目的
血管成熟涉及壁细胞的招募，如周细胞和平滑肌细胞。层流剪切应力是血管成熟的主要触发因素，但剪切应力影响周细胞募集的分子机制尚不清楚。微RNA（miRs）是一种小的非编码RNA，在转录后控制基因表达。本研究的目的是揭示剪切应力调节的微小RNA促进血管成熟的机制。
方法和结果
这里，我们表明层流剪切应力增加了miR-27a和miR-27b的表达体外和在体外小鼠股动脉移植。内皮细胞中miR-27b的过度表达增加周细胞粘附和周细胞募集体外。体外miR-27b的过度表达增强了内皮-周细胞共培养的屏障功能，而miR-27a/b的抑制减少了粘附和周细胞覆盖，降低了屏障功能。体内锁定核酸反义寡核苷酸对miR-27a/b的药理抑制显著降低小鼠子宫周细胞覆盖率并增加子宫含水量。MiR-27b过度表达抑制了信号蛋白（SEMA），其介导排斥信号和血管失稳人类而非小鼠血管生成素-2（Ang-2）。沉默SEMA6A和SEMA6D通过miR-27抑制挽救了周细胞粘附减少。此外，对SEMA6D的抑制增加了内皮-周细胞共培养的屏障功能体外。
结论
本研究首次证明剪切应力调节的miR-27b通过抑制SEMA6A和SEMA6D促进内皮细胞与周细胞的相互作用。
引言
微RNA（miRs）是一种短的非编码RNA，通过诱导mRNA降解或阻断翻译，在转录后控制基因表达。MiRs在调节组织内环境稳定方面起着关键作用，并可能导致各种疾病。在血管系统中，各种miR被证明可以控制血管生成、血管炎症和动脉粥样硬化。1–5几项研究表明，剪切应力调节的miR有助于内皮细胞层流的抗炎、细胞周期抑制和血管保护作用。6特别是，暴露于层流的内皮细胞中miR-23-27-24簇的成员增加。6–8miR-23b的上调导致细胞周期进程受到抑制，7但miR-27a和miR-27b在血流反应中的功能作用尚不清楚。MiR-27a/b抑制语义蛋白，尤其是SEMA6A，8,9从而抑制内皮-内皮排斥信号体外。8核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）是另一个报道的内皮细胞miR-27靶点。在斑马鱼中，miR-27b抑制Notch配体Delta样配体4（Dll4）和Sprouty同源物2（Spry2）并促进静脉分化。10MiR-27a靶向VE-cadherin，blockmiRs干扰MiR-27a-VE-cadherin 3′UTR结合减少血管渗漏。11血管成熟涉及壁细胞（如周细胞或平滑肌细胞）的募集和细胞外基质的沉积。12周细胞可以通过不同的接触形态（包括钉-槽相互作用或闭塞接触）与内皮细胞建立直接的细胞间接触，而动脉和静脉中的平滑肌细胞与内皮细胞的接触较少。周细胞的补充被认为可以维持内皮屏障功能并防止水肿的形成。13周细胞还被证明可以控制血管直径，然而，尚不清楚这些功能是否可以推广。14,15EC暴露在剪切应力下调节血管重塑和成熟，而缺乏血流则有助于血管退化。12周细胞向内皮的募集是由多种配体-受体复合物介导的，包括PDGF-B/PDGFRβ、SDF-1a/CXCR4、HB-EGF/ErbB、Shh/Ptc和血管生成素/Tie-2。15与其他命名因子相比，Ang-2是血管成熟的负调节因子，其抑制作用可诱导肿瘤血管中更成熟的血管和更高的周细胞覆盖指数。16最初的研究还表明，信号蛋白，一个细胞表面和可溶性蛋白家族，最初被证明控制轴突导向，调节血管稳定性。虽然SEMA3A的功能存在争议，但两者都很稳定17和破坏稳定18据报道，SEMA3B降低了肿瘤血管周细胞覆盖率。19在这里，我们探讨了剪切应力诱导的内皮细胞miR-27在调节周细胞募集和血管稳定性中的作用。
方法
细胞培养、转染和慢病毒转导
从Lonza购买混合的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），并在内皮基础培养基（EBM）中培养，补充10%胎牛血清（FCS；Invitrogen）和EGM-SingleQuots（Lonza.），直到第三代。使用4个不同批次的HUVEC。从ScienceCell购买人脑血管周细胞（HBVPs），并在含有葡萄糖、丙酮酸钠和补充10%FCS和青霉素/链霉素（罗氏诊断）的谷氨酸MAX的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM；ThermoFisher Scientific）中培养，直到第九代。每批来自一个供体（共8批）。人类胚胎肾（HEK）293FT细胞（Invitrogen）在补充10%热灭活FCS和青霉素/链霉素的DMEM中培养。所有细胞均在37°C和5%CO下培养2。
根据制造商的方案，使用Lipofecamin RNAiMAX（Invitrogen）以50-70%的融合率转染HUVECs、HBVPs和小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs）。对于microRNA过度表达，使用10 nM的miR-27a和miR-27b前体分子或对照前体分子（Ambion）(在线补充材料,表S1). 为了抑制miR-27a/b，使用50 nM（Exiqon）的锁定核酸（LNA）抗miRs或随机序列的对照LNA(在线补充材料,表S1). 用以下浓度的siRNA（Sigma）转染细胞：67 nM（Ang-2）、100 nM（SEMA6A和SEMA6D）、134 nM（SEMA3B）或相应浓度的阴性对照（siFirefly荧光素酶；Sigma(在线补充材料,表S2).
如前所述，对KLF2的长期过度表达和shRNA介导的KLF2沉默进行慢病毒转导。20对于长期GFP表达，HBVPs在50-70%的融合处转导。
层流剪切应力和体外剪切应力
如前所述，使用ibidi灌注系统对HUVEC进行剪切应力暴露。简言之，1.0×105HUVEC被植入µ-幻灯片I0.4鲁尔（伊比迪）过夜。HUVEC以20 dyn/cm的速度暴露于层流剪切应力下72 h2.接种到µ中的HUVEC-幻灯片I0.4用作静态控件。如前所述，对小鼠股动脉进行层流剪切应力暴露。20
粘附力测定
如上所述转染HUVEC，并在6厘米培养皿中培养48小时，直到它们达到100%融合。之后，7.5×104加入表达GFP的周细胞并使其粘附2 h。用PBS（Life technologies）清洗三步并用4%PFA固定后，在Axio Observer上拍摄5到10张随机图像。分析Z1（Zeiss）和GFP阳性周细胞的数量。
Matrigel三明治试验
这个体外如前所述进行基质凝胶夹心分析。21简单地说，将150µl生长因子减少的BD-Matrigel基底膜基质（BD-Bioscience）置于48孔板（Nunc）的每个孔中，在37°C下放置30分钟以进行聚合。根据制造商的协议，用DiI-乙酰化LDL（生命技术）标记转染的HUVEC。1.0 × 105将标记的HUVECs接种在500µl培养基中的Matrigel上，3小时后接种1.0×104添加表达GFP的周细胞并使其再附着3 h。去除培养基后，在37°C下添加第二层Matrigel（150µl）30 min。共同培养在一夜之间孵化。使用10倍物镜，在激光扫描显微镜LSM780（蔡司）上通过共焦显微镜观察整个微孔的管形成和周细胞覆盖。通过计算GFP信号与DiI-乙酰化LDL信号的比率分析周细胞覆盖率。
MBMEC和内皮电阻（TEER）的分离
为了分离MBMECs，使用10–12周龄的C57BL/6 WT小鼠，通过颈椎脱位将其处死。MBMEC的分离和培养如前所述。22MBMECs的转染率为50-70%。如前所述，测量EC单层或EC-周细胞共培养物的TEER。23对于TEER实验，使用24孔聚对苯二甲酸乙二醇酯跨孔嵌件（孔径1.0µm，Greiner Bio-one）。3.0*104周细胞接种在下面（涂有0.001%聚乙烯-我-24小时后，将相同数量的MBMEC接种在膜的上侧（纤维连接蛋白涂层为5µg/cm2). 将插入物转移到cellZscope仪器（nanoAnalytics），每10分钟连续记录一次测量结果。
Western blot分析和ELISA
细胞在添加蛋白酶抑制剂（罗氏）的RIPA裂解缓冲液（Sigma-Aldrich）中在冰上裂解15分钟。细胞裂解物在20000×克在4°C下，用Bradford法测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加载到SDS-聚吖啶凝胶上并分离。将蛋白质印在硝酸纤维素膜上，并使用以下抗体分析SEMA6A（山羊多克隆抗人SEMA6A；1:500，R&D Systems）、SEMA6D（小鼠单克隆抗人SEMA6D；1:500；R&D System）、SEMAP3B（兔多克隆抗人类SEMA3B；1:5000，Thermo Scientific）、Ang-2（小鼠单抗人Ang-2；1:500，研发系统）和α-微管蛋白（小鼠单克隆抗人微管蛋白；1:1000，NeoMarkers）。二级抗体购自Jackson ImmunoResearch。
为了进一步分析细胞裂解液中的Ang-2浓度，根据制造商协议，使用研发系统的Ang-2Quantikine ELISA试剂盒。如上所述制备细胞裂解物，并将其稀释为1:150进行测量。
定量实时RT-PCR
根据制造商协议，使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen）从培养细胞或小鼠组织中分离出总RNA。使用随机六聚体（Thermo Scientific）和MuLV（Applied Biosystems）逆转录酶将每个样本中500 ng的RNA逆转录成cDNA。定量实时PCR在StepOnePlus机器（Applied Biosystems）中使用SYBR Green（AppliedBiosystes）进行。RPLP0或GAPDH作为内源性控制(在线补充材料,表S3).
MicroRNA表达分析
根据制造商协议，使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen）从培养细胞或小鼠组织中分离出总RNA。为了进行miR检测，将10 ng RNA反向转录到cDNA中，并使用在StepOnePlus设备（Applied Biosystems）上进行的TaqMan MicroRNA检测（应用生物系统），通过TaqMan-实时PCR进行定量。使用RNU6或snoRNA202作为内源性对照。
荧光素酶检测
荧光素酶报告实验显示miR-27a/b直接靶向Ang-2。因此，将Ang-2（Genecopoeia）全长3′UTR插入psiCheck2载体（Promega）。HEK293 FT细胞与psiCheck2质粒联合转染，质粒使用Genejuice（Merck），前体分子miR-27a和miR-27b（Ambion）使用Ribojuice（默克）。使用双荧光素酶报告物测定系统（Promega）在转染后24小时测量荧光素酶活性。
主动脉环测定
主动脉是从C57BL/6 WT小鼠中分离出来的，并按照前面所述进行培养。24小鼠通过颈椎脱位处死。简单地说，将1 mm环切割并嵌入96孔板（Greiner Bio One）中的I型鼠尾胶原（Millipore）中，并在补充2.5%FCS和青霉素/链霉素（Roche）的DMEM/F-12培养基中培养。通过向最终浓度为500 nM的培养基中添加LNA-Co或LNA-27，并用VEGF（30 ng/mL）刺激，用LNA antimiRs转染环。允许发芽7天，然后用4%PFA固定，并用生物素异凝集素B4（Vector laboratories）和链霉亲和素AlexaFluor 488（life Technologies）染色内皮细胞。使用兔抗NG2硫酸软骨素蛋白聚糖抗体（Merck）和山羊抗兔AlexaFluor 555（生命技术）对周细胞进行NG2染色。在激光扫描显微镜LSM 780（蔡司）上通过共焦显微镜观察芽苗。将周细胞覆盖率计算为NG2信号与等凝集素B4信号的比率。
体内实验
所有动物研究均已获得当地伦理委员会（Regierungspräsidium Darmstadt，德国黑森）的批准。所有动物实验都是根据实验动物护理原则和德国国家法律进行的。用12周龄C57BL/6小鼠研究miR-27a/b对小鼠子宫周细胞覆盖率的影响。LNA-Co（20 mg/kg；Exiqon）或LNA-27（20 mg/kg；在第0、4、7和11天腹腔注射Exiqon）。在第14天，通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并采集器官。收获后立即将子宫切成两等份，一份用于分析含水量，另一份用于组织化学分析。为了分析水分含量，在收获后立即测量器官的重量（湿重），然后在55°C下干燥1周，以确定干重。含水量为干重与湿重之差。
在C57BL/6小鼠中测定尸体蛋白AlexaFluor-488渗出。在第0天、第4天、第7天和第11天腹腔注射LNA-Co或LNA-27（20 mg/kg），然后进行Cadaverine AlexaFluor-488灌注4 h，随后PBS灌注5 min，然后在第14天处死小鼠。通过在RIPA缓冲液中均匀化组织，然后在24000×克在493/516 nm处测量荧光。对使用LNA-co或LNA-27（40 mg/kg）治疗14天的小鼠的微血管周细胞覆盖率进行分析。为了分析周细胞到血管的距离，在LNA治疗4天后（20 mg/kg）使用NG2DsRed小鼠。
免疫组织化学
为了分析子宫周细胞覆盖率，对4µm石蜡切片进行了内皮细胞标记物（大鼠抗鼠CD31）和周细胞标记物的染色（兔抗鼠NG2）。使用山羊抗大鼠AlexaFluor-488和山羊抗兔AlexaFluxor-555作为二级抗体。为了分析脑周细胞覆盖率，在50µm冰冻切片中使用PDGFRβ作为周细胞标记物，CD31作为内皮细胞标记物。使用25倍物镜在共聚焦扫描显微镜LSM780（蔡司）上拍摄图像。
统计
数据表示为平均值±S.E.M.使用Microsoft Excel或GraphPad Prism 5软件评估统计显著性。两个治疗组通过Student’s吨-测试，如果数据遵循高斯分布（由Kolmogorov–Smirnov测试确定）。如果数据未通过正态性检验，则应用非参数检验。多组比较采用方差分析和事后分析（如有必要）。当P（P）≤ 0.05.
结果
流诱导miR-27b控制体外内皮细胞-周细胞相互作用
我们首先证实，层流剪切应力增加了培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中miR-27a/b的表达(图1A类,在线补充材料,图ure（自然）第1部分)和小鼠股动脉移植(图1B类). 剪切应力增加miR-27表达的机制部分归因于流诱导转录因子Krüppel-like factor 2（KLF2），KLF2刺激miR-27b的表达，而不是miR-27a的表达(图1C、 D类)并诱导miR-27b（c9orf3）的初级转录(图1E类). 慢病毒短发夹RNA构建物沉默KLF2可消除剪切应力诱导的miR-27b上调(图1F类). 在miR-27a的情况下，MEF2A似乎参与了上调(在线补充材料,图ure（自然）S1B级). 综上所述，这些结果表明miR-27b是由层流剪切应力通过转录因子KLF2诱导的。![miR-27a/b的表达是由层流剪切应力诱导的。（A） 与静态对照组相比，HUVEC在20 dyn/cm2的层流剪切应力下暴露72 h后miR-27a/b表达（n=6）。学生的t检验用于评估统计显著性。（B） 将股动脉外植体暴露于层流剪切应力（7.6 vs.76 dyn/cm2）下6 h，并在两个独立的实验中对miR-27a/B的表达进行量化（用闭合符号和开放符号表示n=5和6）。MiR-126用作阴性对照。（C） 慢病毒KLF2过表达的Western blot分析。（D） 与模拟转导细胞相比，过度表达KLF2的HUVEC中miR-27a/b的表达（n=4）。（E） 与模拟细胞相比，过度表达KLF2的HUVEC中miR-27b初级转录物（C9orf3）的表达（n=4）。（F） 用慢病毒短发夹RNA沉默KLF2并暴露于剪切应力（20 dyn/cm2）72 h（n=4）后，HUVEC中miR-27b的表达。对于B、D和E，采用曼恩-惠特尼检验评估统计显著性*P≤0.05，***P<0.001。]()
图1
miR-27a/b的表达是由层流剪切应力诱导的。(A类)HUVEC暴露于20 dyn/cm的层流剪切应力后miR-27a/b的表达2与静态控制相比72小时(n个= 6). 学生的吨-检验用于评估统计学意义。(B类)股动脉移植体暴露于层流剪切应力（7.6 vs.76 dyn/cm2)6小时后，在两个独立的实验中对miR-27a/b的表达进行量化（用封闭符号和开放符号表示n个=5和6）。MiR-126用作阴性对照。(C类)慢病毒KLF2过表达的Western blot分析。(D类)miR-27a/b在过表达KLF2的HUVEC中的表达与模拟转导细胞的比较(n个= 4). (E类)与模拟细胞相比，过度表达KLF2的HUVEC中miR-27b初级转录物（C9orf3）的表达(n个= 4). (F类)用慢病毒短发夹RNA沉默KLF2并暴露于剪切应力（20 dyn/cm）后，人脐静脉内皮细胞中miR-27b的表达2)持续72小时(n个= 4). 对于B类,D类、和E类Mann-Whitney检验用于评估统计学显著性*P（P）≤ 0.05, ***P（P）< 0.001.
研究内皮细胞miR-27b在内皮细胞与周细胞相互作用中的作用体外，用前体分子转染HUVEC以过度表达miR-27b或用锁定核酸（LNA）修饰的反义寡核苷酸转染，这些寡核苷酸可抑制miR-27a和miR-27b(数字2A类和三A类). 由于内皮细胞和周细胞可以建立直接的细胞间接触，13我们研究了miR-27b是否影响周细胞与EC单层的粘附。内皮细胞中miR-27b的过度表达显著增加了周细胞粘附内皮细胞的数量(图2B类). 另一方面，抑制EC中的miR-27a和miR-27b可显著减少EC单层粘附周细胞的数量(图三B类). 此外，miR-27b在内皮细胞中的过度表达增加了内皮细胞管周细胞的覆盖率体外基质凝胶夹心法(图2C类). 另一方面，在这些实验条件下，miR-27a和miR-27b的沉默显著降低了EC试管的周细胞覆盖率(图三C类). 尽管粘附和基质凝胶试验中的微环境不同，但miR-27a/b对内皮-周细胞相互作用的影响是一致的。最后，我们使用了体外主动脉环试验在更多生理条件下证实这些数据。抑制miR-27a和miR-27b显著降低主动脉环EC芽周细胞覆盖率(图三D类,在线补充材料,图第2页). 在这里，覆盖内皮芽的周细胞来源于周细胞前体细胞（PPC），PPC位于内膜并分化为周细胞。25![miR-27b在体外促进内皮细胞-周细胞相互作用。（A） 用前体分子（10 nM）转染HUVEC以过度表达miR-27a和b（n=4）。采用Mann-Whitney检验评估统计显著性。（B） 如图所示转染HUVEC。48 h后，将7.5×104 GFP转导的人脑血管周细胞（HBVP）添加到内皮单层中2 h。周细胞的粘附性通过计算三个清洗步骤后每个视野中粘附的GFP阳性细胞数和用4%PFA固定来分析。每个实验分析五到十张随机图片（n=7）。采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验评估统计显著性。比例尺：200µm。（C） 用DiI乙酰化LDL标记转染的HUVEC（miR-27b的前体分子）4 h，并用体外基质凝胶夹心法联合培养1×105标记的HUVeC和1×104 GFP标记的周细胞。比例尺：500µm。在共聚焦激光扫描显微镜LSM780，Zeiss上，通过共聚焦z叠加图像（n=9），观察共聚焦激光共培养过夜后周细胞的覆盖情况。采用Wilcoxon配对符号秩检验评估统计学意义。周细胞覆盖率表示为GFP/DiI LDL的比率。（D） 72小时后MBMECs-HBMVP共培养的TEER（n=4个独立实验，每个实验3个技术复制）。将3.0×104周细胞接种在膜的下侧，24小时前将相同数量的转染内皮细胞接种在细胞膜的上侧。连续5天测量TEER。采用配对t检验评估统计学意义。（E） 72小时后过度表达miR-27b后EC单层的TEER（n=3个独立实验，每个实验3个技术重复）*P≤0.05。]()
图2
miR-27b促进内皮细胞-周细胞相互作用体外试验。(A类)用前体分子（10 nM）转染HUVEC以过度表达miR-27a和b(n个= 4). 采用Mann-Whitney检验评估统计显著性。(B类)按照指示转染HUVECs。48小时后，7.5×104将转导GFP的人脑血管周细胞（HBVP）添加到内皮单层中2 h。周细胞的粘附性通过计算三个清洗步骤后每个视野中粘附的GFP阳性细胞数进行分析，并用4%PFA固定。每个实验分析五到十张随机图片(n个= 7). 采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验评估统计显著性。比例尺：200µm。(C类)转染的HUVEC（miR-27b的前体分子）用DiI乙酰化LDL标记4 h和1×105标记的HUVEC和1×104GFP标记的周细胞使用体外基质凝胶夹心法。比例尺：500µm。在共聚焦激光扫描显微镜LSM780，Zeiss上，通过共聚焦z堆叠图像，观察共聚焦激光共培养过夜后周细胞的覆盖情况(n个= 9). 采用Wilcoxon配对符号秩检验评估统计学意义。周细胞覆盖率表示为GFP/DiI LDL的比率。(D类)72小时后MBMECs-HBMVP共培养的TEER(n个=4个独立实验，每个实验3个技术复制）。3.0 × 104周细胞接种在膜的下侧，24小时前将相同数量的转染内皮细胞接种到膜的上侧。连续5天测量TEER。配对t吨-检验用于评估统计学意义。(E类)miR-27b过表达72小时后EC单层的TEER(n个=3个独立实验，每个实验3个技术复制）*P（P）≤ 0.05.
![沉默miR-27a和miR-27b可减少体外内皮细胞与周细胞的相互作用。（A） 用LNA（50 nM）转染HUVEC以沉默miR-27a和miR-27b（n=4）。采用Mann-Whitney检验评估统计显著性。（B） 如图所示转染HUVEC。48 h后，将7.5×104 GFP转导的人脑血管周细胞（HBVP）添加到内皮单层中2 h。周细胞的粘附性通过计算三个清洗步骤后每个视野中粘附的GFP阳性细胞数和用4%PFA固定来分析。每个实验分析五到十张随机图片（n=8）。比例尺：200µm。（C） 用DiI乙酰化低密度脂蛋白标记转染的HUVEC（沉默miR-27a和miR-27b的LNA）4 h，并用体外基质凝胶夹心法联合培养1×105标记的HUVeC和1×104 GFP标记的周细胞。比例尺：500µm。在共聚焦激光扫描显微镜LSM780，Zeiss上，通过共聚焦z-stack图像（n=13），观察共培养过夜后周细胞的覆盖情况。采用配对t检验评估统计学意义。周细胞覆盖率表示为GFP/DiI LDL的比率。（D） 从C57BL/6小鼠制备主动脉环，并在含有30 ng/mL mVEGF的情况下，以500 nM的浓度转染LNA-Co或LNA-27。孵育7天后，通过对壁细胞标记NG2（红色）进行染色来检测周细胞，并通过对异凝集素b4（绿色）进行染色来检测内皮细胞芽。比例尺：500µm。学生的t检验用于评估统计显著性。周细胞覆盖率表示为NG2/IB4信号比率。对至少3只小鼠的每组18个环进行了分析。在激光扫描显微镜LSM780，蔡司上拍摄共聚焦z堆叠图像。（E） 72小时后MBMECs-HBMVP共培养的TEER（n=5个独立实验，每个实验3个技术复制）。将3.0×104周细胞接种在膜的下侧，24小时前将相同数量的转染内皮细胞接种在细胞膜的上侧。连续5天测量TEER。采用配对t检验评估统计学意义。（F） 72小时后抑制miR-27a和miR-27b后EC单层的TEER（n=3个独立实验，每个实验3个技术重复）*P≤0.05。]()
图3
沉默miR-27a和miR-27b可减少内皮细胞与周细胞的相互作用体外试验。(A类)用LNA（50 nM）转染HUVEC以沉默miR-27a和miR-27b(n个= 4). Mann-Whitney检验用于评估统计学显著性。(B类)如图所示转染HUVEC。48小时后，7.5×104将转导GFP的人脑血管周细胞（HBVP）添加到内皮单层中2 h。周细胞的粘附性通过计算三个清洗步骤后每个视野中粘附的GFP阳性细胞数进行分析，并用4%PFA固定。每个实验分析五到十张随机图片(n个= 8). 比例尺：200µm。(C类)用DiI乙酰化LDL标记转染的HUVEC（沉默miR-27a和miR-27b的LNA）4h和1×105标记的HUVEC和1×104GFP标记的周细胞使用体外基质凝胶夹心法。比例尺：500µm。在共聚焦激光扫描显微镜LSM780，Zeiss上，通过共聚焦z堆叠图像，观察共聚焦激光共培养过夜后周细胞的覆盖情况(n个= 13). 配对吨-检验用于评估统计学意义。周细胞覆盖率表示为GFP/DiI LDL的比率。(D类)从C57BL/6小鼠制备主动脉环，并在含有30 ng/mL mVEGF的情况下，以500 nM的浓度转染LNA-Co或LNA-27。培养7天后，用壁细胞标记物NG2（红色）染色检测周细胞，用isolectin b4（绿色）染色检测内皮细胞芽。比例尺：500µm。学生的吨-检验用于评估统计学意义。周细胞覆盖率表示为NG2/IB4信号比率。对至少3只小鼠的每组18个环进行了分析。在激光扫描显微镜LSM780蔡司上拍摄了共聚焦z轴叠加图像。(E类)72小时后MBMECs-HBMVP共培养的TEER(n个=5个独立实验，每个实验3个技术副本）。3.0 × 104周细胞接种在膜的下侧，24小时前将相同数量的转染内皮细胞接种到膜的上侧。连续5天测量TEER。配对t吨-检验用于评估统计学显著性。(F类)miR-27a和miR-27b抑制72小时后EC单层的TEER(n个=3个独立实验，每个实验3个技术复制）*P（P）≤ 0.05.
由于周细胞在维持血脑屏障（BBB）中起着至关重要的作用，15我们还使用了体外在使用MBMEC（小鼠脑微血管内皮细胞）的TEER（跨内皮细胞电阻）分析中，探讨miR-27a/b是否控制内皮细胞-周细胞共培养的屏障功能的通透性模型。与对照组相比，miR-27b的过度表达显著增加了屏障特性，表现为电阻增加，而miR-27a和miR-27b的抑制显著降低了屏障特性(图2D类和三E类;在线补充材料,图S3A/B系列). 为了测试这些效应是EC固有的（独立于EC/PC相互作用）还是由ECs中miR-27a/b表达改变调节的EC/PC交互作用的变化引起的，我们在没有周细胞的情况下进行了相同的实验。miR-27b的过度表达和miR-27a/b的抑制均不影响内皮单层的屏障特性(图2E类和三F类;在线补充材料,图S3A/B系统). 这些数据共同表明，内皮细胞中miR-27b的表达促进周细胞的粘附和募集，并控制内皮-周细胞共培养的屏障特性体外。
抑制miR-27a/b干扰内皮细胞-周细胞在体内的相互作用
验证我们的发现体内，我们通过应用LNA抑制小鼠miR-27a和miR-27b的表达，这导致miR-27a和miR-28b的表达显著降低(图4A类). 为了研究miR-27a和miR-27b对EC-周细胞相互作用的影响，我们首先研究了小鼠子宫内膜的血管系统，因为在月经周期中存在持续的血管重塑。26,27为了排除月经周期的不同阶段，小鼠被关在同一笼子里3周，以进行周期同步。周细胞覆盖率通过检测NG2-硫酸软骨素蛋白聚糖4来确定，并且在miR-27a/b抑制14天后显著降低(图4B/C银行). 进一步检查发现周细胞覆盖率的降低与器官增厚有关(图4D类). 我们通过从湿重中减去干重来确定含水量。抑制miR-27a/b倾向于增加子宫中的水分含量(图4E类).
图4
抑制miR-27a/b干扰内皮细胞-周细胞相互作用体内. (A类)在第0天、第4天、第7天和第11天，向C57BL/6小鼠腹腔注射针对miR-27a/b或对照寡核苷酸的LNA，剂量为20 mg/kg体重，持续14天。用qPCR检测心脏组织中MiR-27a/b的表达(n个= 8). 为了评估统计显著性，对miR-27a和未配对Student吨-在miR-27b的情况下进行测试。(B类)在子宫中抑制miR-27a/b 14天后分析周细胞覆盖率。LNA应用按中所述进行(A类). 比例尺：100µm。收获后，将器官切成两块，一块用于免疫组织化学，另一块用于水分分析。制备4µm石蜡切片。内皮细胞染色CD31（绿色），周细胞染色NG2（红色），Hoechst 33342用于染色细胞核(n个= 8). 使用25倍物镜在共聚焦激光扫描显微镜LSM780（蔡司）上拍摄图像。(C类)周细胞覆盖率计算为NG2阳性血管与CD31阳性血管的比率。未付费学生的吨-检验用于评估统计学意义。(D类)子宫的形态和湿/干重量比。收获后立即测量器官的湿重。为了测定干重，将器官在55°C下干燥7天。(E类)分析子宫的湿重/干重的水分含量，水分含量由干重减去湿重得出。采用Mann-Whitney检验评估统计显著性*P（P）≤ 0.05, ***P（P）< 0.001.
MiR-27a/b通过靶向信号素控制内皮细胞-周细胞相互作用
与之前的调查结果一致，8,9miR-27a/b过度表达降低了SEMA3B、SEMA6A和SEMA6D的表达(图5A、 B类、和C类). 此外，在人类内皮细胞中，miR-27a/b显著降低了预测靶点Ang-2的丰度(图5D类)已知会影响EC与周细胞的相互作用。28ELISA证实了Ang-2蛋白表达的这些变化(在线补充材料,图ure（自然）S4A系列). 此外，miR-27a/b的抑制增加了Ang-2的丰度(在线补充材料,图ure（自然）S4B系列). 为了检测miR-27a/b是否直接抑制Ang-2，在荧光素酶报告载体中克隆了人Ang-2的3′UTR。miR-27b的过度表达显著降低了萤光素酶的活性(图5E类). 然而，当miR-27a/b结合位点发生突变时，miR-27a或miR-27b的过度表达也会略微降低荧光素酶的活性(在线补充材料,图ure（自然）S4C系列)，表明miR-27a/b通过间接机制影响Ang-2 3′UTR(在线补充材料,图ure（自然）S4C系列). 然而，由于小鼠3′UTR中miR-27a/b结合位点不保守，因此在小鼠EC中未观察到Ang-2对miR-27b/b过度表达的调节血管生成素-2成绩单(在线补充材料,图ure（自然）S4D系列).![miR-27a/b调节信号素和血管生成素-2的表达。（A–D）转染miR-27a和b前体72h后，通过western blot分析检测SEMA3B、SEMA6A、SEMA2D和血管生成素-2在HUVEC中的表达。代表性斑点显示在上部面板中，量化显示如下（SEMA3B n=8，SEMA6A n=4，SEMA6 D n=10，Ang2 n=4）。（E） HEK293FT细胞中显示出荧光素酶活性，这些细胞转染了miR-27a和miR-27b的前体分子，以及荧光素酶3′UTR（n=6）中含有Ang-23′UTR的荧光素素酶构建物。采用单因素方差分析（A-E）评估统计显著性*P≤0.05，**P<0.01，***P<0.001。]()
图5
miR-27a/b调节信号素和血管生成素-2的表达。(A类–D类)western blot分析检测miR-27a和b前体转染后72 h HUVEC中SEMA3B、SEMA6A、SEMA6 D和Angiopietin-2的表达。代表性斑点显示在上部面板中，量化显示如下（SEMA3Bn个=8，SEMA6An个=4，SEMA6Dn个=10，Ang2n个= 4). (E类)HEK293FT细胞中显示出荧光素酶活性，这些细胞转染了miR-27a和miR-27b的前体分子，以及荧光素酶3′UTR中含有Ang-2 3′UTR-(n个= 6). 单向方差分析(A类–E类)用于评估统计显著性*P（P）≤ 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
因此，我们重点研究了语义素对EC与周细胞相互作用的影响。用siRNAs沉默SEMA6A和SEMA6D可显著增加EC单层粘附周细胞的数量(图6A/B公司;在线补充材料,图第5页)而抑制SEMA3B对周细胞粘附无影响。为了测试这些发现的因果相关性，我们抑制了miR-27a/b，并确定沉默SEMA6A和SEMA6D是否可以挽救周细胞对EC单层的粘附受损。事实上，沉默SEMA6A和SEMA6D部分缓解了miR-27a/b抑制周细胞粘附的作用(图6B类). 为了进一步阐明信号蛋白在EC-周细胞相互作用中的作用，我们研究了抑制小鼠Sema6d是否调节EC-周血细胞共培养的屏障功能。事实上，小鼠Sema6d的沉默显著增加了屏障功能(图6C类).![miR-27a/b通过靶向SEMA6A和SEMA6D控制内皮-周细胞相互作用。（A） 将7.5×104 GFP标记的周细胞加入转染的内皮融合单层中2h，用4%PFA（n=5）洗涤固定后，通过计数GFP阳性细胞来评估粘附周细胞的数量。（B） SEMA6A和6D同时沉默后周细胞粘附分析（n=5）。（C） miR-27a和miR-27b以及SEMA6A和6D沉默后的周细胞粘附分析（n=10）。（D） 使用siRNAs沉默MBMEC中Sema6d后内皮-周细胞共培养的TEER。将3.0×104周细胞接种在膜的下侧，24h后将相同数量的转染内皮细胞接种到膜的上侧。连续5天测量TEER。72小时后给出统计数据（n=4）。使用Newman–Keuls多重比较试验的单向方差分析（A；用于单次治疗）、Student’s t检验（B；用于双转染）、Bonferroni多重比较试验（C）或配对Student′s t检验的单向方差评估（D）来评估统计显著性*P≤0.05，**P<0.01，***P<0.001。]()
图6
miR-27a/b通过靶向SEMA6A和SEMA6D控制内皮-周细胞相互作用。(A类) 7.5 × 104将GFP标记的周细胞添加到转染的内皮融合单层中2小时，并在洗涤和用4%PFA固定后通过计数GFP阳性细胞来评估粘附的周细胞的数量(n个= 5). (B类)SEMA6A和6D同时沉默后周细胞粘附分析(n个= 5). (C类)miR-27a、miR-27b、SEMA6A、6D沉默后周细胞粘附分析(n个= 10). (D类)使用siRNAs沉默MBMEC中Sema6d后内皮-周细胞共培养的TEER。3.0 × 104周细胞接种在膜的下侧，24h前将相同数量的转染内皮细胞接种到膜的上侧。连续5天测量TEER。72小时后给出统计数据(n个= 4). Newman–Keuls多重比较测试的单向方差分析(A类; 单次治疗），学生的吨-测试(B类; 对于双转染），使用Bonferroni的多重比较测试进行单向方差分析(C类)或配对学生的吨-测试(D类)用于评估统计显著性*P（P）≤ 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
综上所述，我们的数据表明，内皮细胞miR-27b通过调节内皮细胞中信号素的表达，控制周细胞粘附并部分改善血管屏障功能。
讨论
在当前的研究中，我们证明了miR-27a/b对EC-周细胞相互作用的调节。miR-27b的过度表达增加了周细胞对EC单层的粘附和EC管周细胞的覆盖体外另一方面，miR-27a/b的抑制减少了周细胞粘附，减少了EC试管的周细胞覆盖率体外主动脉环EC芽周细胞覆盖率。体内miR-27a/b的抑制降低了小鼠子宫内膜血管的周细胞覆盖率，导致器官含水量增加。
如前所示29miR-27a和miR-27b在内皮细胞中高度表达。这里我们表明miR-27a和miR-27b的表达受单向剪切应力上调体外和体外此外，我们可以证明层流剪切应力诱导miR-27b上调是由流诱导转录因子KLF2介导的。一致地，miR-27b的初级转录物（c9orf3）以及前体（数据未显示）被KLF2上调。此外，沉默KLF2可消除剪切应力诱导的miR-27b上调。生物信息学miR-27b启动子的分析揭示了一个推测的SP1/KLF结合位点，该位点在进化上是保守的，并且在人类和小鼠之间只有一个核苷酸不同。对于miR-27a，Khan等。表明剪切应力通过转录因子MEF2增加表达。30事实上，MEF2A的沉默显著减弱了剪切应力诱导的miR-27a上调。
先前的研究表明周细胞在调节子宫血管稳定性中起着重要作用31,32和BBB。15,33miR-27的抑制降低了小鼠子宫内膜微血管周细胞的覆盖率。miR-27抑制后周细胞覆盖率降低似乎增加了子宫的含水量，表明血管通透性增加。由于miR-27被系统性抑制体内有人可能会认为周细胞覆盖率的降低是由于激素系统的调节，该系统被证明受miR-27的影响。34特别是，miR-27a被报道间接增加雌激素受体α体外。35然而，我们体外组织的数据和组织学分析体内支持miR-27沉默可以减少EC与周细胞的相互作用。由于子宫内膜微血管周细胞覆盖率降低，导致血管脆弱、渗漏和出血，32miR-27对周细胞-内皮相互作用的控制可能足以解释表型。
为了评估miR-27对血管通透性的影响，我们研究了BBB功能。为此，我们首先通过测量TEER来测试miR-27b是否影响EC-周细胞共培养的屏障特性。在miR-27b过度表达后，EC与周细胞共培养的屏障特性增加，而在miR-27抑制后，屏障特性降低。
与我们的发现相反，Young等。11miR-27a过度表达后，血管通透性增加。这些作用归因于VE-卡德林的抑制，它直接影响EC-EC相互作用并增加内皮通透性。然而，在缺乏周细胞的情况下，我们的研究没有显示miR-27对EC单层的屏障特性的影响（参见数字2E类和三F类). 值得注意的是，与Young相比等。11我们没有用VEGF激活内皮细胞，而VEGF可以增加内皮细胞的通透性。此外，我们使用初级MBMEC，而Young等。11使用HUVEC进行实验。由于与HUVEC相比，大脑内皮细胞形成更紧密的屏障，这可能是对看似相反的发现的一种解释。
我们确认了之前的发现8,9其中miR-27针对语义素家族成员，即SEMA3B、SEMA6A和SEMA6D。此外，我们可以首次证明miR-27靶向HUVEC中的血管生成素-2，而血管生成素是周细胞募集的负调节因子。28然而，人Ang-2的3′UTR中的miR-27结合位点在小鼠中并不保守。因此，周细胞覆盖率的调节机制体内在小鼠中可能不受Ang-2的抑制。体外，我们提供了miR-27调节EC-周细胞相互作用的机制，即通过抑制SEMA6A和SEMA6D，因为我们可以通过沉默SEMA6A和SEMA6 D来挽救miR-27抑制介导的周细胞粘附减少。在MDA-MB435肿瘤模型中，SEMA3B可降低肿瘤血管周细胞覆盖率。19然而，在我们体外研究中，我们没有发现SEMA3B对EC-周细胞相互作用有任何影响。一种解释可能是研究中使用了不同的模型和细胞。
总之，我们的研究报告了流动诱导的miR-27b对内皮细胞-周细胞相互作用的积极调节，这符合剪切应力促进血管成熟的概念，血管成熟与高度的壁细胞覆盖（周细胞或平滑肌细胞）有关。12从机制上讲，miR-27通过抑制排斥蛋白SEMA6A和SEMA6D来促进内皮细胞-周细胞的相互作用。
补充材料
补充材料位于心血管研究在线。
作者的贡献
St.D.构思并监督了该研究；St.D.、S.D.、D.K.和R.A.B设计的实验；S.D.、A.D.、K.D.、K.S.、Y.M.、A.E.、T.L.、T.K.和D.K.进行了实验；C.M.Z.、M.H.、S.M.和S.L.提供了概念性建议；S.D.、D.K.、R.A.B.和St.D.分析数据；S.D.、R.A.B.和St.D.撰写了手稿。
致谢
作者感谢A.Fischer、N.Konecny和M.Muhly-Reinholz的技术支持。
利益冲突：未声明。
基金
这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（SFB/TR23-A10和A7）的支持。K.D.得到了JUSTBRAIN FP7欧盟项目的支持。
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E类
,泽特贝格
E类
,素食主义者
我
,赫尔滕比
K（K）
,棕榈
J型
,薄荷糖
M。
重度月经出血患者子宫内膜微血管周细胞覆盖率低与VEGF-A的微血管表达相关
。国际分子医学杂志
2015
;35
:433
–438
。 33丹麦人
R（右）
,周
L（左）
,开比蒂
AA公司
,巴雷斯
文学士。
胚胎发生过程中血脑屏障完整性需要周细胞
。自然
2010
;468
:562
–566
。 34梅尔滕斯·塔尔科特
SU公司
,诺拉托
GD公司
,锂
X（X）
,天使-莫拉莱斯
G公司
,贝托尔迪
国会议员
,保险柜
美国。
桦木酸在体内外抑制ER阴性乳腺癌细胞生长：Sp转录因子和microRNA-27a:ZBTB10的作用
。摩尔癌
2013
;52
:591
–602
。 35锂
X（X）
,梅尔滕斯·塔尔科特
SU公司
,张
S公司
,金
K（K）
,球
J型
,保险柜
美国。
MicroRNA-27a间接调节MCF-7乳腺癌细胞雌激素受体{alpha}的表达和激素反应性
。内分泌学
2010
;151
:2462
–2473
。
作者注释
代表欧洲心脏病学会出版。保留所有权利。©作者2017。有关权限，请发送电子邮件至：journals.permissions@oup.com。
