线粒体外frataxin对细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1开关的分子调控

线粒体蛋白frataxin不能产生正常水平导致遗传性退行性疾病Friedreich共济失调（FRDA），这是一种以渐进性步态不稳定、心肌病和糖尿病高发为特征的综合征。Frataxin是一种铁结合蛋白，参与铁硫簇（ISC）的生物生成，是一种修复基团，可实现氧化磷酸化、酶催化和基因调控等基本细胞功能。虽然一些证据表明，氟他嗪在线粒体室中起着铁螯合物的作用，但我们最近证实，在各种人类细胞类型中存在成熟氟他嗪的功能性线粒体外池。在这里，我们证明了一个类似的蛋白水解过程产生成熟的线粒体和线粒体外frataxin。为了解决人类线粒体外兄弟蛋白的生理功能，我们寻找ISC依赖的相互作用伙伴。我们证明，frataxin的线粒体外形式直接与细胞溶质乌头糖/铁调节蛋白-1（IRP1）相互作用，IRP1是一种通过“铁-硫开关”机制在酶和RNA-结合功能之间交替的双功能蛋白。重要的是，我们发现FRDA细胞中发生的细胞溶质顺乌头酸酶缺陷和随后的IRP1激活可通过线粒体外frataxin的作用逆转。这些结果为细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1开关的控制提供了新的见解，并扩展了有关FRDA分子发病机制的现有知识。

简介

Frataxin是一种铁结合蛋白，在从蛋白菌到人类的进化过程中严格保守(1). 虽然不同的证据表明氟他嗪参与细胞内铁稳态(2)，该蛋白的主要功能仍不明确。Frataxin缺乏明显导致铁硫簇（ISC）和血红素生物合成缺陷，进一步影响线粒体铁超载、线粒体呼吸受损、ATP生成降低、氧化损伤和应激诱导的细胞凋亡增强(三). ISC依赖蛋白在细胞代谢的几个方面发挥着重要作用，包括呼吸电子传递、酶催化和DNA修复(4,5). 对酵母模型的研究表明，ISC的生物生成需要大量蛋白质来催化这一过程(4). 中心成分是那些参与ISC在线粒体内支架蛋白上瞬时组装的成分。Isu1/ISCU在所有真核生物中充当支架蛋白(6). 半胱氨酸脱硫酶Nfs1/ISCS与Isd11蛋白一起提供硫部分(7,8). 虽然合成ISC所需的铁来源还不太明确，但一些数据支持这样的观点，即frataxin是反应的铁供体(9,10). 在酵母中，ISC生物合成似乎只发生在线粒体中。这一假设意味着线粒体是构建所有细胞ISC蛋白所不可或缺的，这导致了这样一种建议，即预先形成的ISC通过ISC出口机械运输到线粒体外，最后通过胞质ISC组装（CIA）机械插入线粒体外靶点(4). 目前对哺乳动物细胞线粒体外ISC的生物发生知之甚少。参与输出和细胞溶质组装的酵母蛋白同源物存在并在人类中起作用(11–13). 此外，ISCU中心成分的线粒体外亚型(14)、NFU(15)和ISCS(16)已在人类细胞中鉴定出。因此，线粒体外ISC的哺乳动物生物发生显示出与酵母模型的部分相似性，但这些途径可能由基本区别指定。

在人类中，frataxin缺陷的一个范例是退行性疾病Friedreich共济失调（FRDA）。FRDA是一种常染色体隐性单基因疾病，以进行性步态不稳定、协调性丧失、肥厚性心肌病和糖尿病发病率增加为特征(17). 在几乎所有的患者中（95-98%），这种疾病是由FXN基因第一内含子内GAA三联体重复序列的纯合超扩增引起的(18)，导致编码的frataxin蛋白表达降低(19). 人类frataxin合成为一种23kDa前体蛋白，需要线粒体内的N末端蛋白水解过程才能转化为功能成熟形式(20). 尽管最初被认为是一种仅限于线粒体基质的蛋白质(19)，我们和其他人最近证实在不同的人类细胞类型中存在成熟的frataxin线粒体外池(21–23). 线粒体外frataxin是一种功能相关蛋白，因为它的表达直接抑制转化细胞系的凋亡，并保护FRDA患者的淋巴母细胞免受应激诱导的细胞死亡(22). 越来越多的证据表明，线粒体frataxin通过提供亚铁（Fe²⁺)以生物可利用的形式。体外和体内研究证明，frataxin与参与ISC生物发生的几种蛋白质相互作用：支架ISCU/Isu1(9,24)，监护人GRP75(25)和衔接蛋白ISD11(25). 此外，线粒体frataxin与含ISC的酶铁螯合酶物理结合(26)，琥珀酸脱氢酶(27)和线粒体乌头酸酶(28,29). 与ISC依赖蛋白的直接相互作用揭示了frataxin在调节其伴侣活性中的另一个作用，线粒体顺乌头酸酶的保护/重新激活证明了这一点(28).

在这项研究中，我们提供了线粒体外frataxin在细胞质室中的生理作用的证据。我们首先描述了人类细胞中产生的线粒体外frataxin的氨基末端。我们的结果表明，线粒体外frataxin与成熟的线粒体frataxin相匹配。此外，使用联合免疫沉淀法，我们发现线粒体外frataxin直接与ISC依赖的细胞溶质乌头酶/铁调节蛋白-1（IRP1）双功能蛋白相互作用。重要的是，我们证明了FRDA患者细胞中的细胞溶质顺乌头酸酶缺陷和随后的IRP1激活可以通过线粒体外frataxin恢复。我们的研究结果表明，frataxin在调节细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1活性中具有直接作用。

结果

线粒体加工产生线粒体外联体蛋白

我们之前报道了野生型frataxin cDNA在人类细胞中的表达^1–210，FXN（FXN）^1–210)编码210氨基酸前体蛋白，生成成熟产物，不仅定位于线粒体内，也定位于细胞质内(22). 这种亚细胞分布与强制表达无关，因为内源性线粒体外frataxin在原代细胞和肿瘤细胞系中都可以检测到(21–23). 为了更好地表征线粒体外frataxin，我们利用稳定表达FXN的Flp-In-293细胞^1–210前面描述过(20)（图1A、 左侧面板）。FXN的稳定表达^1–210结果主要是成熟线粒体产物的积累，由Lys80和Ser81（FXN）之间的蛋白水解裂解产生^81–210;20). 此外，亚细胞分馏显示上述细胞制备的胞质部分中存在线粒体外形式(20). 稳定表达FXN的HEK-293细胞^1–210然后用于鉴定线粒体外frataxin的N末端。为此，制备了高纯度的细胞溶质组分，并通过western blot分析进行了检查。从线粒体级分中回收的成熟frataxin与从胞质级分中获得的线粒体外形式共存（图1A、 右侧面板）。为了排除组分的交叉污染，使用线粒体基质MnSOD和细胞质微管蛋白作为对照。通过额外的线粒体和细胞溶质标记物的分析进一步证实了亚细胞组分的纯度(补充数据). Frataxin从上述细胞溶质组分中免疫沉淀，在SDS–PAGE上溶解，并进行顺序Edman降解。如图所示1B所获得的N末端序列是S-G-T-L-G-H，与之前在线粒体加工产生的成熟frataxin的N末端鉴定的相同残基相对应。总之，这些结果表明线粒体外蛋白是FXN^81–210多肽和一种类似的蛋白水解过程解释了成熟的线粒体和线粒体外frataxin。

线粒体外frataxin与细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1蛋白的物理相互作用

为了阐明线粒体外frataxin的生理功能，我们研究了其参与细胞溶质ISC的调节。为此，我们在人类细胞中寻找线粒体外frataxin的相互作用伙伴。鉴于线粒体frataxin能够通过调节其ISC依赖性酶活性，充当与线粒体顺乌头酸酶相互作用的铁环，我们推断其胞质对应物之间可能存在相应的相互作用。为了确定线粒体外FXN和细胞溶质乌头酶/IRP1是否具有相同的亚细胞定位，用线粒体外FX293瞬时转染HEK-293细胞^81–210与Myc-tagged IRP1（Myc-IRP1）结合，并通过免疫荧光显微镜进行分析。正如预期的那样，这两种蛋白主要位于细胞质中。合并后的图像显示了它们的共同定位，如黄色区域所示（图2A） ●●●●。为了测试线粒体外frataxin和胞浆乌头酶/IRP1之间可能的相互作用，我们采用了联合免疫沉淀法。用空载体（EV）、FXN瞬时转染HEK-293细胞^1–210或线粒体外FXN^81–210与Myc-IRP1一起使用。为了避免Myc-IRP1过度表达引起的人工交互作用，HEK-293细胞被转染相应数量的构建物，导致表达水平降低(补充数据). 用抗frataxin单克隆抗体免疫沉淀转染细胞的细胞提取物，抗Myc免疫印迹分析显示Myc-IRP1的共纯化（图2B） ●●●●。相反，如抗frataxin免疫印迹分析所检测到的，Myc-IRP1与抗Myc的免疫沉淀导致了frataxin的共纯化（图2C） ●●●●。在这两种情况下，免疫沉淀的阴性对照都不允许检测到上述蛋白质（图2D） ●●●●。值得注意的是，在这两种情况下，在没有frataxin过度表达的情况下，这种相互作用是明显的，这表明内源性线粒体外frataxin足以结合转染的Myc-IRP1。FXN中的交互作用略有增加^1–210-转染细胞，并且在转染frataxin的情况下其增强^81–210（FXN^81–210). 为了进一步描述相互作用，我们检查了FXN之间的结合^81–210细胞溶质乌头糖酶受酶的ISC的调节。我们产生了一种突变蛋白（IRP1 C437S），该蛋白缺乏负责簇协调的关键半胱氨酸。该突变体缺乏顺乌头酸酶活性，仅显示RNA结合活性(30,31). 如图所示三免疫沉淀和双向免疫印迹分析表明，IRP1中C437S取代的存在强烈抑制了与线粒体外frataxin的相互作用。

这些数据共同表明FXN^81–210可以直接与线粒体外室中的细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1相互作用。

线粒体外frataxin拯救细胞溶质顺乌头酸酶活性

众所周知，frataxin表达减少决定了线粒体和细胞溶质乌头酶活性的当代损失(32,33)，由两个不同基因编码的两种ISC查询酶(34). 为了研究线粒体外frataxin和胞质乌头酶/IRP1之间相互作用的功能意义，我们寻找frataxin定位和乌头酶活性之间的功能关系。为此目的，从FRDA患者中获得的frataxin缺乏的淋巴母细胞被EV、FXN稳定地重组^1–210或线粒体外FXN^81–210（图4A） 并测定总蛋白和亚细胞蛋白提取物中乌头碱的活性。为了评估这两种乌头酶的状态，使用了两种独立的活性测定。通过分光光度分析监测亚细胞组分中的酶活性（图4B和C），以及总裂解物，通过天然凝胶分析（图5). 正如预期的那样，FRDA淋巴母细胞的线粒体和细胞溶质提取物显示，与来自患者健康兄弟的对照淋巴母细胞相比，顺乌头酸酶活性显著不足（图4和5). FXN重建的FRDA细胞中线粒体顺乌头酸酶被挽救^1–210但在FXN重组的FRDA细胞中不能显著恢复^81–210（图4B和5B） ●●●●。另一方面，尽管FXN重组FRDA细胞中的细胞溶质乌头糖被挽救^1–210，在用FXN重组的FRDA细胞中更有效地解救^81–210凝胶内分析完全证实了这一发现（图5). 此外，由于天然凝胶内分析允许同时显示这两种活性，我们可以量化细胞溶质酶相对于总乌头酶活性的相对贡献。我们计算出，细胞溶质顺乌头酸酶占EV-重组FRDA淋巴母细胞中细胞总顺乌头酸酶活性的～16%。对这两种同工酶活性的同时影响并没有显著改变FXN中的这一比例^1–210-重建FRDA细胞，而用FXN重建^81–210将细胞溶质活性的百分比提高到总活性的～30%，主要是由于细胞溶质酶的特异性增强（图5B） ●●●●。这些结果表明，线粒体外frataxin可以直接影响细胞溶质乌头酶的酶活性。

线粒体外frataxin调节IRP1的RNA结合活性

细胞溶质乌头酶的酶活性和IRP1的RNA-结合活性是同一蛋白质的两个相互排斥的功能。4Fe–4S簇的存在允许其作为顺乌头酸酶的酶功能，而这种辅因子的完全丧失触发其mRNA结合能力(35). 因此，我们分析了FRDA淋巴母细胞对IRP1的铁反应元件（IRE）结合能力。如之前报道的FRDA患者细胞(36,37)以及人类细胞模型的frataxin耗竭(33)我们发现，与健康对照组相比，FRDA淋巴母细胞显示IRP1活性增加（图6A） ●●●●。RNA带移分析表明，FRDA和对照细胞之间IRP1表达水平没有任何变化，IRPs结合活性显著增加，这是根据在体外β-巯基乙醇活化和western blot研究（图6A） ●●●●。在这个带移分析中，人类IRP1和IRP2共存。IRP2是另一种IRE结合蛋白，它不是ISC依赖的蛋白，其活性通过蛋白质降解进行调节。为了排除IRP2的贡献，因此分析了对照细胞和FRDA细胞中的蛋白质表达水平。Western blot分析显示IRP2水平相等，从而证实上述FRDA淋巴母细胞中IRP1-结合活性的唯一激活（图6A） ●●●●。然后，我们进行了实验，以检查线粒体外frataxin对IRP1激活的影响。用EV、FXN稳定重建的FRDA细胞提取物^1–210或FXN^81–210通过RNA带移和蛋白质印迹分析（图6B） ●●●●。RNA带移显示FXN中IRPs结合活性显著降低^1–210-重组FRDA细胞与相应的EV重组FRDA电池进行比较（图6B） ●●●●。这种效果与FXN中观察到的效果没有区别^81–210-重组FRDA细胞（图6B） 证明线粒体外frataxin对IRP1状态的特异作用。IRP活性的降低不能用IRP1表达水平的改变来解释在体外β-巯基乙醇活化和western blot研究（图6B） 与线粒体外frataxin功能性地将IRP1转化为其胞浆乌头糖形式的事实一致。此外，western blots证实IRP2蛋白水平没有改变（图6B） ，排除了IRP2的贡献。总的来说，数据表明人类frataxin的线粒体外形式在细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1开关中起着关键作用。

讨论

在过去的几年里，对frataxin功能的理解迅速增长(三). 因此，FRDA的病理生理缺陷变得更容易理解，从而可以设计新的治疗方法(38–40). 然而，这种蛋白质的分子功能主要是在线粒体生理学方面进行研究的。哺乳动物细胞中frataxin的亚细胞定位目前仍存在争议。最近，在几种人类来源的细胞类型中检测到了成熟frataxin的线粒体外池(21–23). 我们证明线粒体外frataxin的过度表达可以保护frataxin-缺乏细胞免受应激诱导的凋亡(22). 此外，不同细胞系中野生型frataxin前体的强制表达导致大量产生不存在于线粒体室中的frataxin形式(20,22). 引人注目的是，在微孢子虫寄生虫中人毛滴虫frataxin的主要池位于细胞溶质中，它由有丝分裂体而不是线粒体组成(41). 与线粒体frataxin相反，对线粒体外frataxin的生物发生和功能知之甚少。最近对线粒体成熟过程的分析使我们首次确定了人类活细胞中产生的成熟frataxin的14kDa活性形式(20). 在本研究中，我们努力表征成熟的线粒体外形式。从活细胞纯化的线粒体外frataxin的Edman降解表明，该形式具有始于Ser81的氨基末端。获得的N末端序列与之前在线粒体加工产生的成熟frataxin的N末端中确定的序列相对应(20). 这些结果表明线粒体和线粒体外亚型都是相同的FXN^81–210多肽。因此，我们的数据支持一种观点，即成熟的FXN^81–210首先由两步线粒体蛋白水解过程产生，然后通过一种未知机制将其部分输出到线粒体外。蛋白质在亚细胞间的多重分布通常来自多个转录起始位点、选择性剪接或不同的翻译起始(42). 相反，成熟线粒体和线粒体外frataxin是相同的这一概念让人联想到酵母富马酸酶的双重靶向性(43). 与frataxin类似，富马酸酶前体直接作用于线粒体，并通过线粒体加工肽酶成熟。成熟富马酸酶的一个子集随后被导入基质，而另一部分通过易位孔逆行运动在胞浆中释放(44). 由于这种机制，线粒体和细胞溶质形式的酵母富马酸酶具有相同的N-末端(45).

为了研究线粒体外frataxin的代谢作用，我们试图确定其细胞溶质靶点。线粒体frataxin是线粒体顺乌头酸酶活性的双边调节剂。首先，frataxin在ISC生物合成中的作用影响酶功能所需的修复基团的细胞可用性(32,33). 第二，frataxin直接伴侣Fe²⁺线粒体顺乌头酸酶的非活性3Fe–4S簇，以重建功能性4Fe–4簇(28). 两个不同的基因编码哺乳动物线粒体和细胞溶质乌头糖。这两种蛋白质的酶活性都需要4Fe–4S簇。此外，这两种乌头类化合物的总体同一性为30%，显示出活性位点残基的显著重叠(46). 通过在HEK-293细胞中的共同表达，我们证明线粒体外frataxin与胞浆乌头酶/IRP1蛋白共同定位并相互作用。转染frataxin的免疫沉淀导致转染IRP1的共沉淀，这一点已被反向方法证实。引人注目的是，这两种蛋白质之间的物理联系是明显的，没有线粒体外frataxin的强制表达。这进一步证明了人类细胞在细胞质中表达功能性内源性frataxin。此外，我们报告说，这种相互作用在很大程度上，尽管不完全取决于插入细胞溶质乌头糖形式的ISC的存在。通过所谓的“ISC-switch”细胞溶质乌头酸酶/IRP1在两个相互排斥的功能之间交替：ISC-contained形式是一种将细胞溶质柠檬酸盐转化为异柠檬酸盐的酶，而ISC-devoid形式通过结合特定的mRNA靶点来调节基因表达(35). 线粒体和细胞溶质辅酶活性的缺陷以及IRP1 RNA-结合活性的增加明显与模型生物中的frataxin缺乏有关(47–49)，在人类细胞培养物中(23,33)以及受FRDA影响的患者(32,36,37). 我们寻找了frataxin对附子酶活性的特异性功能。我们的结果表明FXN的表达^1–210在FRDA细胞中拯救线粒体和胞质附子酶的活性。此外，IRP1活性恢复到基本水平。相反，FXN的表达^81–210影响IRP1结合能力并激活细胞溶质乌头酶，但对线粒体乌头酶无明显影响。鉴于FRDA细胞在与FXN重组时在两个细胞室中都显示出frataxin定位^1–210（图三A） 上述数据强烈表明，frataxin形式具有特定于细胞室的作用。因此，细胞溶质顺乌头酸酶活性下降与细胞溶质frataxin耗竭平行，线粒体顺乌头酸酶活性无明显缺陷，直至线粒体frataxinPool耗竭(23).

鉴于线粒体外frataxin和细胞溶质顺乌头酸酶/IRP1之间的物理相互作用，酶的ISC的保护或激活是frataxin细胞溶质功能的主要假设。细胞溶质乌头糖转化为IRE结合形式的分子机制仍然是个谜。细胞溶质乌头糖的4Fe–4S簇对活性氧和活性氮高度敏感(50). 这些扰动导致不稳定铁的损失_α通过产生瞬态3Fe–4S团簇来实现原子(51–53)之后，乌头糖及其辅因子之间的共价键被完全移除(54). 据报道，含有3Fe–4S簇的蛋白质既没有酶活性也没有RNA结合活性；然而，铁可以将其还原为顺乌头酸酶形式²⁺供应(51). 如最近所示(55)4Fe-4S和3Fe-4S之间的循环平衡似乎对转化为RNA结合形式至关重要。由于FRDA细胞内源性发生氧化应激，细胞溶质乌头糖缺乏和IRP1激活至少部分归因于ISC过度损伤。因此，尽管这项工作没有直接解决，线粒体外frataxin可以通过直接输送Fe影响3Fe–4Fe平衡²⁺细胞溶质乌头糖3Fe–4S簇受损。此外，不能排除细胞溶质ISC在生物发生中的更普遍作用，需要进一步研究。在这方面，线粒体外frataxin被描述为与ISCU的细胞溶质亚型（cISCU或ISCU1）相互作用(21)，ISC生物合成的支架蛋白。人类线粒体和细胞溶质ISCU的亚型特异性缺失为其各自隔室中的选择性功能提供了证据(14). 尽管cISCU的沉默只导致细胞溶质乌头酶稳态活性的轻微变化，但对ISC修复/再生该酶的影响是非常明显的(14). 此外，最近确定的酵母CIA机制的两个同源物参与哺乳动物细胞溶质ISC的成熟。因此，IOP1的RNAi敲低(12; 酵母Nar1）或huNbp35/Nubp1的同源物(13; 酵母Nbp35的同源物）损害细胞溶质乌头酶的活性并激活IRP1-结合能力，而线粒体乌头酶保持完整。

本文的结果首次证明线粒体外frataxin对细胞溶质乌头酶/IRP1活性的分子控制。这些数据表明，frataxin在控制人类细胞溶质ISC依赖蛋白的新兴途径中的线粒体外作用，有助于更好地理解FRDA的分子病理生理学。

材料和方法

cDNA表达构建和细胞转染

位置2/FXN^1–210，位置2/FXN^81–210和pcDNA3/FXN^81-210构造在别处描述(20). 含人IRP1 cDNAXho公司5′端I点/Xba公司通过PCR从克隆MGC-8709（ATCC）中获得3′端I，并插入pcDNA3Myc载体中表达N末端Myc-IRP1蛋白。突变结构pcDNA3Myc/IRP1^C437S型使用QuickChange定点突变试剂盒（Stratagene）以pcDNA3Myc/IRP1为模板生成。所有最终结构均通过测序进行验证。来自临床受累FRDA患者的GM15850B淋巴母细胞和来自临床上未受影响的GM15850兄弟的GM15851B淋巴母公司是从NIGMS人类遗传细胞库科里尔医学研究所获得的。通过电穿孔稳定转染FRDA淋巴母细胞，并用500µg/ml G418（Invitrogen）进行筛选(20). 按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将20µg总DNA瞬时转染人类胚胎肾HEK-293细胞。

亚细胞分离

如前所述制备线粒体和细胞溶质提取物(22)稍作修改。收集细胞，用冰镇PBS清洗两次，然后重新悬浮在冰镇等渗缓冲液中（210 m米甘露醇，70米米蔗糖，10米米HEPES pH 7.4，1 m米EDTA和1米米DTT）补充完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。将悬浮液置于冰上并定期混合20分钟，然后通过25号注射器针数次。匀浆在800℃下离心两次克在4°C下保持10分钟，以消除细胞核和未破裂的细胞。上清液在10000下进一步离心两次克在4°C下持续30分钟，并作为细胞溶质部分收集。将线粒体颗粒重新悬浮在含有0.5%Triton X-100和Complete鸡尾酒的上述等张缓冲液中。在冰上培养20分钟后，样品在14000℃下离心克在4°C下持续15分钟，收集所得上清液作为线粒体部分。

线粒体外frataxin的纯化及N端序列分析

Frataxin是从稳定表达FXN的Flp-In-293细胞的～50 mg胞浆提取物中免疫沉淀而来的^1–210(20)使用mAb抗frataxin（mAb-10876 Immunological Sciences）和蛋白G-琼脂糖珠（GE Healthcare Life Sciences）。然后用15%的SDS-PAGE溶解免疫复合物，并从凝胶中去除考马斯染色带。N-末端氨基酸序列通过Alta Bioscience（英国伯明翰大学）进行的自动Edman降解来确定。

免疫荧光分析

HEK-293细胞被镀到玻璃室载玻片（Lab-Tek）上，并在镀后在完全培养基中额外生长一天。然后用pcDNA3/FXN联合转染细胞^81–210和pcDNA3/Myc-IRP1（1:1），按照制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。转染后24小时，细胞在室温（RT）下用4%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中15分钟。用PBS冲洗盖玻片两次，并在37°C下用60µ渗透30分钟米洋地黄素，用PBS洗涤两次，然后进行封闭步骤，用含有10%FBS的PBS在RT下1小时，以尽量减少非特异性染色。然后在37°C下，用抗frataxin单克隆抗体MAB-10876或等型匹配的对照单克隆抗体在PBS/10%FBS中稀释1:400培养样品1小时。用PBS洗涤三次后，用次级Alexa 594-结合羊抗鼠抗体（分子探针）在PBS/10%FBS中以1:1000稀释，在RT下培养细胞1小时，在PBS中冲洗三次，然后用一级抗IRP1多克隆兔抗体（意大利Vita-Salute San Raffaele大学Sonia Levi博士的馈赠）在PBS/10%FBS中稀释1:200培养。用PBS冲洗三次后，用二级Alexa 488-共轭羊抗兔抗体（分子探针）在RT下培养细胞1小时在PBS/10%FBS中稀释1:1000，在PBS中冲洗三次，并用Prolong Antifade（分子探针）安装在玻璃载玻片上。所有图像都是使用配备Cohu高性能CDD相机的BX60奥林巴斯显微镜采集的。

免疫沉淀和免疫印迹

用瞬时联合转染frataxin和Myc-IRP1构建物的HEK-293细胞的细胞提取物，通过单抗抗frataxin-mAb-10876免疫沉淀frataxin，或通过单抗-抗人c-Myc 9E10（554205 BD Pharmingen）免疫沉淀Myc-IRP1。免疫沉淀物通过12%SDS-PAGE分离，转移到Protran硝化纤维素膜（Whatman）上，并使用ECL系统检测进行免疫印迹分析（GE Healthcare Life Sciences）。为了分析总蛋白提取物，细胞在添加了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒的冰镇RIPA缓冲液中进行裂解。用12或15%的SDS-PAGE分离细胞提取物，并用以下抗体进行免疫印迹：单抗抗frataxin（mAb-10876免疫学）、单抗抗α-管蛋白（Sigma）、抗MnSOD（StressGen）、单克隆抗体抗c-myc 9E10（BD Pharmingen）、抗IRP1 N-17（sc-14216 Santa Cruz Biotechnology）抗IRP2 7H6单克隆抗体（sc-33682 Santa Cruz Biotechnology）。

乌头酸酶分析

通过乌头酶和异柠檬酸脱氢酶的偶联反应，在340nm处用分光光度法测定乌头酶活性。检测反应在50 m范围内含有50–100µg亚细胞组分米Hepes pH值7.4，1 m米柠檬酸钠，0.6 m米氯化锰₂，0.2米米NADP公司⁺和来自猪心的2 U/ml异柠檬酸脱氢酶（Sigma-Aldrich）。为了计算酶的活性，1毫单位的酶被定义为转化1 nmol NADP的蛋白质量⁺25°C下1分钟。

按照说明进行乌头糖凝胶试验(14). 简单地说，通过在4°C下以18 V/cm的电泳运行3.5小时，将100µg细胞总提取物在CelLytic M缓冲液（Sigma-Aldrich）中用完全混合液溶解，在4%堆积，8%分离凝胶中溶解。使用ImageJ软件进行密度定量。

使用Student’st吨-测试；所有值均表示为平均值±SD。

IRPs RNA带移（RNA EMSA）

所用探针是一个与人类H-铁蛋白基因IRE序列相对应的32位RNA寡核苷酸（5′-GGU UUC CUG CAA CAG UGC GAC GGA AC-3′），在5′端用生物素分子标记（Metabion International AG）。细胞裂解物在CelLytic M缓冲液中制备，并辅以Complete鸡尾酒。结合反应包含5–10µg总提取物，最终体积为15–20µl，含10 m米Hepes pH 7.4，40米米KCl，3米米氯化镁₂和5%甘油。必要时，β-巯基乙醇的最终浓度为3%，以充分激活IRP1-结合能力。在RT培养10分钟后，添加RNAse T1（Sigma-Aldrich）10分钟，然后再添加5 mg/ml肝素（Sigma Aldrich并使用化学发光核酸检测模块（Pierce）进行检测。

补充材料

补充数据

基金

这项工作得到了国家共济失调基金会、英国共济失调协会和Friedreich共济失调研究联盟的支持。感谢Telethon-Italy（Grant GGP06059）的财务支持。A.R.是罗马圣卢西亚基金会的研究员；I.G.是Française de l'Ataxie de Friedreich协会（AFAF）的研究员。

致谢

我们感谢实验室所有同事的有益讨论，感谢娜塔西亚·文图拉博士对手稿的批判性阅读。我们还感谢Gaetano Cairo博士在开发IRP带移分析中的有益讨论，感谢Alessandro Campanella博士和Sonia Levi博士提供的抗IRP1兔血清。

利益冲突声明。未声明。

参考文献