细胞毒性化疗对乳腺癌患者分子年龄标志物的影响

摘要

随着美国人口老龄化，预计从2010年到2030年，癌症新诊断的发病率将增加45%(1). 再加上治愈的癌症患者比例越来越高(2)，我们面临着一个新的挑战：大量老龄化癌症幸存者(三). 儿童和成人癌症的长期幸存者可能会出现严重的晚期后遗症，包括内分泌功能障碍、认知障碍、心血管疾病发病率、继发肿瘤和神经肌肉损伤(4–8). 对于化疗如何引起长期不良反应以及它是否改变生理衰老的速度，人们知之甚少。

人类衰老的特点是器官功能持续下降，导致生理储备丧失和虚弱(9). 这种功能丧失的特征是某些自我更新细胞的复制能力下降以及经历细胞衰老的细胞的积累(10,11). 细胞衰老是由肿瘤抑制机制的激活触发的，以应对各种细胞应激，如癌基因激活、组织损伤、端粒功能障碍和持续的DNA损伤。衰老与墨水4/ARF(CDKN2a公司)人类染色体9p21.3上编码p16的基因座^INK4a公司和ARF抑癌蛋白。一些证据表明衰老会影响哺乳动物的衰老：1）第16页^INK4a公司随时间老化呈指数增长(12–14)并导致某些细胞类型的复制能力降低(15–19)；2） 衰老调节因子的调节多态性（例如，CDKN2a公司和TERT（地形）)通过无偏见的全基因组研究，已将其与许多与年龄相关的疾病联系起来，如癌症、肺纤维化、动脉粥样硬化和II型糖尿病(20)；和3）减少小鼠衰老细胞产生或增加其清除率的治疗可改善某些与年龄相关的表型(21–23).

由于衰老和衰老之间的密切联系，细胞衰老的标志物，包括白细胞端粒长度（LTL）、衰老相关（SA）细胞因子如白细胞介素6（IL-6）的表达，以及INK4a/ARF公司转录物被测试为分子老化的潜在生物标志物。在对人群进行的几项研究中，LTL的降低与年龄顺序和促进年龄增长的压力因素（如吸烟）有关(24–26). 衰老细胞产生大量有效的细胞因子（即衰老相关的分泌表型）(27)，促进促炎组织微环境。据报道，SA-细胞因子（如IL-6）的表达随着年龄增长而增加，并可预测年龄相关的发病率和死亡率(28–32). 最近第16页^INK4a公司，在较小程度上农业研究基金外周血T细胞（PBTL）被描述为衰老的生物标志物。使用第16页^INK4a公司实验表明，吸烟、缺乏运动和慢性人类免疫缺陷病毒感染会加速PBTL室中分子年龄生物标志物的表达(14,33). 鉴于DNA损伤剂的明显长期毒性，我们试图确定具有治疗目的的细胞毒性化疗是否会加速人类的分子衰老。

方法

患者

人体研究由北卡罗来纳大学机构审查委员会批准（08-0823；09-2344）。所有患者在接受任何与研究相关的程序之前均出具书面知情同意书。佐剂队列（LCCC0810）(图1A)由美国癌症联合委员会第6版新诊断的女性组成(34)I至III期乳腺癌计划接受新辅助化疗或含蒽环类辅助化疗。女性在治疗前同意在化疗前接受静脉切开术，化疗后立即计数恢复，以及3个月和12个月定期就诊。排除既往有盆腔放射或克隆性骨髓疾病的患者。

图1。

队列组件。辅助队列LCCC0810的配偶图(A类)显示每个时间点的可评估患者数量。39名女性同意参与。39名患者中有6名没有基线样本的结果。这六项不能包括在配对分析中；因此，分析队列由33名女性组成，她们的基线结果是可用的。所有33名女性至少收集了一份治疗后样本。14人在治疗后的所有时间点都有结果，11人错过了一个时间点，8人错过了两个时间点。幸存者队列LCCC0924的配偶图(B类)显示210例可评估患者中有34例因分选或RNA失败而被排除在外（参见补充方法，在线提供）。AC=阿霉素和环磷酰胺。

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幸存者队列（LCCC0924）(图1B)由50岁及以上的女性组成，她们有手术切除I至III期乳腺癌的病史。接受化疗的患者需要在化疗结束后至少3个月内登记。接受内分泌治疗的患者在治疗3个月后符合条件。排除患有复发性癌症、克隆性骨髓疾病或预期寿命低于12个月的女性。在获得同意时，从幸存者队列中的女性中获取了一份单一样本。两组女性均接受了标准的化疗方案或机构审查委员会批准的临床试验中的治疗。根据临床需要进行标准的胸壁放射治疗和辅助性激素治疗。通过患者问卷评估健康行为和人口统计学。从病历中提取病史和治疗信息。在每个时间点，收集一个薰衣草（EDTA）试管（5-10mL），并立即放在冰上。分子和血清学分析由不了解患者数据的研究人员进行，收集临床信息的研究人员在数据收集完成之前不了解实验室结果。

分析INK4a/ARF公司表达、端粒长度和SA-细胞因子表达

分析第16页^INK4a公司和农业研究基金CD3中的表达⁺PBTL按说明执行(14,33). 简言之，在采集当天，使用抗CD3微球和AutoMACS分离PBTL^{赞成的意见}分离器（Miltenyi Biotec，加利福尼亚州圣地亚哥）。制备总RNA和cDNA(14,33)其次是TaqMan定量逆转录聚合酶链反应第16页^INK4a公司（外显子1alpha-exon 2；自定义订单ID:AII1L5T；Life Technologies USA，Carlsbad，CA）或自动射频（外显子1beta-exon 2；自定义化验单ID:AIKAKB1；美国生命科技公司）18秒内务基因（订单号4352655；美国生命科技公司）。使用这种方法，由于排序失败、核酸产量不足、RNA质量差或未能通过数据复制过滤器，佐剂队列中15.4%的样本和存活队列中16.2%的样本未能通过分析(图1; 另请参见补充方法，在线提供，了解详细信息）。样本分析失败的患者与纳入任一队列的有结果的患者之间的年龄没有统计学上的显著差异。的表达式第16页^INK4a公司随着报告小鼠的衰老，按照描述对其进行分析（另请参见补充方法，在线提供）(35).

在辅助队列中，对化疗前和化疗后12个月收集的患者血清进行衰老相关细胞因子和LTL的分析（在没有12个月样本的3名患者中，使用3个月样本）。血管内皮生长因子A（VEGFA；研发系统DVE00，明尼阿波利斯，明尼苏达州）、IL-6（研发系统LUH206）、白介素7（IL-7；研发系统HS750）、白细胞介素8（IL-8；研发体系LUH208）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP1，也称为趋化因子CCL2；研发系统DCP00）的分析采用酶联免疫吸附试验。只有三名患者在化疗前后检测到IL-6；因此没有进一步分析。如前所述，通过Southern分析测量LTL(36).

p16INK4a在报告小鼠中的表达

所有小鼠研究都是根据北卡罗来纳大学动物护理和使用委员会批准的方案进行的。如Burd等人(35)被连续安置在北卡罗来纳大学LCCC鼠标一期单元。对32只雌性小鼠进行年龄测定（6周、23周、55周和73周）和成像。这在该队列的不同组小鼠中重复了五次。使用IVIS LUMINA成像系统对动物进行成像（马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默）。图中显示的是注射荧光素后8分钟进行的2分钟曝光。有关完整方案，请参见Burd等人(35).

统计分析

简言之（参见补充方法，在线提供，了解更多详细信息），因为第16页^INK4a公司和农业研究基金随着年龄的增长，表达呈指数增长(14,37)，结果进行对数转换。对于佐剂队列INK4a/ARF公司使用Wilcoxon符号秩检验、秩和检验和Kruskal–Wallis检验对从基线检查到治疗后各时间点的表达、SA-细胞因子和LTL进行总体和跨年龄层的比较。因为每个女性至少有一个治疗后样本，为了最大化样本量，我们使用了平均治疗后样本第16页^INK4a公司和农业研究基金表达测试临床因素与表达变化幅度的相关性。在幸存者队列中，第16页^INK4a公司对所有患者进行了两次测量。我们没有为每个患者任意选择一个单一或平均值，而是假设批次内的测量值不是独立的，因此，考虑到这种非依赖性，我们使用多变量重复测量模型来评估临床因素和第16页^INK4a公司表达式。自动射频在单个批次中测量表达，并通过线性回归分析。预测第16页^INK4a公司根据先前治疗的年龄以图表形式显示。在这两个队列中，年龄、种族和关键临床因素与第16页^INK4a公司对表达进行评估。辅助队列的结果如所示补充表1（在线提供）。在幸存者队列中，很少有临床因素与表达相关；因此，只有在统计学上与表达显著相关或具有关键临床相关性的因素被纳入多变量模型。数据由H.K.Sanoff、A.M.Deal和J.G.Ibrahim使用SAS版本9.2（SAS、Cary、NC）和STATA版本12（StataCorp、College Station、TX）进行分析。为了量化化疗的增龄效果第16页^INK4a公司比较化疗诱导的表达与时间老化对第16页^INK4a公司在先前发表的独立队列中的健康献血者中(14,35).

所有统计显著性检验均为双侧检验。P（P）0.05或更低的值被认为具有统计学意义。

结果

为了验证化疗加速体内细胞衰老激活的假设，我们测量了两组接受治疗的乳腺癌女性中衰老标记物的表达。

前瞻性辅助队列由33名女性组成，中位年龄为49岁（范围=32-69）(表1;补充表1，在线提供）。尽管近一半的女性肥胖（体重指数≥30kg/m），但这些女性几乎没有合并疾病²; n=15；45.5%). 大多数（29名）女性接受了佐剂阿霉素、环磷酰胺和紫杉烷。大多数女性（n=27；81.8%）以剂量密集的方式接受佐剂阿霉素和环磷酰胺(38). 基线第16页^{印度航空公司}和农业研究基金在这个年龄范围狭窄的小样本中，表达与年龄无关(补充表1，在线提供）。

在辅助队列中，化疗导致两组患者在统计学上显著且持续上升第16页^{印度航空公司}和自动射频所有治疗后时间点的表达(图2;补充表2，在线提供）。的表达式第16页^INK4a公司只有一名患者因化疗而减少，后来发现该患者患有先天性p53缺陷（Li-Fraumen综合征；参见补充方法，在线提供）。在整个队列中，对数的中位数增加₂第16页^{印度航空公司}0.81的表达（四分位范围[IQR]=0.28–1.62；Wilcoxon符号等级P（P）<.001）和日志中₂农业研究基金0.89的表达（IQR=0.29–1.27；Wilcoxon签名等级P（P）<.001）。从非对数转换的角度来看，这反映出第16页^INK4a公司和农业研究基金分别是。使用小鼠报告系统(补充图1，在线提供）和之前对正常人类志愿者的研究(14,35)，我们注意到第16页^INK4a公司与物种寿命相关的衰老表现。在健康献血者的独立队列中，log₂第16页^{印度航空公司}平均每年增加0.055个单位（或每年4%）(14,35). 因此，PBTL的增加第16页^INK4a公司与乳腺癌辅助化疗相关的表达相当于随着14.7年的年龄增长而增加。

图2。

化疗引起的第16页^INK4a公司和农业研究基金在前瞻性佐剂队列中的表达。平均值(点)95%置信区间(虚线)第页，共页第16页^INK4a公司(A类)和日志2农业研究基金(B类)从预处理到治疗后三个时间点：化疗后即刻计数恢复，化疗后3个月和12个月。log2显示了单个患者从预处理（Pre）到平均治疗后（post avg）值的变化第16页^INK4a公司（中位数变化=0.81；四分位范围[IQR]=0.28–1.62；Wilcoxon签名等级P（P）<.001）(C类)和日志2农业研究基金（中位数变化=0.89；IQR=0.29–1.27；Wilcoxon签名等级P（P）< .001) (天). 所有统计检验都是双向的。

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细胞毒性化疗也增加了体内其他衰老标志物的水平。两种SA-细胞因子VEGFA和MCP1/CCL2的血浆浓度(27,39)与化疗前样本相比，化疗后VEGFA中位数为118对80 pg/mL，Wilcoxon标记秩P（P）= .001; MCP1/CCL2中位数=166 vs 117 pg/mL，Wilcoxon标志性等级P（P）< .001). 其他衰老标志物的表达（如IL-7、IL-8和LTL）(补充图2，在线提供）化疗后无统计学显著变化。这些数据表明，细胞毒性化疗增加了PBTL中转录衰老标记物的表达，以及两个明确描述的衰老激活分泌标记物的血清学水平。

我们还考虑了其他治疗相关因素对PBTL变化的影响作为次要终点第16页^INK4a公司通过细胞毒性化疗表达。辅助性胸壁放疗（n=25）和紫杉烷使用（n=29）均与第16页^INK4a公司表达，尽管考虑到患者人数较少，需要谨慎行事。剂量密集型（每2周一次）化疗与log的增加有关₂第16页^{印度航空公司}每3周服用一次佐剂阿霉素和环磷酰胺（中位数=1.13 vs 0.32；Wilcoxon秩和P（P）= .04) (补充图3，在线提供）。在第16页^{印度航空公司}在经历3级和4级血液毒性的女性中观察到表达，而在没有严重血液毒性的妇女中则观察到表达（中位数=1.31 vs 0.57；Wilcoxon秩和P（P）= .07). 这些结果表明，更密集的化疗和更严重的骨髓抑制与造血组织分子年龄的更大加速有关。

考虑到统计上显著的归纳第16页^INK4a公司化疗后1年内(图2A)，我们检查了细胞毒性化疗对第16页^INK4a公司独立横断面幸存者队列中稍后时间点的表达(图1B和表1). 在176名可评估的乳腺癌幸存者中，69人（39.2%）接受了辅助化疗。在这个队列中，吸烟、共病和体重指数与第16页^INK4a公司表达式。年龄与第16页^INK4a公司表达式，带有估计值第16页^INK4a公司翻倍的时间为16.7年（即log2每年增加0.06个单位第16页^INK4a公司; 重复测量模型P（P）< .001). 在调整后的分析中，log2第16页^INK4a公司化疗组女性的表达水平高0.57（重复测量模型P（P）<0.001）比未接受化疗的女性患者多。与健康献血者独立队列中的增加相比[每年0.055(14,35)]，这一增长相当于10.4年的时间老化(图3).农业研究基金在生存队列中，表达与先前的化疗使用无统计学显著相关。在辅助队列中，胸壁放射治疗和辅助性激素治疗与第16页^INK4a公司表达式(补充表3，在线提供）。由于该队列中的患者距离化疗完成时间中位数为3.4年（有些患者距离治疗时间长达18年），这些结果表明第16页^INK4a公司化疗后观察到的表达在化疗暴露后至少持续数年，如果不是无限期的话。

图3。

的表达式第16页^INK4a公司和农业研究基金横断面生存队列中的年龄和既往化疗暴露。日志2第16页^INK4a公司(A类)和日志2农业研究基金(B类)根据接受辅助治疗的情况，在每个年龄段。点表示三个批次中每个患者的平均值。线表示化疗治疗的预测值(红色)和非化疗治疗(蓝色)根据患者的重复测量结果建立模型。日志2第16页^INK4a公司化疗组患者与非化疗组患者相比，差异有统计学意义（重复测量模型P（P）< .001). 日志2自动射频化疗组患者与非化疗组患者相比，差异无统计学意义（线性回归模型P（P）= .10). 所有统计检验都是双向的。

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讨论

我们已经证明，辅助性乳腺癌化疗导致细胞衰老的分子标记物显著增加，包括CDKN2a公司以及两种衰老相关细胞因子的血清学水平。在这些前瞻性随访的接受标准辅助化疗的患者中第16页^INK4a公司和农业研究基金辅助性阿霉素和环磷酰胺化疗后，T细胞表达增加，与正常年龄的14.7年相比(14,35). 更具侵略性的剂量密集化疗方案和更大的血液毒性与更大的细胞衰老标记物体内诱导相关。化疗对第16页^INK4a公司在一个长期乳腺癌存活者的独立、横断面队列中证实了这种表达。总之，这两项分析的结果表明，辅助性细胞毒化疗可持久促进乳腺癌患者细胞衰老标记物的表达。

本研究的主要局限性是依赖于只能在外周血中容易检测的标记物。尽管两组数据均显示第16页^INK4a公司全身化疗后的表达，我们只能得出结论，化疗促进CD3中衰老标记物的表达⁺淋巴细胞。与年龄相关的增长第16页^INK4a公司表达发生在多种哺乳动物组织腔室中(补充图1，在线提供）（另请参阅[12,13,35,40)]然而，与年龄相关的变化幅度因组织隔室而异，其对诸如热量限制等改变衰老的干预措施的反应也是如此(13). 同样，化疗后衰老相关细胞因子增加的组织来源尚不清楚。因此，尚不确定衰老相关细胞因子或第16页^INK4a公司造血隔室中的表达可以作为全身器官年龄的代表，我们的数据并没有说明化疗对非造血隔室的促衰老作用。

我们能够再次证明乳腺癌化疗导致PBTL持续增加第16页^INK4a公司但我们无法显示化疗对LTL和IL-6的影响。这两种生物标志物都被广泛研究为衰老生物标志物，在大人群中进行测量时，其在整个生命周期中都会发生明确的变化（LTL减少，IL-6增加(24–26,41). 然而，这两种分析都不适合个人风险预测：同年龄个体的绝对水平/长度差异很大，并且在个体的生命周期内绝对变化相对较小(24,32,41–43). 对LTL的纵向研究表明，尽管在研究期间，15%至20%的前瞻性随访人群显示端粒伸长，但预计每年长度将减少25至45个碱基对(41). 在接受化疗的患者的研究中也观察到了这种变化(44,45). 随着时间的推移，个体LTL的广泛变化与粒细胞集落刺激因子可能通过上调端粒酶增加LTL的发现一致(46,47)表明LTL不太可能是化疗对分子衰老影响的可靠生物标志物。此外，其他研究表明，在多种癌症细胞系和小鼠模型中，化疗诱导的细胞衰老与端粒长度和端粒酶活性无关，这表明LTL是化疗诱导衰老的一个不良标志物(48)]。同样，IL-6在这方面也不是最理想的，因为基线表达较低，但显示出与年龄无关的与昼夜变化和病毒感染及其他应激源诱导有关的实质性混杂(32,49). 我们相信第16页^INK4a公司由于PBTLs的表达具有很大的动态范围（约为人类寿命的16倍变化）、简单且低成本，并且与时间年龄密切相关，因此作为体内衰老诱导的诊断标记物提供了新的潜力(R（右）²按时间顺序排列的年龄约为0.6第16页^INK4a公司LTL或IL-6的vs<0.2）(14,26,41,42).

根据小鼠分析，我们认为PBTL增加第16页^INK4a公司表达可能反映造血干细胞的遗传损伤(17,50)但也可能反映胸腺环境受损(21)或直接损伤自我更新的胸腺后T细胞(18). 以蒽环类药物为基础的辅助化疗明确地挽救了生命，显著降低了27%的乳腺癌复发和21%的死亡相对风险(51). 因此，我们认为，蒽环类和烷基化剂的持久增龄作用的发现必须与这些已知的复发风险益处进行权衡。连续测量患者分子年龄标记物的能力可能提供了一种方法，以确定不太“老化”的有益辅助方法。例如，这些结果表明，剂量密集型治疗可能导致更大的长期血液损伤，而紫杉烷可能与较低的长期风险相关。进一步研究更直接地量化辅助治疗的每个组成部分对某些已知长期后遗症的作用，可能会使治疗决策更加平衡，并可能会更多地针对低风险癌症使用较少衰老的治疗方案。

总之，我们已经表明，细胞毒性化疗能够有效地诱导体内血液室中细胞衰老标记物的表达，与健康献血者独立队列中10至15年时间老化的效果相当。我们目前正在进行两项前瞻性试验：一项评估是否改变PBTL第16页^INK4a公司表达是各种化疗方案急性毒性的生物标志物（LCCC1027，NCT01305954）；第二项专门针对老年患者，评估经验证的老年评估和PBTL的组合第16页^INK4a公司用于预测治疗相关毒性和功能变化（NCT01472094）。虽然这一分子老化生物标记物的临床应用有待进一步研究，但我们已经表明化疗加速了乳腺癌幸存者造血室的分子老化。

基金

这项工作得到了国立卫生研究院的支持（K07CA106722 to HKS；AG024379 to NES）；保罗·格伦基金会（NES）；Burroughs Wellcome基金（NES）；以及乳腺癌研究基金会（致HM和LAC）。

研究赞助商在研究设计中没有任何作用；数据的收集、分析和解释；手稿的撰写；以及提交手稿供出版的决定。

J.Krishnamurthy和N.E.Sharpless是北卡罗来纳大学拥有的与本研究相关的专利的共同发明人（US PCT/US2005/034542“通过检测INK4a/ARF表达来确定分子年龄”）。

我们要感谢Christin Burd、David Darr和北卡罗来纳大学LCCC小鼠一期单位在动物处理和LCCC生物统计学核心方面提供的帮助。

2011年美国临床肿瘤学会会议（Muss HB、Krishnamurthy J、Alston SM等）部分介绍了幸存者队列的数据。临床肿瘤学杂志. 2011;29（补充）：摘要9002）。

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