中的变体MRPS14型（uS14m）导致围产期肥厚型心肌病，伴有新生儿乳酸酸中毒、生长迟缓、畸形特征和神经系统受累

摘要

线粒体翻译功能障碍是人类疾病的一个日益重要的分子病因，但线粒体核糖体亚基的结构缺陷十分罕见。我们使用下一代测序法鉴定线粒体小核糖体蛋白14中的纯合子变体(MRPS14，1400万美元)一名患者表现为围产期肥厚型心肌病、生长迟缓、肌肉张力减退、乳酸升高、畸形和精神发育迟滞。患者骨骼肌和成纤维细胞的呼吸链复合体IV存在生化缺陷。在成纤维细胞中，线粒体翻译受损，野生型的异位表达MRPS14型cDNA在功能上弥补了这一缺陷。令人惊讶的是，突变uS14m是稳定的，不影响小核糖体亚基的组装。相反，uS14m突变的结构模型预测了核糖体mRNA通道的破坏。总之，我们的数据表明MRPS14型可表现为围产期发作的线粒体肥厚性心肌病，具有一种新的分子致病机制，在翻译伸长或线粒体mRNA募集而非组装过程中损害线粒体核糖体的功能。

介绍

线粒体含有自己的基因组，并保留着固有的噬菌体/类细菌复制和翻译机制。线粒体基因组（mtDNA）需要表达13种蛋白质，以产生功能性呼吸系统和ATP合成酶，实现氧化磷酸化。在过去的十年里，破坏线粒体蛋白质合成功能的基因突变已被鉴定为人类疾病。令人惊讶的是，在线粒体大小核糖体亚基的82个结构亚基中，几乎没有发现这些突变(1). 线粒体翻译缺陷导致异常广泛的临床表型。大多数患者表现出严重的早发临床症状，通常会导致致命后果(2). 这些基因缺陷通常导致呼吸链的联合缺陷或孤立的复合IV缺陷，表现为多器官或组织特异性(三). 目前，无法解释氧化磷酸化缺陷表现出如此特殊的临床异质性的分子基础。

人类线粒体核糖体是一个55S颗粒，由两个亚基组成，一个小28S亚基和一个大39S亚基。线粒体小核糖体亚基（SSU）由一个12S核糖体RNA分子（rRNA）和30个核编码线粒体核糖体蛋白（MRPs）组成，而大亚基（LSU）包括16S rRNA和52个核编码MRPs以及任一tRNA^苯丙氨酸或tRNA^瓦尔(4–7). 这两种核糖体完整性和功能所必需的rRNA均由线粒体基因组编码。线粒体核糖体（mitoribosome）的许多蛋白质亚单位与细菌的对应物具有结构同源性，但80个MRP中有35个不具有线粒体基因表达的线粒体进化过程中获得的哺乳动物线粒体核糖体特异性(8,9). 尽管最近在理解有丝分裂核糖体结构方面取得了进展，但单个亚单位在蛋白质合成中的功能仍然鲜为人知(4,10).

这里我们报告了MRPS14型编码MRPS14，是婴儿进行性精神发育迟缓、恶病质、肌张力减退、肥厚性心肌病、乳酸升高和复杂IV缺乏症的新病因。此外，我们提供了生物化学和蛋白质建模数据，提供了MRPS14在有丝分裂体上的作用信息。

结果

患者病史

这位女性先证者是土耳其远亲父母的第一个活孩子。这位母亲患有反复发作的抑郁症。父亲经历了一次横纹肌溶解症发作，随后血浆肌酸激酶（CK）值波动，尽管临床完全恢复。这位母亲在妊娠10至12周期间有两次自然流产。由于严重肥厚性非致密性心肌病和女性胎儿宫内发育迟缓，第三次妊娠在妊娠第24周终止。该指数患者在妊娠35周时胎膜早破后剖腹产。低出生体重（1460克；<3%）归因于胎盘功能不全。Apgar评分在1/10/10分钟时为3/6/8，该儿童因呼吸功能不全被送入新生儿重症监护室。产前超声检查怀疑患有肥厚型心肌病，左心室中度肥厚，收缩力轻度受损。

代谢检查显示血清乳酸（5-7 mmol/L，正常范围<2 mmol/L.）和丙氨酸中度升高。有机酸、酰肉碱、游离肉碱、肝转氨酶、氨、肌酐、全血细胞计数和肌酐磷酸激酶反复正常。4个月大时，这名儿童因严重的胃食管反流而在家中发生急性危及生命的事件，入院治疗。乳酸再次轻微升高。心脏病检查显示Wolff–Parkinson–White综合征，平均心率为140/min。临床评估证明全身性肌张力减退、发育不良、认知和运动发育迟缓；这个脑电图是正常的。

患者骨骼肌样本的呼吸链（RC）酶活性分析显示线粒体复合物IV缺乏，降至对照组平均值的44%，而其他RC复合物未受影响(补充材料，图S1). 肉碱、核黄素、硫胺素、维生素C和辅酶Q的支持治疗应用了几个月，没有明显的阳性反应。尽管高热量饮食，患者仍无法茁壮成长。在病毒感染或发烧期间，该儿童反复出现急性恶化，乳酸升高，代谢性酸中毒和不良状态。然而，从2岁起，患者的临床状况稳定下来，她的生长速度开始加快。她的精神运动发育有所改善，她在3.5岁时学会了走路和说话。肥厚型心肌病保持稳定，无临床问题；未观察到室上性心动过速发作。

目前，患者在5岁时可以自由行走。她有一些畸形的特征，包括倒转的低耳(图1A). 然而，她仍然有肌肉张力减退，不太突出。她的语言技能在不断提高，尽管还没有达到这个年龄的标准。通过五次健康食品喂养，辅以高热量饮料，她的体重增加和生长速度现在与第三个百分位持平。她的心电图显示无室上性心动过速的预激模式，3D散斑追踪显示基底下外侧区和外侧区轻度节段性运动障碍，与左心室外侧壁的副束一致。超声心动图显示无结构异常，心肌病已完全缓解。其他功能参数，包括3D体积测定和应变分析，均在正常范围内。组织和脉搏波多普勒测量显示舒张功能正常。

下一代线粒体外显子测序显示隐性纯合子MRPS14型病人的突变

我们利用下一代线粒体测序进行分子遗传学研究(11). 靶向线粒体外显子方法分析了1476个编码线粒体相关功能蛋白质的核基因序列。数据分析导致在MRPS14型外显子3中的（NM_022100），c.322C>T（综合注释依赖性衰竭（CADD）评分8.03）(图1B和C).MRPS14型考虑到亲缘关系，是唯一符合隐性纯合性状的候选基因。任何数据库（ExAC、gnomAD）中均未报告此变体(12). c.322C>T转变的功能影响有八个致病性计算结论（DANN、GERP、LRT、MetaLR、MetaSVM、突变评估器、突变品尝器和PROVEAN[列在(13)]). 通过Sanger测序对该变体进行了确认。携带者分析表明，父母双方都是c.322C>T变异体的杂合携带者(图1C). 人类MRPS14型编码一个128氨基酸长的蛋白质，该蛋白质是有丝分裂核糖体SSU的结构成分。预计c.322C>T变异体会将高度保守的精氨酸在uS14m的108位转变为半胱氨酸(图1D). 总的来说，我们的数据与c.322C>T一致MRPS14型变异是患者临床表现的潜在致病原因。

患者成纤维细胞线粒体呼吸减少和多呼吸链复合物缺乏

接下来，我们分析患者的成纤维细胞，以测试c.322C>T变异体是否具有致病性并破坏线粒体蛋白合成。天然呼吸复合物的蓝色凝胶电泳分析显示，组装的氧化磷酸化复合物同时缺乏，CI和CIV几乎无法检测到，CIII和CV显著降低(图2A). 稳态线粒体呼吸蛋白显示呼吸复合物亚基水平下降，其中复合物I和IV的亚基含量大幅下降(图2B). 与对照组相比，纯核编码复合物II没有显著降低(图2B). 多呼吸链缺乏的这些变化也反映在基础水平的耗氧量上，ADP依赖性明显不足复合IV依赖性呼吸活性降低(补充材料，图S2A)线粒体结构部分扭曲(补充材料，图S2B)但与对照组相比，患者细胞线粒体质量无变化(补充材料，图S2C). 为了确认线粒体疾病的病因，我们探索了线粒体小（SSU）和大（LSU）核糖体亚基的稳态水平，以评估核糖体完整性。有趣的是，当我们评估线粒体小（SSU）和大（LSU）核糖体亚单位的稳态水平时，我们发现患者的MRPS14水平增加，而所有被测的SSU（MRPS10、MRPS18B、MRPS27）和LSU（MRPL11、MRPL37、MRPL44）亚单位与对照组相比保持不变(图2C)，表示c.322C>T变量MRPS14型不会影响SSU的装配。

c.322C>T变体MRPS14型不影响核糖体组装或12S rRNA稳定性，但对线粒体翻译至关重要

为了评估整个有丝分裂核糖体的组装状态并确认MRPS14插入SSU，进行了蔗糖梯度分析。对MRPS18B的研究揭示了对照组和患者成纤维细胞中有丝分裂核糖体成分的特异性和可比性分离(图3A). 与对照组相比，在SSU和单体组分中均发现MRPS14，提示插入了野生型（WT）和突变蛋白(图3A). 与患者相比，LSU亚基MRPS27和LSU亚单位MRPL23和MRPL44的探测没有变化，表明患者细胞中的有丝分裂核糖体完好无损。

与对照组相比，稳态mtDNA转录水平的Northern分析显示12S rRNA没有减少，这表明SSU不稳定或装配缺陷(图3B，量化补充材料，图S3A). LSU相关的16S rRNA和ATP8/6 mRNA相对于总RNA没有变化(图3B;补充材料，图S3A). 定量PCR证实了这些发现(图3C). 12S rRNA的可比量支持突变MRPS14不会损害SSU的组装或稳定性的结论。然而，MRPS14在小的有丝分裂核糖体亚单位的组装或稳定性中的作用以及对特定mRNA翻译的影响尚不清楚。迄今为止，线粒体核糖体亚单位中报告的突变导致蛋白质不稳定，继而导致线粒体核糖体及其相关rRNA的不稳定或组装缺陷(14–20). Western blot分析表明突变的MRPS14蛋白是稳定的，表明它被插入到有丝分裂核糖体中并直接干扰线粒体翻译过程，而不是影响有丝分裂核糖体的组装或稳定性(图2C).

直接测试c.322C>T变量MRPS14型确实损害了线粒体翻译；我们通过代谢标记成纤维细胞中的线粒体翻译产物³⁵S标签。脉冲标记显示，与对照组相比，患者的成纤维细胞中普遍存在线粒体翻译缺陷[³⁵S] -met/cys掺入显著减少(图3D和电子). 由于线粒体核糖体的明显稳定性，我们进行了一项追踪实验，以排除对任何线粒体翻译蛋白的特定翻译相互作用或修饰，从而导致不稳定性增加，然而，这并没有显示特定产物的任何完全转换(补充材料，图S3B). 沉默MRPS14并没有导致MT-CO1稳态水平降低，这表明野生型（WT）有丝分裂核糖体的残留量足以维持其水平(补充材料，图S4). 总之，这些结果表明MRPS14型据报道，变异体严重抑制患者成纤维细胞的翻译效率，而不影响一般SSU组装(21)-将MRPS14添加到SSU本身或55S单体组件。

模拟MRPS14（uS14m）在55S核糖体上的假定作用

人有丝分裂核糖体起始复合物的最新高分辨率低温电子显微镜（EM）结构(22)允许我们调查R108C突变的假定结构影响。这种结构特别有趣，因为它可以仔细评估这种残基的位置，并将其整合到含有tRNA和mRNA的翻译起始复合体中(4,23). uS14m是SSU头部的一部分，与MRPS24和uS10m形成簇，类似于细菌对应物（bS6m和uS12m除外）。线粒体特异性N末端氨基延伸（NTE）和C末端氨基酸延伸（CTE）是31个SSU亚基中15个亚基（bS6m和uS12m除外）的独特特征，与细菌对应物同源。它们具有不同的长度，并可能形成溶剂相互作用位点。uS14m的NTE位于溶剂侧，uS10m的NTE和CTE也位于溶剂侧。有趣的是，uS14m位于与LSU接口处小核糖体亚单位的mRNA入口通道中(图4A). 在这种结构中，R108和tRNA反密码子之间的距离大于30º(图4B). 患者中受影响的氨基酸R108的侧链一边与SSU核糖体蛋白uS10m相互作用，另一边与12S rRNA残基A579的糖磷酸骨架相互作用(图4C). 因此，R108占据了连接12S rRNA和核糖体蛋白uS10m的关键位置。位置108的半胱氨酸可能会破坏这两种相互作用，从而可能导致mRNA通道或核糖体解码中心的构象改变(图4D). 这种模型与我们的发现一致，即在患者成纤维细胞中，只有线粒体翻译伸长或线粒体mRNA募集被破坏，而不是线粒体核糖体的组装。

野生型MRPS14型挽救患者细胞呼吸链缺陷和线粒体翻译缺陷

直接测试c.322C>T变异体在MRPS14型，我们克隆了WT和变体MRPS14型慢病毒表达系统的cDNA。两者都有MRPS14型cDNA被转导到患者和对照组的成纤维细胞中。过度表达WTMRPS14型患者成纤维细胞中的cDNA补充了MT-CO1和MT-CO2的稳态蛋白水平以及线粒体翻译(图5A). 相反，在患者背景中过度表达突变未能挽救线粒体蛋白质合成的缺陷(图5A)令人惊讶的是，R108C突变体在对照成纤维细胞中的过度表达产生了显性阴性表型，降低了MT-CO1和MT-CO2的丰度(图5A). 为了证实这些发现，代谢³⁵在相同的转导成纤维细胞系中进行S脉冲标记(图5B). 正如被挽救的稳态MT-CO1和MT-CO2水平所表明的那样，线粒体翻译能力在过度表达WT的患者细胞中得到补充MRPS14型cDNA(图5B).

这表明突变蛋白被组装到核糖体中，对线粒体蛋白质合成至关重要。总之，这些数据支持c.322C>T的致病性MRPS14型突变是患者氧化磷酸化生化缺陷的潜在原因。

讨论

在这里，我们报告了一种新的致病性突变MRPS14型表现为围产期线粒体肥厚性心肌病。致病作用得到了以下支持：（1）家族中的分离，（2）突变位点的高度保守性和基于模型的核糖体内相互作用中突变严重影响的预测，（3）患者的临床和细胞表型模仿其他线粒体核糖体缺陷的表型，以及（4）WT蛋白过度表达对生化缺陷的功能补充。这是首次报道的不影响有丝分裂核糖体组装或稳定性的致病性线粒体核糖体缺陷，证明有丝分裂核糖体允许并入突变蛋白，相反，在翻译伸长或线粒体mRNA募集期间破坏了有丝分裂糖体的功能。

大约80个核糖体蛋白被组装到线粒体55S核糖体中，令人惊讶的是，很少有与人类疾病相关或被认为可能致病(表1). 这表明许多潜在突变非常严重，导致早期胚胎死亡。与这一假设相一致的是，该家族有反复流产的历史。此前，人类疾病与MRPS2型(24),MRPS7型(11),MRPS16型(12),MRPS22型(13,14),MRPS23型(15)和MRPS34型(14)线粒体核糖体小亚单位及其突变物料需求计划3(16),物料需求计划12(17)和MRPL44型(18)编码大核糖体亚单位的蛋白质。这些缺陷通常与新生儿肥厚性心肌病有关，与我们的患者类似。然而，目前患者及其兄弟姐妹的胎儿表现是报告的最早表现之一，类似于丙氨酸tRNA合成酶缺陷(30).

临床上，线粒体核糖体缺陷患者常伴有肥厚型心肌病，我们的患者伴有精神发育迟滞、肌肉张力减退、畸形和乳酸中毒的神经特征。线粒体蛋白合成缺陷普遍破坏了氧化磷酸化所需的13个mtDNA编码亚基的合成，但与广泛的异质性临床表现有关(表1). 所有报告的有丝分裂核糖体亚单位缺陷病例都在儿童早期出现，并且往往是致命的。然而，一些人可以存活到婴儿关键年龄后，心脏表型明显稳定(20). 我们的患者也有同样的自然史。心脏组织可以通过何种分子机制来补偿严重的线粒体翻译缺陷尚待发现。

报道的线粒体SSU缺陷导致蛋白质不稳定，并导致小28S核糖体亚基组装受损和12S rRNA减少，如果组装期间未并入SSU，12S rRNA就会降解(15,17,19,27,31). 我们发现突变的MRPS14是稳定的，强烈支持突变蛋白插入到有丝分裂核糖体中，而不影响总核糖体组装或其稳定性。然而，突变的患者有丝分裂核糖体可能缺乏组装不必要的亚单位，也可能不在蔗糖梯度上分解。MRPS14的完全消融是否会导致SSU组装或稳定性缺陷尚不清楚。令人惊讶的是，突变MRPS14蛋白的过度表达复制了患者的生化结果。然而，患者细胞中MRPS14稳态水平的增加是否是一种代偿效应，尚无法确定，突变型和WT MRPS14的比率也无法确定。因此，我们将突变MRPS14的这种显性加性效应归因于其过度表达。虽然杂合子父母是亚临床的，但父亲出现了一次横纹肌溶解症发作和不同的异常CK值，表明可能存在部分显性阴性效果。

我们的蛋白质模型预测MRPS14位于核糖体的核心功能中心mRNA通道中，与mRNA和12S rRNA密切接触MRPS14型有助于无领导的线粒体mRNA向核糖体的募集和引导，并导致翻译效率受损。这种功能与患者成纤维细胞中检测到的功能缺陷很好地对应，成纤维细胞能够产生翻译产物，但效率严重降低。

畸形特征在线粒体疾病中很常见，在其他SSU基因突变的患者中也有描述，但这导致了他们在发育中有额外作用的假设。此外，据报道，MRP有助于细胞凋亡和细胞增殖的调节，甚至与肿瘤相关(32–36). 我们不能排除这种额外功能对患者表型的影响。然而，我们的数据表明MRPS14型对于高功能线粒体翻译机制和氧化磷酸化至关重要，这两个基本功能足以解释患者的主要临床表现，包括心肌病。

我们报告MRPS14型作为一种新的导致线粒体肥厚性心肌病的基因，具有畸形特征和神经系统受累，可能导致受累胎儿的致死表型。

材料和方法

OXPHOS分析

如前所述，在骨骼肌匀浆的线粒体中进行OXPHOS复合物的活性测量（通过600xg离心造粒的上清液）(37). 根据Birch-Machin，使用UV-1601描述的分光光度计（德国汉堡岛津）在保持在30°C的1ml样品试管中分光光度法测量个人呼吸链复合体的活性和用作标记酶的柠檬酸合成酶（CS）的活性(20). 通过测量存在和不存在特定抑制剂时复合物活性水平的差异来确定数值，如别处所述，用与标记酶CS（mU/mU CS）的比率表示(22). 对没有生化和临床怀疑线粒体紊乱的患者进行肌肉活检作为对照。

DNA提取

根据制造商的说明，使用Prepito DNA Blood600试剂盒从患者及其父母的EDTA血液中提取DNA（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的PerkinElmer）。以EDTA血中提取的DNA为模板制备northern印迹探针。

线粒体转录定量

使用Qiagen（德国希尔登）miRNA试剂盒提取培养细胞中的RNA，包括DNA酶消化步骤。为了使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒（ThermoFisher，Waltham，MA，USA）生成cDNA，使用了2μg总RNA。在CFX96 Touch qPCR系统（Biorad，Hercules，CA，USA）上，使用IQ SybrGreen试剂盒（Biorad-Hercules-美国）对cDNA进行实时定量PCR扩增。相对表达归一化为β-actin或18S rRNA，补充材料，表S1).

文库准备、定向测序和数据分析

通过MitoExome面板进行下一代测序(11). 简单地说，根据制造商的协议，使用Covaris M220聚焦超声仪（Covaris，Brigthon，United Kindgom）将1μg基因组DNA剪切成约300 bp的片段。根据制造商的说明，使用Kapa Library preparation Kit（瑞士巴塞尔Kapa Biosystems）进行文库制备。在溶液捕获中，使用（瑞士巴塞尔罗氏NimbleGen）捕获1476个基因的目标区域（MitoExome）。对HiSeq2000（Illumina，San Diego，CA，USA）进行了总共150 bp的配对测序。使用CLC Genomics Workbench v7.0.3（CLCbio，Qiagen，Hilden，Germany）进行序列数据分析，以读取人类参考基因组GRCh38/hg19的比对、局部重组和变异调用。排除了内含子、同义、覆盖率<20且次要等位基因频率（MAF）>1%的变异，保留了非同义变异，这些变异被预测为有害（PolyPhen）、有害（SIFT）或MAF≤1%的未知后果。

分子遗传学

中优先纯合子变体的分析MRPS14型通过Sanger测序进行。第3外显子MRPS14型（NM_022100）使用基因组DNA作为模板进行扩增，并使用BigDye Terminator v3.1化学（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在ABI Prism 3500XL遗传分析仪上进行测序。用SeqAnalysis 6（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）和Sequence pilot v4.3（JSI Medical Systems，Ettenheim，Germany）分析序列数据。

细胞培养

在DMEM（1X）+含有1 g/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸钠的谷氨酸MAX-I（Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）中培养来自患者和对照受试者皮肤活检的原代成纤维细胞培养物，并补充10%胎牛血清（FBS），非必需氨基酸（Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素（Gibco，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），10μg/ml金霉素（Sigma，赫尔辛基，芬兰）和2μmol/L尿苷，37°C和5%CO₂.

RNA分离和northern印迹

根据制造商的方案，使用QIAgen RNeasy Kit（德国希尔顿市QIAgen）从原代成纤维细胞分离RNA，包括无RNase DNA酶消化步骤，以去除污染DNA。如前所述，已进行了Nothern blot分析(36). 简言之，用1.5%变性琼脂糖/甲醛凝胶分离RNA（10μg），并在20X SSC中通过毛细管转移将其转移至0.45μm Hybond-N+硝化纤维素膜（Amersham，GE Healthcare，Chicago，IL，USA）。RNA在紫外线交联剂（UV-Stratalinker 1800，Strategene，San Diego，CA，USA）中共价结合到膜上并进行杂交。根据制造商的建议，使用PNK用γ-ATP对北部印迹探针进行最终标记。在60°C下，在0.5%SDS中剥离膜，并在4°C下保存，直到预杂交。

克隆和基于慢病毒的互补

使用单标记cDNA作为模板扩增WT和突变MRPS14，包括Nhe公司我渴望克隆。扩增的RT-PCR产物被克隆到慢病毒载体pLVEF1a-MCS-IRES-Puro（Biosettia，San Diego，CA，USA）中，以使用Nhe公司我对MCS进行了定位，并通过测序进行了验证。通过用嘌呤霉素（1 ug/ml）筛选转导的成纤维细胞产生稳定的细胞系。按照一般方案进行转导。

SDS和蓝色天然物和蛋白质测定

使用蛋白酶、磷酸酶抑制剂片（ThermoFisher、Waltham、MA、USA）和原钒酸钠，通过放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液提取总蛋白。使用Bradford分析测定蛋白质浓度。使用4–20%梯度凝胶通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜。用5%[w/v]牛奶在含1%[v/v]吐温20（TBST）缓冲液的Tris缓冲盐水中封闭斑点1 h，并在4°C下以1:1000稀释度在1%[w/v]牛奶中培养抗体过夜。用于西方分析的抗体有MT-CO1（ab14705）、MT-CO2（ab110258）、SDHA（ab14715）、ATP5A（ab14748）、NDUFA9（ab14713）、UQCRFS1（ab4746）VDAC（ab15895）Vinculin（ab129002）（均来自英国剑桥Abcam）、MRPS14，MRPL11（15543-1-AP）、MRPL23（11706-1-AP）、MRPL44（16394-1-AP）、MRPL37（15190-1-AP）（均来自英国曼彻斯特Proteintech）TOM20（sc-11415，美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯）。

如前所述，天然线粒体复合物由洋地黄素固体化的月桂基麦芽糖苷处理的成纤维细胞制备而成(38). 简单地说，在蛋白酶抑制剂的存在下，将收获的细胞溶解在5 mg/ml洋地黄中，使洋地黄与总蛋白的比率为0.8，在1×PBS中（ThermoFisher，Waltham，MA，USA）。然后将溶解的细胞制成颗粒，再悬浮在1.5米氨基己酸，75 m米双三pH 7.0，10 mM EDTA，用1%[w/v]月桂基麦芽糖苷处理，以释放呼吸复合物。将10–30 ug富含线粒体的蛋白质在4–16%Bis-Tris凝胶（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）上分离5 h，然后转移到PVDF膜上。将封闭的膜依次与MT-CO1（ab14705）、SDHA（ab14715）、ATP5A（ab14748）、NDUFA9（ab14713）和UQCRC2（ab14745）（均来自英国剑桥Abcam）孵育过夜，并使用适当的二级HRP抗体进行化学发光检测。

线粒体翻译产物的脉冲标记

按照说明进行脉冲标记(36). 简单地说，成纤维细胞在35毫米培养皿中生长，达到60-70%的融合率。去除生长培养基，用补充丙酮酸钠的无蛋氨酸/半胱氨酸培养基（Gibco，Life technologies，Carlsbad，CA，USA）替换生长培养基并在37°C下预先培养30分钟，然后贴标签。细胞在补充有10%透析FBS（Gibco，Life technologies，Carlsbad，CA，USA）和1min的无met/cys-free培养基中培养6分钟米添加放射性标记混合物之前，丙酮酸钠在0.5μg/ml艾美汀（Sigma，赫尔辛基，芬兰，E2375）或100μg/ml茴香霉素（Sigma-赫尔辛基、芬兰，A9789）存在下抑制细胞质翻译。对于脉冲标记，200μCi/ml[³⁵S] 将-met/cys（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）加入培养基中并孵育30分钟。细胞在生长培养基和1×PBS中洗涤，然后进行胰蛋白酶化，通过离心收集并在含有1 mM PMSF（Sigma，赫尔辛基，芬兰）和无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche，巴塞尔，瑞士）的1×PBS中重新悬浮。对于追逐标记，30分钟后洗涤细胞，并在正常生长培养基中孵育3小时，之后洗涤并收获细胞。根据制造商的方案（Biorad，Hercules，CA，USA）进行Bradford分析以确定蛋白质浓度。将30μg总蛋白提取物在12%聚丙烯酰胺凝胶上以20mA的电流分离2h。凝胶在考马斯染色液中染色（1 g考马斯亮蓝在40%[v/v]甲醇、10%[v/v]冰乙酸、3%[v/v-]甘油和47%[v/v]H中₂O） 过夜并在脱色溶液（40%[v/v]甲醇、10%[v/v]冰乙酸、3%[v/v-]甘油和47%[v/v]H）中脱色₂O） 持续2小时。使用583型真空凝胶干燥机（Biorad，Hercules，CA，USA）在60°C下干燥凝胶2小时，然后暴露于荧光屏中至少24小时。使用FLA-7000 Typhoon扫描仪（美国伊利诺伊州芝加哥GE Healthcare）对荧光成像屏幕进行成像，并使用Chemidoc成像系统（美国加利福尼亚州Hercules Biorad）对总蛋白进行成像。

蔗糖梯度

已按照其他说明准备好蔗糖梯度(36). 简单地说，将1 mg蛋白质加载到16 ml 10–30%不连续蔗糖梯度上，并在22 000×g下分离16 h。收集24个组分，蛋白质经TCA沉淀。随后的样品通过SDS-PAGE进行分析。

免疫组织化学、荧光和电子显微镜

通过与Mitotracker CMXRos孵育进行线粒体染色（ThermoFisher，Waltham，MA，USA）在全培养基中培养15分钟。更换培养基，将细胞在培养箱中完全更换10分钟。细胞用1×PBS冲洗两次，并在冰镇丙酮中固定3分钟，然后安装在VectaShield（Vector Laboratories，Peterborough，UK）。如前所述进行免疫荧光显微镜检查(39). 样品在蔡司观测器2.1上与ApoTome（德国奥伯科钦卡尔蔡司）一起成像。在显微镜软件中调整图像对比度。如前所述进行电子显微镜检查(40). 简单地说，细胞生长在13mm盖玻片上，用2%GA固定在磷酸盐缓冲液中，包埋、切片并成像。

统计分析

所有统计分析和图表均使用PRISM 7.0ab（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行。使用FIJI（ImageJ v.2.0.0）或使用ImageLab 5.2.1（Biorad，Hercules，CA，USA）的western blot化学发光信号强度进行定量。学生的t吨-测试用于计算统计显著性P（P）-值<0.05被认为是显著的(^*P（P） ≤ 0.05,^**P（P） ≤ 0.01.^***P（P） ≤ 0.001).

致谢

我们感谢参与这项研究的家人。我们感谢Tuula Manninen提供的出色技术援助以及赫尔辛基大学生物技术研究所和功能基因组（FuGu）中心的电子显微镜部门提供的服务。

利益冲突声明。未申报。

基金

这项工作得到了瑞士国家科学基金会（CJ）、诺华医学生物学研究基金会（CF，AS）的支持；芬兰科学院和Sigrid Jusélius基金会。

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