选择性剪接水平由TAX调节的基因填充不同的功能通路(补充图S3G),少数Tax调节基因(5%,23/523)在基因表达和剪接水平上都受到影响(图2安培)这表明,Tax-induced transcription和alternative剪接是两种不同的互补机制,它们在HTLV-1感染时深刻地修改宿主转录组。
图2。
分类诱导的3D染色质接触与基因表达和选择性剪接的变化相关。(A类)文氏图说明了在选择性剪接事件(AS)和差异表达(DGE)中受Tax表达影响的基因。基因表达阈值设置为log2fc=0.6,带P(P)-值<0.05(glm测试),Δpsi的有效阈值设置为5%P(P)-值<0.01(Fisher检验)。(B类)Tax表达式上发生的不同类型的AS事件(ASE)数。(C)接受选择性剪接修饰的基因与Tax差异表达基因的相对距离的Bedtools分析(reldist)。使用随机排列基因组hg19中基因组位置的床具洗牌功能生成控制集。(D类)维恩图显示了位于差异TAD中的Tax调节基因(DGE+ASE)的数量(图1小时). 采用超几何统计检验确定重叠的显著性。(电子)围绕CTL和TAX表达细胞中1604个TAX调节基因和1604个随机挑选的基因(1 Mb)的预期/观察信号堆积(箱子大小30 kb)。共使用100个中心像素来计算非对角堆积的富集度。(F–H)染色质接触的三倍4C分析证明CCNL1型(电子),第31B节(F类)和RFX2型(G公司),用作锚(VP代表视点)。显示CTL(蓝色)和Tax(+)(红色)条件下的基因表达水平。差异表达基因(DGE)和选择性剪接事件(ASE)在上述注释基因(hg19)和Tax中指定与显示CTL值。右侧面板显示高亮显示区域的缩放(蓝色)。4C分析的三个重复的标准偏差以灰色显示,星号表示4C信号的显著变化(P(P)-值<0.05,Fisher检验)。
我们检查了整个基因组中Tax调节基因的相对2D/线性分布,发现产生选择性剪接转录物的基因往往比预期的更靠近差异表达基因(图2摄氏度). 这表明,虽然p65/RelA驱动的选择性剪接和单个基因的启动子激活可能独立运行(18)这两种机制可能在局部和空间上相互关联。Tax调节基因(DGE+ASE)的坐标与表现出差异接触的TAD显著重叠(图二维)这使我们研究了Tax诱导的基因调控是否能与差异的3D染色质相互作用共存。为此,我们将不同的Hi-C接触矩阵与Tax调节基因的基因组坐标进行了交叉比较,发现大多数Tax调节基因似乎交织在一个高度互联的3D染色质接触网络中,该网络发生在顺式-染色体和跨染色体水平(补充图S4). 使用堆积分析来量化TAX调节基因的基因组位点之间的总体交互强度,我们证实了它们在CTL和TAX表达细胞接触物中的特异性富集,而在随机选择的基因中没有观察到这种富集(图第二版). 表达TAX的细胞接触富集分数略有增加,表明TAX可能加强其调控基因之间的一些相互作用。与此相一致,使用30kb的差异Hi-C矩阵,我们确定了73%的解除调控基因(包括DGE和ASE,1173/1604)分布在1451个差异3D染色质相互作用中(Log2FC≥0.5)(补充图S4). 其中,237个染色质接触涉及表达受影响的基因,与之前描述的基因组相互作用中心一致,该中心聚集了转录中共同调控的多个基因(34,35,39). 此外,1047个染色质接触涉及进行选择性剪接的基因,其中731个在空间上收集到差异表达的基因,这表明多基因复合物可能同时协调共同调控基因的转录和选择性剪接(补充图S4).
为了进一步改进这种Hi-C预测,我们进行了4C分析,以研究表达选择性剪接亚型的基因与同时被Tax在基因表达水平解除调控的远距离基因之间的物理相互作用。我们在基因中选择了三种不同的观点(4C诱饵)CCNL1号机组,第31B节和RFX2型,分别被确定为E4、E9和E18外显子选择性剪接的税务管制靶点(图2楼–H(H)) (18). 在三份4C分析中使用这些观点,我们能够确保染色质接触频率在每个实验条件下的不同重复之间保持可靠和一致(如图的右侧面板(灰线)所示2楼–H(H)). 表达Tax的细胞和对照细胞之间每个观点的接触景观的比较表明CCNL1号机组,第31B节和RFX2型与Tax上调的远端基因的交互频率较高。更具体地说,CCNL1号机组显示与PTX3系列位于下游295 kb,第31B节具有ABCC2型750 kb的距离,以及RFX2型具有FUT3(FUT3)位于268 kb下游(图2楼–H(H)). 总的来说,这些结果提供了令人信服的证据,证明Tax触发了涉及差异表达和/或选择性剪接调控的基因的长距离染色质相互作用。
税收诱导的NF-κB活化促进基因接触
由于之前的工作强调了NF-κB途径在Tax调节的转录和选择性剪接中的中心作用,我们假设该途径也可以促进上述3D染色质相互作用。因此,我们评估了特定基因亚群(包括NF-κB调节基因)是否在Tax产生的染色质相互作用中富集。3D染色质接触中发现的Tax调节基因(包括DGE和ASE)的基因本体分析确实表明TNF-α和NF-κB信号通路显著富集,而其余术语与包括HTLV-1在内的癌病毒感染有关(图3A级). 与此一致,对与染色质接触有关的启动子序列中转录因子基序的分析显示NF-κB基序显著富集(图第3页)这表明NF-κB信号传导、3D染色质结构改变和TAX反应的基因调控之间存在潜在联系。这些结果让人想起了以前的研究,这些研究报道了多基因复合物的形成,其中相互作用的基因在TNF-α刺激下被NF-κB特别激活(34,35). 因此,我们试图通过染色体构象捕获(3C)来评估这种NF-κB多基因复合物是否也出现在Tax表达细胞中。为此,我们开发了3C分析和反向PCR(IPCR)分析(无交联染色质)作为阴性对照。为了验证我们的方法并排除自由DNA片段结扎产生的假阳性产物,3C分析(而非IPCR分析)检测到了之前描述的TNF-α相关基因与SAMD4A型和一般合规H1基因(14号染色体上~0.3 Mb距离)(图3C公司) (34). 在表达Tax的细胞中也获得了类似的结果,表明Tax模拟TNF-α激活顺式-触点(图3C公司). 在两种实验条件下SAMD4A型-一般合规H1相互作用的同时SAMD4A型表达式(图3C公司,右面板),从而表明,如TNF-α所述,Tax促进多基因复合物的形成,其中基因在转录中受到协同调节。
图3。
3D基因组中的税收介导的变化涉及NF-κB应答基因的接触。 (A类)涉及3D染色质接触的Tax调节基因的基因本体(GO)分析(KEGG途径)。直方图表明某些基因集在Tax调节基因(DGE+ASE)中显著富集。(B类)使用ShinyGO分析Tax-expressing细胞中3D染色质接触基因启动子区的DNA模体富集。(C类)染色体构象捕获(3C)分析SAMD4A型和一般合规H1描述了24小时TNFα暴露或税务表达式。使用HindIII制备3C模板,并使用等重DNA进行PCR。将所得凝胶进行凝胶电泳和SYBR绿色染色。带的存在表明各引物目标之间的接触频率较高。内部SAMD4A型引物被用作负载控制扩增物。GAPDH公司引物用于扩增-GAPDH公司如前所述的循环(34). IPCR(逆PCR)作为3C实验进行,没有染色质交联步骤,用于排除HindIII-未消化片段的内掺提供的信号。3C产物在SYBR绿色染色的琼脂糖凝胶上进行分析。该图显示了来自三个独立实验的代表性3C和IPCR图像。右侧面板显示了TNFα暴露和Tax表达诱导的相对基因表达水平。(对于所有面板,星号对应于使用Fisher精确检验计算的统计显著性(p值阈值:*0.05,**0.01,***0.001,****0.0001)。(D类)缺乏NF-kB活化的Tax-WT和突变Tax-M22对小鼠骨髓基质干细胞基因表达水平的影响NFKBIA公司和RELA公司和关于跳过RELA公司外显子E6。(电子)半嵌套3C实验靶向设计NFKBIA公司和RELA公司黑色箭头表示用于半嵌套3C PCR的引物,灰色箭头表示RELA公司用于装载控制的引物。(F类)间染色质接触的半检测3C分析RELA公司和NFKBIA公司在CTL、Tax和TaxM22表达细胞中。在Sybr-green染色的琼脂糖凝胶中分析得到的3C产物。GAPDH公司引物用于扩增-GAPDH公司循环如图所示3C公司图中显示了三个独立实验的代表性3C图像。值得注意的是,由于半嵌套3C方法的数量限制,交互信号的明显“完全丢失”应被视为交互频率显著降低,而不是完全缺失。(G公司)dCas9-KRAB系在NFKBIA公司启动程序打开NFKBIA公司-RELA公司联络。半测试3C分析RELA公司和NFKBIA公司在用dCas9-KRAB表达载体以及表达四种gRNAs或其空对应物的载体横切的CTL和Tax-表达细胞中进行。在Sybr-green染色的琼脂糖凝胶中分析得到的3C产物。图中显示了来自三个独立实验的代表性3C图像。(H(H))dCas9-KRAB介导的对NFKBIA公司-RELA公司基因表达水平的联系RELA公司外显子的外显子跳跃RELA公司E6、。
基于TNF-α诱导11号和14号染色体间跨染色体接触的先前证据(34,35),我们进一步研究了这些接触是否也可能涉及Tax调节的基因。鉴于它们在NF-κB信号传导、病毒持续性和ATL发展中的关键作用,我们将注意力集中在NFKBIA公司(chr14:35870716–35873960)和RELA公司(chr11:65421067–65430443),分别编码抑制剂IκBα和NF-κB信号的效应器p65/RelA(68). 值得注意的是,在众多编码TAX蛋白成员的基因中,TAX蛋白与蛋白质相互作用,并且经常受到ATLL相关突变的影响(65,66),仅限NFKBIA公司和RELA公司发现于11号和14号染色体(68,69). RNA-seq数据显示NFKBIA公司在税务表述上受到了显著上调,而RELA公司基因表达没有显著变化,但在选择性剪接水平上受到外显子6的外显子跳跃的调节(补充表S3). 我们通过RT-qPCR分析在表达Tax的HEK细胞以及HTLV-1转化的C91PL细胞中证实了这些RNA-seq预测(图三维和补充图S5A). 值得注意的是,HEK细胞中p65/RelA的蛋白水平似乎不受Tax的影响,而IκBα的蛋白水平下调,这与Tax表达所描述的蛋白酶体降解相一致(补充图S5B) (70,71). 与野生型Tax相反,TaxM22的异位表达,一种缺乏NF-κB活化的突变,未能影响两者NFKBIA公司表达和RELA公司外显子跳跃(图三维)表明两种转录组事件都会影响NFKBIA公司和RELA公司对Tax的表达依赖于NF-κB的激活。
接下来,我们试图测试随之而来的放松管制NFKBIA公司和RELA公司对应于Tax表达后11号染色体和14号染色体之间的跨染色体接触增加。为此,我们开发了使用两种启动子的半嵌套3C分析RELA公司和NFKBIA公司作为锚(图第三方). 这种方法在Tax表达细胞中发现了一个PCR信号,表明RELA-NFKBIA公司触点,在控制细胞和表达TaxM22的细胞中缺失(图第三层). 相比之下,来自基因内片段的PCR信号没有变化RELA公司用作加载控制,以及从内部-GAPDH公司染色质环用作3C控制(34). 这些数据表明,Tax以NF-κB依赖性的方式诱导染色质在NFKBIA公司和RELA公司基因分别定位在第14和11号染色体上。通过3C分析对Hi-C数据的平行验证证实了TAX对涉及其他NF-κB敏感的脾调节基因的基因接触的NF-κ子B依赖性效应(18),例如CCNL1号机组,现金和我的cbp2(补充图S4和5C).
确定是否形成了一个涉及NFKBIA公司和RELA公司参与调节RELA公司我们的目的是检查RELA公司E6跳过受损细胞中的事件NFKBIA公司-RELA公司互动。为此,我们使用了dCas9-KRAB系统(72)已被确定为染色质接触的有效立体屏障(73),以中断NFKBIA公司和RELA公司基因。设计了四种不同的导向RNA,将dCas9-KRAB构建物连接到RELA公司-相互作用的基因组区域NFKBIA公司(图第三方). 定量ChIP(qChIP)实验证实了dCas9-KRAB在NFKBIA公司与无gRNA-实验比较时的目标(补充图S5D). 正如预期的那样,这与NFKBIA公司表达式(补充图S5D). 半检测3C分析表明,税收对RELA公司-NFKBIA公司在这些条件下,相互作用受到影响(图第三代移动通信). 系上dCas9-KRABNFKBIA公司启动子不干扰RELA公司但它显著降低了税收对RELA公司E6外显子跳跃(图3小时). 相比之下NFKBIA公司通过siRNA表达对跳过RELA公司E6在对照细胞和TAX表达细胞中表达,从而排除了IκBα对细胞选择性剪接的潜在影响RELA公司E6公司(补充图S5E、F). 与此一致,我们确定异位IκBα的过度表达对dCas9-KRAB的负作用没有影响(补充图S5G-H),表明税收引起的逃税损失RELA公司E6至dCas9-KRAB系留至NFKBIA公司可能是由于空间位阻,和/或潜在的转录机制改变NFKBIA公司,中断了NFKBIA公司和RELA公司而不是IκBα的细胞丰度降低。总的来说,这些数据将11号染色体和14号染色体之间的跨染色体接触定义为伴随的Tax-driven调控NFKBIA公司的表达和选择性剪接RELA公司抄本。
基因内p65/RELA占有率RELA公司导致RELA-NFKBIA公司触点和可选拼接RELA公司E6、。
根据我们之前的发现,基因组外显子的p65/RelA占据可以通过选择性剪接影响基因表达(18)接下来,我们进行了qChIP分析,以评估p65/RelA的染色质分布RELA公司和NFKBIA公司在包含或不包含Tax表达式的单元格中。如图所示4A级,税收导致p65/RelA对NFKBIA公司启动子,而它对RELA公司促销员入住率。这些数据反映了Tax对NFKBIA公司和RELA公司(图三维). 此外,我们还观察到RELA公司与对照细胞相比,Tax-expressing细胞的数量增加,表明外显子E6属于受p65/RELA调节的外显子亚群(图4A级). 此外,破坏NFKBIA公司-RELA公司在Tax-expressing细胞中与dCas9-KRAB的接触导致p65/RelA在NFKBIA公司启动子,基因组外显子E6的p65/RelA占有率显著降低,而对p65/RellA占有率没有显著影响RELA公司启动子(图4A级). 这些发现表明p65/RelA、选择性剪接和基因接触调控之间存在直接关系。
图4。
增强的外显子跳跃RELA公司E6和间染色质接触增加RELA公司和NFKBIA公司当p65/RelA募集到RELA公司. (A类)p65/RelA占用率的定量ChIP分析NFKBIA公司发起人,RELA公司启动子和基因组外显子E6RELA公司在带有或不带有Tax表达式的单元格中,并且有或没有中断NFKBIA公司-RELA公司通过dCas9-KRAB接触。直方图显示了相对于输入DNA的平均折叠富集,误差条表示SEM(B类)设计半巢式3C实验,用4种不同的gRNAs分析连接到RELA基因组外显子E6的表达dCas9-p65/RELA的细胞中NFKBIA-RELA的接触。(C类)dCas9-p65/RelA与基因组外显子连接的验证RELA公司根据HA标签和p65/RelA,通过qChIP执行E6。用HA-dCas9-p65/RelA的表达载体或表达HA-dCas9-empty的空载体(没有p65/RelA融合)转染HEK细胞。(D类)基因组的影响RELA公司E6-醚化dCas9-empty和dCas9-p65/RelA基因外显子跳跃RELA公司使用从表达HA-dCas9-empty或HA-dCas9-p65/RelA的细胞中提取的RNA进行RT-qPCR分析,并带有或不带有Tax表达。(电子)基因组外显子E6中连接的dCas9-empty和dCas9-p65/RelA对基因接触的影响NFKBIA公司和RELA公司如B组所示,在表达与基因组外显子E6相连的dCas9-p65/RelA的细胞中进行半检测3C实验。将具有和不具有Tax表达的细胞作为对照。图中显示了来自三个独立实验的代表性3C图像。对于所有面板,星号对应于使用费希尔检验评估的统计显著性(*P(P) < 0.05).
我们之前已经证明,p65/RelA在接近其基因组外显子靶点的地方实验性染色质富集可以有效地导致选择性剪接修饰(18). 为了进一步研究p65/RelA在选择性剪接和3D染色质接触中的作用,我们设计了与p65/RelA融合或不融合的dCas9构建体,以评估局部连接到基因组的p65/ReliA的作用RELA公司E6(图4B类). 与dCas9-empty结构体相比,我们使用qChIP分析验证了dCas9结构体与该区域的特异性连接(图4摄氏度). 在RNA水平上,这种dCas9介导的局部p65/RelA富集导致E6外显子跳跃(图4D(四维)),确认RELA公司E6是NF-κB反应性外显子。此外,半嵌套3C分析NFKBIA公司-RELA公司相互作用表明E6-醚化dCas9-p65/RelA足以促进基因-基因相互作用NFKBIA公司和RELA公司(图第4页). 通过基因对观察到可比较的结果PTX3系列和CCNL1号机组,它与TAX表达式交互,与PTX3系列CCNL1外显子E4的上调和增加的内含物(图2楼).CCNL1号机组E4被认为是NF-κB调节的外显子(18)CCNL1和PTX3之间的相互作用似乎取决于TAX激活NF-κB信号的能力,3C分析证明了这一点(补充图S5C). 根据观察NFKBIA公司-RELA公司基因对,靶向dCas9-p65的基因组区域CCNL1号机组E4诱导的基因接触CCNL1号机组和PTX3系列,以及CCNL1号机组E4类(补充图S6). 有趣的是,虽然TAX表达导致更多的CCNL1号机组E4类(18),将dCas9-p65连接到该区域导致外显子跳跃,从而表明TAX除了激活NF-κB信号传导外,还可能影响NF-κB驱动的剪接决定。总的来说,这些数据确定p65/RelA是多基因复合物形成的效应器,其中NF-κB应答基因在转录和选择性剪接水平的调节中进行协调。
讨论
三维基因组构象对基因调控至关重要,了解病毒如何操纵它可以揭示基因调控和细胞行为的基本原理。在这里,我们提供证据表明HTLV-1病毒癌蛋白Tax重塑了其宿主细胞的3D染色质结构。使用Hi-C和4C分析,我们发现Tax诱导的长程染色质相互作用频率、分区和TAD间相互作用的变化与差异基因表达和选择性剪接相一致。我们证明,基因-基因相互作用导致NF-κB活化时的协同剪接和转录事件。特别是,Tax-induced NF-κB活化诱导在表达水平调控的基因与在选择性剪接水平调控的其他基因之间的联系,如在NFKBIA公司和RELA公司、和PTX3系列和CCNL1号机组分别为。基因-基因相互作用的中断影响RNA水平上的外显子调控,而dCas9-p65/RelA的靶向基因内招募促进基因-基因交互作用和靶向外显子的选择性包含。值得注意的是,可以想象,TAX诱导的基因-基因接触的动态形成可能不限于NF-κB应答基因之间的直接相互作用,涉及更复杂和间接的相互作用,可能包括与基因调控无关的基因组区域。未来的研究应采用多重接触评估技术,如多重接触4C(MC-4C)(74),以更好地解决这一点。总之,我们的研究结果表明,p65/RelA在组装多基因复合物、协调NF-κB应答基因的转录和选择性剪接调控中发挥作用。这突出了一种通过NF-κB途径协调转录和转录后变化的新机制,并显示了HTLV-1 Tax如何影响将3D基因组构象与转录组多样性联系起来的分子机制。
已知许多细胞信号通路影响选择性剪接(75,76)除了对基因转录的影响。然而,负责微调细胞对刺激的反应的具体机制尚不完全清楚。在这种背景下,研究3D基因组构象的动力学已经揭示了多基因复合物形成在基因协同调控细胞信号传导中的重要性(34,35,40)其中,共转录基因之间的长程相互作用通过建立基因环之间的层次关系,帮助组织转录簇内的转录。根据我们的发现,我们提出了一个模型,在该模型中,Tax诱导的NF-κB活化导致p65/RelA在启动子和增强子处持续累积。如前所述,这一过程可能导致形成类似于转录中心的结构,组装NF-κB应答基因进行协调转录(34,35,40). 同时,基于相同的物理化学性质,与基因组外显子结合的p65/RelA基因可能被吸引到NF-κB工厂,而不会对其转录活性产生任何影响,因为其启动子处缺乏NF-κB因子。然而,这些多基因复合物可以为促进p65/RelA依赖的选择性剪接调控创造一个合适的环境。
因此,外显子靶向特异性和由此产生的剪接结果可能取决于p65/RelA蛋白-蛋白质相互作用组,其中各种RNA解旋酶的存在,如DDX17、DDX5、DHX9、DDX3X、G3BP1、DHX15、DDX1和DDX21,以及其他剪接调控因子,包括SF3B130(19)和FUS(22,77). 有趣的是,这些因子最近与调控剪接子网络有关,这些剪接子网与位于细胞核中心的基因相关,由富含GC的内含子-外显子单元组成(45). 这一观察结果与Tax启动的剪接事件的特征一致,剪接事件主要影响GC-rich外显子(18). 作为一个额外的层,splicing-associated chromarin signatures(SACS)已被证明在同一功能通路中潜在地向基因的前mRNA招募不同的剪接调控因子(78,79). 鉴于p65/RelA具有招募多种染色质重塑子和剪接因子的能力,因此它成为促进SACS的有力候选者。由于组蛋白修饰影响局部和全球3D基因组组织(80),p65/RelA可能是调控NF-κB活化的基因运动和剪接决定的复杂和相互关联机制的关键启动子。未来的研究应检查这些要点,重点描述p65/RelA相互作用组及其在3D基因组背景下选择性剪接调控中的作用。
尽管Tax诱导的NF-κB活化的长期效应已被广泛研究,但这种活化是否导致Tax特异性NF-κ子B应答基因的独特表达模式尚不清楚。我们的研究表明,Tax诱导的NF-κB活化导致基因-基因接触依赖性地调控细胞外显子E6的选择性剪接RELA公司在HEK和HTLV-1转化细胞中,导致缺乏E6的剪接亚型的表达。该亚型编码一个约44kDa的较短p65/RelA蛋白(p65/ReliAΔE6),与野生型对应物不同,它不会独立改变NF-κB应答基因的表达水平。然而,当Tax表达时,p65/RelAΔE6的异位表达似乎抑制第20页和BCL3级同时上调IL8号机组(补充图S5F–H). 这些发现表明NFKBIA-RELA公司Tax诱导的NF-κB激活后的接触允许产生RELA公司可能有助于精炼Tax激活特异性基因表达谱的剪接亚型。
最近的研究报告称,其他致癌病毒,包括人乳头瘤病毒(HPV)(81),EB病毒(82)和乙型肝炎病毒(HBV)(83),重塑宿主细胞基因组的3D结构,可能导致导致癌症发展的基因扰动的复杂机制。关于HTLV-1,其整合已被证明通过在前病毒CTCF结合位点和位于顺式(84). 有人提出,将HTLV-1前病毒整合到基因组区域中,该基因组区域通常占据细胞核中的转录抑制区,例如层相关结构域(lamina-associated domains,LAD),可能有助于HTLV-1感染细胞克隆的存活体内(85). 然而,一些与核纤层相关的基因启动子已被证明可以逃避转录抑制(86)这表明细胞核外围的调控更加复杂和动态。鉴于我们的研究结果,Tax可以促进长程染色质相互作用的变化,影响两者顺式-和反式-染色体区域,未来的研究应检查Tax表达突变如何影响前基因组接触的大小,以及它们对感染细胞克隆的克隆选择和HTLV-1相关疾病的发展的影响。
总之,我们的研究表明,HTLV-1病毒癌蛋白Tax重塑了其宿主细胞的3D染色质结构,影响基因-基因相互作用,并在NF-κB活化上协调转录和选择性剪接事件。这为3D基因组构象和转录组多样性之间相互作用的协调提供了新的思路,建立在我们小组和其他小组早期的工作基础上,这些工作证明了基因内染色质环在调节转录和选择性剪接中的作用(41,87–89). 我们的发现提出了一个问题,即类似机制是否与其他细胞信号通路有关,例如与TGFβ工厂相关的TGFβ,以及通过SMAD3:HNRNPE1轴进行剪接调控(34,90). 需要进一步研究以充分了解细胞信号通路、染色质结构、协调转录和选择性剪接调控之间的复杂关系,以及HTLV-1的影响。
数据可用性
4C、Hi-C和RNA-seq的原始数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中,并可分别通过GEO系列登录号GSE233887、GSE233888和GSE123752访问。
补充数据
补充数据可从NAR Online获取。
致谢
我们衷心感谢LBMC的劳伦特·莫多洛(Laurent Modolo)对生物信息建议的支持,以及里昂国家统计局(ENS de Lyon)的PSMN(科学与发展基金)对计算资源的支持。FM感谢ChloéJourno、Daniel Jost和Aurele Piazza的宝贵讨论和富有洞察力的评论。测序由IGBMC GenomEast平台执行,该平台是法国地名协会(ANR-10-INBS-0009)的成员。
基金
法律控制癌症(罗纳社区);ARC基金会[ARC PJA20151203399];国家情报局(INFLASPLICE);P.M.由法国高等教育和科学部的奖学金资助;Recherche Medicale基金会[FDT202106013082]和ANR INFLASPLICE;法律控制癌症杂志的J.L.、M.B.和L.B.A;由ENS-Lyon提供N.F;INSERM的T.S.、C.F.B、D.A.和F.M;Sexton实验室的工作得到了欧洲研究委员会(ERC)在欧盟地平线2020研究和创新计划下的资金支持[启动678624号拨款-染色体学]。开放存取费用的资金来源:CNRS。
利益冲突声明。未声明。
笔记
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©作者2024。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。