摘要
早期研究表明，转化生长因子-β3（TGFβ3）在支持细胞紧密连接（TJ）动力学调节中具有重要意义，可能是通过其对闭塞素、克劳丁-11和闭塞小带-1（ZO-1）表达的抑制作用。然而TGFβ3调节支持细胞TJ通透性屏障的机制尚不清楚。利用半定量逆转录-PCR（RT-PCR）、免疫印迹、免疫组织化学和不同激酶抑制剂技术，结合生理学技术评估支持细胞TJ屏障功能，研究表明，TGFβ3对支持细胞TJ动力学的诱导作用是通过p38丝裂原活化蛋白（MAP）激酶途径介导的。首先，支持细胞-TJ屏障的组装与支持细胞TGFβ3的产生和表达的短暂但显著的下降有关。此外，在TJ组装期间向支持细胞培养物中添加TGFβ3确实用IC扰乱了TJ屏障50第二，TGFβ3诱导的TJ屏障的破坏与MEKK2中的瞬时诱导有关，但与介导TGFβ2作用的其他上游信号分子（如Smad2、Cdc42、Rac2和N-Ras）无关，这表明该效应可能通过p38 MAP激酶途径介导。观察到TGFβ3在TJ屏障受到干扰时也诱导活化和磷酸化形式的p38 MAP激酶的蛋白水平，证实了这一假设。第三，也许是最重要的一点，TGFβ3介导的对TJ屏障的抑制作用和TGFβ3-诱导的p-p38 MAP激酶的产生可以被一种特异性p38MAP激酶抑制剂SB202190阻断，但不能被一种特殊的MEK1/2激酶抑制剂U0126阻断。因此，这些结果明确证明TGFβ3利用p38 MAP激酶途径调节支持细胞TJ动力学。
介绍
在精子发生过程中，构成血睾屏障（BTB）的支持细胞紧密连接（TJs）必须间歇性地拆卸和重新组装，以便于在周期的第八和第九阶段，前瘦素和瘦素精母细胞通过该屏障移位（有关综述，请参阅[1–三])。因此，在分化为单倍体精子细胞的同时，精母细胞可以从生精上皮的基底细胞向管腔腔室移动[三,4]. 然而，这些事件的生化和分子基础尚不清楚。然而，最近的研究表明，生殖细胞在生精上皮上的运动显然需要蛋白酶、蛋白酶抑制剂和连接复合物成分的参与，而这些成分又受细胞因子和信号分子的调节（有关综述，请参阅[1,5–7])。例如，以前的研究表明，当体外组装支持细胞TJ通透性屏障时，它会及时诱导一些TJ相关蛋白，如闭塞素、闭塞小带-1（ZO-1）和克劳丁-11[8–11]，这是TJ的构建块（有关审查，请参阅[1,12–14])。此外，体外组装支持细胞TJs与支持细胞内源性TGF（转化生长因子）β2和TGFβ3表达的下降有关[10]. 这些结果说明TGFβ3和TJ相关蛋白之间存在相互关系。不用说，这些研究也暗示了TGFβ在TJ动力学中的重要性。为了证实和扩展这些早期的研究，我们已经证明，在TJ组装期间向支持细胞培养物中添加重组TGFβ3确实可以触发ZO-1和闭塞素的表达骤降，扰乱TJ屏障[10]. 这些结果也与早期研究一致，这些研究表明，干扰素-γ和肝细胞生长因子能够干扰T84和Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中TJ屏障的组装，可能是通过降低ZO-1的表达或导致ZO-1重新分布，将其从TJs位点转移到细胞质[15,16]. 然而，利用这些细胞因子（如TGFβ3）调节TJ动力学的下游信号通路完全未知。作为我们正在努力研究精子发生过程中TJ动力学的生物学和调节的一部分，我们试图确定TGFβ3用于调节这些事件的途径。如果这个信息是已知的，将会有几个重要的后果。首先，这将为理解睾丸TJ动力学的生物学提供线索。第二，可以设计一些研究来破坏体内血睾屏障的完整性，从而干扰生殖细胞在支持细胞TJ-屏障上的运动，破坏精子发生，这可能会导致新型男性避孕药的开发。第三，这甚至可以为理解某些无法解释的男性不育的病理生理学提供线索。
几项研究表明，TGFβ通过与TGFβII型受体的初始相互作用调节细胞功能，该受体是一种假定的Ser/Thr蛋白激酶，在与配体偶联后活化时能够进行自磷酸化（参见图1)（有关审查，请参阅[17–19])。这反过来又导致TGFβI型受体的磷酸化，这种活化的I型受体通过四种信号通路之一诱导信号（见图1). 其中包括SMAD（介导TGF-β受体及其相关因子的信号传导的细胞内蛋白，以已鉴定的前两种蛋白命名，Sma in秀丽隐杆线虫然后疯了果蝇属)蛋白质[20]和三种不同的促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs，也称为ERKs，细胞外信号调节激酶），即i）应激活化蛋白激酶（SAPK）或c-六月N末端蛋白激酶（JNK），ii）p38 MAPK（p38），以及iii）细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）（参见图1). 它们相应的上游传感器分别是Cdc42/Rac GTPases、MEKKs（MAP/ERK激酶激酶）和Ras GTPases（有关审查，请参阅[21,22])。众所周知，TGFβ诱导的基质金属蛋白酶13（MMP-13）的表达是通过激活成纤维细胞中的p38介导的[23]. TGFβ通过激活ERK1/2和JNK，也可以上调牙龈成纤维细胞中胶原酶-1的表达[24]. 此外，TGFβ诱导的SMAD磷酸化可以与Co-SMAD形成复合物，进而将活化的多蛋白复合物转移到细胞核，通过特定转录因子诱导基因活化[17,25,26]. 例如，纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的转录是由Smad蛋白和转录因子TEF3（转录增强因子3）的协同作用诱导的[27]. 因此，TGFβ3可能通过以下四种途径之一干扰支持细胞TJ屏障（参见图1).
![示意图说明了TGFβ用于影响细胞功能的四种信号通路。该图是根据审查[18,19,21]编制的。在这些综述中可以找到描述这些途径中所描述的关键分子发现的原始文章。MEKKs、MAP/ERK激酶激酶，包括MEKK1、MEKK2、MEK03和其他；JNK，c-Jun NH2末端激酶，也称为Jun激酶或应激激活蛋白激酶，SAPK；JNKK，c-Jun NH2-末端激酶；MKK3，MAP激酶激酶3；MEK1/2、MAP/ERK激酶1和MAP/ERK激酶2；ERK1/2、细胞外信号调节激酶1和细胞外信号调控激酶2。](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/biolreprod/68/5/10.1095_biolreprod.102.011387/1/m_bire-68-05-15-f01.jpeg?Expires=1721156126&Signature=fZkFofkGtbVDknEf-3OVb8-rRq6a0d4B8gTVTrn1Z-8QHhpN0s~MGx-mINEr291hzjuGy6pQ9-NGxiF~6xQZhRvSlf5d857pNsVBE3A8Nr20xKeS2PxKdtVGXyjnKNMbTUvy-2nfq9CeieG7fYc3K7gjP7lYf27VEjBFYPirmcpay0hW7UrdZJu5MpbxHSKQ7jDI7xulg90JvWa59A4aAtfH-lWT0htoxQTtgwEQkUIYEZwctrj3irSWGHeWDvHUL2TogXXGgEUm5WTY~2-QhcQ7pDgn24G3CC0qXJi70zgYe0kgcdFuOz1hLg1LrQgAYc0hB3BG3HThMTxMNtvR8Q__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图1。
示意图说明了TGFβ用于影响细胞功能的四种信号通路。此图是根据审查编制的[18,19,21]. 在这些综述中可以找到描述这些途径中所描述的关键分子发现的原始文章。MEKKs、MAP/ERK激酶激酶，包括MEKK1、MEKK2、MEK03和其他；JNK，c-Jun NH公司2-末端激酶又称Jun激酶或应激激活蛋白激酶SAPK；JNKK，c-Jun NH公司2-末端激酶；MKK3、MAP激酶激酶3；MEK1/2、MAP/ERK激酶1和MAP/ERK激酶2；ERK1/2、细胞外信号调节激酶1和细胞外信号调控激酶2。
在本研究中，我们试图解决以下问题。首先，我们扩展了之前的监管研究[10]使用免疫印迹法检测蛋白质水平并评估IC50转化生长因子β3。其次，我们检测了四种信号传感器的细胞分布和发育调节，以及它们在体外TJ组装过程中的变化。第三，研究了TGFβ3发挥作用的上游信号分子和信号通路。这些研究又通过使用不同的MAP激酶抑制剂和蛋白质免疫印迹技术得到证实。
材料和方法
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠取自Charles River Laboratories（马萨诸塞州金斯顿）。一氧化碳致大鼠死亡2窒息。洛克菲勒大学动物护理和使用委员会批准在本研究中使用动物，方案编号为00111和95129-R。
抗体
本文报告的研究中使用的多克隆抗体是在兔体内针对人源（TGFβ3、JNK、p-JNK，p-ERK1/2、p-38、p-p38、MEKK2、Rac2）或大鼠源（ERK1/2）的相应蛋白制备的。Smad2、Cdc42、N-Ras的单克隆抗体来自使用人类（Cdc42，N-Ras）或小鼠（Smad2）来源抗原的小鼠骨髓瘤细胞。从Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）购买了针对JNK的抗体（类别号9252，批号4）、p-JNK（类别号9351S，批号3）、ERK1/2（类别号9102，批号5）、p-ERK1/2。TGFβ3（分类号sc-82，批号H280）、MEKK2（分类号sc-1088，批号A181）、Rac2（分类编号sc-96，批号G231）和N-Ras（分类号sc-31，批号D111）的抗体来自圣克鲁斯生物科技公司（加州圣克鲁斯）。抗Cdc42（cat.no.610842，lot.no.5）和Smad2（cat.no.610928，lot.no.5）的抗体来自BD Transduction Laboratories（加利福尼亚州圣地亚哥）。本研究中使用的所有抗体与制造商指示的相应大鼠蛋白发生交叉反应。与辣根过氧化物酶（HRP）结合的牛抗兔IgG（cat.no.sc-2370，lot.no.B051）和山羊抗鼠IgG。目录和批号都显示出来了，因为从其他供应商选择的抗体未能产生初步实验中所示的令人满意的结果。
睾丸细胞培养实验的制备
支持细胞培养
如前所述，从20日龄Sprague-Dawley大鼠中分离出初级支持细胞[28,29]. 新鲜分离的Sertoli细胞以高密度（0.5×10）培养6细胞/厘米2)在无血清火腿F12营养混合物（F12）和Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（1:1，v/v）中的Matrigel-coated 12孔培养皿上[10]. 然后在35°C下，在95%空气：5%CO的增湿大气中培养细胞2（v/v）。为了获得纯度大于95%的Sertoli细胞培养物，用20 mM Tris（pH 7.4）对细胞进行低渗处理2.5分钟，以在电镀36小时后溶解污染的生殖细胞[30]. 此后，将支持细胞上皮清洗两次，以清除细胞碎片。每24小时更换培养基，并将细胞再培养6-7天。在RNA提取的指定时间点终止培养。
成年大鼠睾丸支持细胞的分离
从60天龄和90天龄Sprague-Dawley大鼠睾丸中分离出支持细胞，基本上如前所述[31].
生殖细胞
通过机械程序从5日龄、10日龄、20日龄、40日龄、60日龄、90日龄雄性Sprague-Dawley大鼠睾丸中分离出生殖细胞，无需使用tryspin[32]如前所述[33].
重组人转化生长因子β3蛋白培养的支持细胞
如上所述制备的支持细胞在Matrigel涂层的12孔培养皿上以0.5×10的密度培养6细胞/厘米2为了研究TGFβ3在Sertoli TJ组装时对细胞基因表达的影响，在这些培养物分离后立即将重组人TGFβ3蛋白（3ng/ml）（Calbiochem Corp.，La Jolla，CA）加入到这些培养物中。每24小时更换一次含有TGFβ3的培养基。
人重组TGFβ3和MAP激酶抑制剂（芹菜素、SB202190和U0126）对体外支持细胞TJ屏障组装的影响
如上所述分离的支持细胞在Matrigel-coated双腔单元（Millicell HA过滤器；Millipore，Bedford，MA）上以高细胞密度培养，以便组装TJ。这些培养物用于评估芹菜素（4′，5,7-三羟基黄酮，所有MAP激酶的抑制剂）的作用[34]，SB202190（4-（4-氟苯基）-2-（4-羟基苯基）-5-（4-吡啶基）1H-咪唑，一种特定的p38激酶抑制剂）[23]和U0126（1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-二（2-氨基苯硫基）丁二烯，一种特定的MEK1/2激酶抑制剂）[35]在没有（对照组）或存在重组TGFβ3的情况下，在TJ通透性屏障上。芹菜素和SB202190购自Calbiochem（加利福尼亚州拉霍亚），U0126购自Cell Signaling Biotechnology（马萨诸塞州贝弗利）。为了制备这些抑制剂的储备溶液，将芹菜素（10 mM）、SB202190（3 mM）和U0126（10 mM）溶解在二甲基亚砜中。使用前，将这些抑制剂在F12/DMEM中稀释至所需浓度。简单地说，将新鲜分离的Sertoli细胞以1.2×10的比例放置在顶部室的Matrigel-coated HA滤膜上6细胞/厘米2并在第0天作为培养物处理[36]. 为了评估支持细胞TJ屏障的组装，使用Millicell电阻系统（Millipore Corp.）对支持细胞上皮的TER（跨上皮电阻）进行量化，如所述[10,37]. 为了研究不同MAP激酶抑制剂对TJ屏障的影响，新鲜分离的Sertoli细胞单独培养3 h，然后分别用芹菜素（1 nM-1μM）、SB202190（0.1 nM-1µM）和U0126（10μM）预处理细胞16 h、20 min和1 h，然后用F12/DMEM连续两次清洗，以去除这些抑制剂。然后在替换培养基中加入TGFβ3（3 ng/ml）。每24小时，在两房单位的顶部（0.5 ml）和底部（0.5 ml）隔间补充含有TGFβ3的培养基。还包括两组对照组，即i）不含TGFβ3或抑制剂的单独培养的支持细胞，以及ii）含TGF？3的支持细胞。在指定的时间点测定支持细胞上皮的TER。每个时间点有三次培养，每个实验使用不同批次的Sertoli细胞重复至少两次。
支持细胞富集培养基和支持细胞裂解液的制备
如上所述制备的支持细胞在Matrigel涂层的12孔培养皿上以0.5×10的密度培养6细胞/厘米2长达7天。如前所述，每天从两个盘子中收集Sertoli细胞富集培养基（SCCM）[28]. 为了获得细胞裂解物，用F12/DMEM短暂冲洗12孔培养皿中的培养物。将细胞重新悬浮在1 ml SDS样品缓冲液中（0.125 M Tris，pH 6.8，22°C，含1%SDS，1.6%2-巯基乙醇，2 mM PMSF，1 mM EDTA），并在室温下培养5分钟。在用于通过免疫印迹分析活化MAP激酶的样品中，上述裂解缓冲液还含有1 mM原钒酸钠（蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，PTPi）和0.1μM冈田酸钠（蛋白质Ser/Thr磷酸酶抑制剂（PPi））。样品经过超声波处理、涡流处理，并在15000×克在4°C下保持10分钟。收集上清液并用作总细胞裂解物。通过考马斯蓝染色结合试验进行蛋白质评估[38]使用BSA作为标准。
免疫组织化学
使用一次性刀片在−20°C的低温恒温器（HM 500M型；德国Walldorf Microm Lab Gmbh）中获得冰冻切片（～8μm厚）。截面放置在多边形上-我-赖氨酸涂层玻片，在室温下风干，并在Bouin固定剂中固定5min。用1%过氧化氢（v/v）处理20min，可阻断切片中的内源性过氧化物酶活性。用10%正常山羊血清孵育1h，可阻断非特异性位点。然后将组织切片与兔多克隆抗TGFβ3多克隆抗体在35°C下以1:50的稀释度孵育过夜，然后用PBS洗涤三次（每次5分钟）。然后，将切片与山羊抗兔IgG与辣根过氧化物酶的缀合物孵育30分钟，并用PBS洗涤三次。使用3.3′-二氨基联苯胺试剂系统（Zymed，South San Francisco，CA）观察免疫反应性TGFβ3蛋白5-10分钟。然后将载玻片在水中清洗10分钟以停止反应，并用迈尔苏木精进行复染。通过以下方法进行对照：i）用正常山羊血清替换一级抗TGFβ3抗体，ii）用正常兔血清替换一次抗TGF，用正常山羊血清替代第二抗体。
半定量逆转录和聚合酶链反应检测靶基因稳定状态mRNA水平及其在支持细胞TJ屏障组装过程中的变化
半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）基本上如前所述进行[10,37,39,40]检测实验组内不同样本中选定靶基因表达的变化。同时处理实验组内的所有样本进行RNA提取和RT-PCR，以消除实验间的差异。简言之，使用0.3μg寡核苷酸（dT）将约2μg总RNA反向转录到cDNA中15使用Moloney鼠白血病病毒逆转录试剂盒（Promega，Madison，WI），最终反应体积为25μl。常规进行PCR时，将2–3μl RT产物与0.4μg与大鼠核糖体S16引物对（～0.03μg）共扩增的选定靶基因引物对的正反义各结合起来(表1). 包括与S16共扩增，以确保在每个反应管中反向转录和扩增等量的RNA。使用不同浓度的引物对（即目标基因和S16）、不同的目标基因与S16的比率、不同浓度的RT产物和不同的PCR周期，进行了初步实验，以确保目标基因的PCR产物和S16仍处于线性阶段。然而，值得注意的是，在大多数情况下，由于S16的基本稳态mRNA水平与所研究的靶基因之间的差异，反应中S16 PCR产物的线性接近饱和，而靶基因处于指数期。然而，这些初步实验表明，在靶基因表达与S16标准化后，可以对治疗组内的样本进行统计比较。为了有力地证实这些结果，大多数使用RT-PCR的关键实验都是通过使用商业上可买到的针对相应靶基因的特异性抗体进行免疫印迹来验证的。然而，这些免疫印迹分析表明，半定量RT-PCR的结果是可靠的。为了进行PCR分析，RT产物与5μl 10×PCR缓冲液、3μl MgCl混合2（25 mM）、8μl dNTPs（dATP、dGTP、dCTP和dTTP各200μM）、1.25 U Taq DNA聚合酶（Promega）和无菌双蒸馏水，最终体积为50μl。PCR反应的循环参数如下：94°C变性1分钟，58–59°C退火2分钟（使用的温度取决于初步实验中确定的待研究的目标基因），72°C延伸3分钟，共21–26个循环，然后在72°C下延长15分钟。为了提高检测限并为密度扫描提供数据以进行半定量分析，PCR是通过加入[γ-32P] -标记的引物。简言之，靶基因和S16的义引物在5′端用[γ]标记-32P] -dATP（比活性，6000 Ci/mmol；Amersham Pharamacia Biotech），使用T4多核苷酸激酶（Promega）。约0.5×106每个PCR反应使用cpm[32P] 目标基因的标记义引物与S16的比率与未标记引物的比率相似。为了确保两个目标基因（如PCR中的Smad2和S16）合成的线性，提取18、20、22、24和26个周期的10μl等分PCR产物，并将其分解为5%T型聚丙烯酰胺凝胶，使用0.5×TBE（44.5 mM三硼酸盐，1 mM EDTA，pH 8.0）作为流动缓冲液，用于初步实验中的可视化。凝胶电泳后，通过溴化乙锭染色对PCR产物进行可视化，并使用柯达X-OMAT AR s射线胶片进行放射自显影（Eastman Kodak，Rochester，NY）。使用Pharmacia Ultroscan XL激光密度计（LKB 2222-020型）在600 nm处对三个独立实验的自射线照片进行密度测量扫描，根据S-16标准化，并用于统计分析。
表1。用于RT-PCR的引物，用于分析编码S16和不同靶基因的mRNA。
| 目标基因. | 底漆顺序. | 方向. | 职位. | 长度. | 参考. |
|---|
| 第16页 | 5′-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCT-3′ | 感觉 | 15–38 | 385 | [58] |
| 5′-GCCAAACTTCTTGGATTCGCAGCG-3′ | 反义 | 376–399 | | |
| Smad2公司 | 5′-AGCCGGTGGGTCTGGAGGAGC-3′ | 感觉 | 63–83 | 244 | [59] |
| 5′-GTAAGGCCTGTTGTCCCA-3′ | 反义 | 286–306 | | |
| Cdc42公司 | 5′-gttggtgatggtgctgtggg-3′ | 感觉 | 25–44 | 528 | [60] |
| 5′-GGGTTGAGTTTCCGGAGGCTC-3′ | 反义 | 532–552 | | |
| 种族2 | 5′-GAGGCCCCCCGACCACCTAC-3′ | 感觉 | 127–148 | 196 | [61] |
| 5′-TGGCTACCATCTGGATCCGT-3′ | 反义 | 299–322 | | |
| MEKK2公司 | 5′-AGCCAGTCGGCACGCATTAT-3′ | 感觉 | 56–75 | 279 | [62] |
| 5′-TGTGAATACTGCGAGC-3′ | 反义 | 315–334 | | |
| N-Ras公司 | 5′-AAACTGGTGGTGTTGGAGCAGG-3′ | 感觉 | 13–35 | 518 | [63] |
| 5′-CCATCGTCCACTGTTGAG-3′ | 反义 | 511–530 | | |
| 目标基因. | 底漆顺序. | 方向. | 职位. | 长度. | 参考. |
|---|
| 第16页 | 5′-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCT-3′ | 感觉 | 15–38 | 385 | [58] |
| 5′-GCCAACTCTCTGGATTCGACGCG-3′ | 反义 | 376–399 | | |
| Smad2公司 | 5′-AGCCGGTGGGTCTGGAGGAGC-3′ | 感觉 | 63–83 | 244 | [59] |
| 5′-GTAAGGCCTGTTGTCCCA-3′ | 反义 | 286–306 | | |
| Cdc42公司 | 5′-GTTGTGATGTGCTGTGTG-3′ | 感觉 | 25–44 | 528 | [60] |
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| 种族2 | 5′-gaggccccgacgaccctac-3′ | 感觉 | 127–148 | 196 | [61] |
| 5′-TGGCTACCATCTGGATCCGT-3′ | 反义 | 299–322 | | |
| MEKK2公司 | 5′-AGCCAGTCGGCACGCATTAT-3′ | 感觉 | 56–75 | 279 | [62] |
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| 5′-CCATCGTCCACTGTTGAG-3′ | 反义 | 511–530 | | |
表1。用于RT-PCR的引物，用于分析编码S16和不同靶基因的mRNA。
| 目标基因. | 底漆顺序. | 方向. | 职位. | 长度. | 参考. |
|---|
| 第16页 | 5′-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCT-3′ | 感觉 | 15–38 | 385 | [58] |
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| Smad2公司 | 5′-agccggtgggtctggagggagc-3′ | 感觉 | 63–83 | 244 | [59] |
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| Cdc42公司 | 5′-GTTGTGATGTGCTGTGTG-3′ | 感觉 | 25–44 | 528 | [60] |
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| 种族2 | 5′-GAGGCCCCCCGACCACCTAC-3′ | 感觉 | 127–148 | 196 | [61] |
| 5′-TGGCTACCATCTGGATCCGT-3′ | 反义 | 299–322 | | |
| MEKK2公司 | 5′-AGCCAGTCGGCACGCATTAT-3′ | 感觉 | 56–75 | 279 | [62] |
| 5′-TGTGAATACTGCGAGC-3′ | 反义 | 315–334 | | |
| N-Ras公司 | 5′-AAACTGGTGGTGTTGGAGCAGG-3′ | 感觉 | 13–35 | 518 | [63] |
| 5′-CCATCGTCCACTGTTGAG-3′ | 反义 | 511–530 | | |
| 目标基因. | 底漆顺序. | 方向. | 职位. | 长度. | 参考. |
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| 第16页 | 5′-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCT-3′ | 感觉 | 15–38 | 385 | [58] |
| 5′-GCCAACTCTCTGGATTCGACGCG-3′ | 反义 | 376–399 | | |
| Smad2公司 | 5′-AGCCGGTGGGTCTGGAGGAGC-3′ | 感觉 | 63–83 | 244 | [59] |
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| Cdc42公司 | 5′-GTTGTGATGTGCTGTGTG-3′ | 感觉 | 25–44 | 528 | [60] |
| 5′-GGGTTGAGTTTCCGGAGGCTC-3′ | 反义 | 532–552 | | |
| Rac2型 | 5′-GAGGCCCCCCGACCACCTAC-3′ | 感觉 | 127–148 | 196 | [61] |
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| 5′-CCATCGTCCACTGTTGAG-3′ | 反义 | 511–530 | | |
免疫印迹法检测支持细胞TJ组装过程中TGFβ3蛋白的表达
在组装Sertoli细胞TJ屏障的过程中，使用0.5×10培养的细胞在指定的时间点收集废培养基6细胞/厘米212孔Matrigel-coated菜肴。在还原条件下，用SDS-PAGE在15%T SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对每个样品在不同时间点的约100μg蛋白质进行了拆分。通过免疫印迹检测SCCM中是否存在TGFβ3蛋白，并使用柯达BioMax胶片通过增强化学发光（ECL）检测系统（Amersham Pharmacia Biotech）显示TGFβ3。
支持细胞TJ组装过程中激活的p38 MAP激酶的检测
从含有或不含TGFβ3处理的培养物中获得的支持细胞裂解物中的蛋白质（200μg）被分解为7.5%T型SDS-聚丙烯酰胺凝胶。TGFβ3治疗后JNK、p38和ERK1/2的活化通过免疫印迹法测定，免疫印迹使用的抗体针对相应MAPK的总形式和磷酸化/活化形式。简单地说，蛋白质电泳转移到硝化纤维纸上后，用0.1%吐温-20/5%的PBS-Tris（10 mM Tris，10 mM磷酸钠，0.15 M氯化钠，pH7.4，22°C）中的脱脂干乳封闭印迹1小时，然后用0.1%的吐温-20/PBS-Tris进行三次洗涤（一次15分钟，两次5分钟）。清洗后不久，将印迹培养在含有0.1%BSA（w/v）的PBS-Tris中0.1%的一级抗体中。然后将印迹与PBS-Tris中的0.05%牛抗兔IgG HRP/0.1%BSA孵育1小时，并通过ECL检测系统进行可视化。
统计分析
在本文报告的所有实验中，结果来自使用不同批次细胞的三个单独实验。在每个实验中，每个时间点或治疗组都有重复或三次培养。在每次培养实验中，使用20天大的大约10-20只大鼠，以获得足够的细胞数量，以制备所需的复制/三倍培养物和不同的治疗组。为了完成本报告中描述的整个研究，在2年内共使用了400只大鼠。使用来自Dynamic Microsystems Inc.（Silver Spring，MD）的GB-STAT（7.0版）的统计分析软件包进行统计分析。对于中显示的结果图2,4,5,6、和10，统计分析由Student执行t吨-测试。在图2和10，将实验中的每个治疗组与不含TGFβ3或TGFβ3+抑制剂的相应对照培养物进行比较。在图4将生殖细胞中相应TGFβ上游信号分子的mRNA和蛋白水平与Sertoli细胞进行比较，后者被任意设置为1。在图5和6，支持细胞和生殖细胞中相应的TGFβ上游信号分子的稳态mRNA水平(图5、B和D)或睾丸(图6B)在其他年龄段，我们将其与最年轻的年龄组进行比较，该年龄组被任意设置为1。对于中显示的数据图8、G和H、和9亿使用Tukey诚实显著性差异检验进行方差分析，其中每个样本组在指定时间点与同一实验中的其他样本组进行比较。例如，对于中显示的数据图9B（右图），方差分析显示，与第0、4、5、6和7天的细胞相比，TGFβ3处理后第1-3天TJ组装期间Sertoli细胞中p-p38的蛋白水平显著升高，这也与未经TGFβ2处理的培养物不同（左图）。
![体外组装支持细胞TJ-通透性屏障和重组TGFβ3在支持细胞TJ屏障上的IC50期间，支持细胞富集培养基（SCCM）中TGFβ_3蛋白水平及其在支持细胞培养物中稳态mRNA水平的变化。A） 在组装Sertoli细胞TJ屏障的过程中，从特定时间点终止的培养物中提取的100微克SCCM蛋白被加载到15%T SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。在还原条件下进行SDS-PAGE。使用0.1%抗TGFβ3抗体进行免疫印迹。B） 采用半定量RT-PCR评估TJ屏障组装过程中支持细胞TGFβ3的稳态mRNA水平。C） 将支持细胞（1.2×106个细胞/cm2）培养在Matrigel涂层的双室单位上，不同浓度的TGFβ3在0.001到3 ng/ml之间。在指定的时间点对细胞上皮的TER进行量化，以评估TJ屏障的完整性（见插图）。通过绘制TGFβ3在第5天建立TJ屏障时对支持细胞TJ屏障的抑制百分比来评估IC50，对照组（y轴）针对不同浓度的TGFβ2，在时间0（x轴）添加到培养物中。为了评估抑制率，使用了以下公式：[（TERCtrl−TERExpt）/TERCtrl]×100%，其中TEREExpt表示第5天用特定浓度的TGFβ3处理Sertoli细胞时，以双室单位表示的TER读数，TERCtrl表示第5天细胞未暴露于TGFβ3的相应培养物中的TER读数。每个数据点是使用不同批次细胞的三个单独实验的平均值±SD，每个时间点有三个重复的培养物。ns，经Student t检验，与不含TGFβ3的相应对照组无显著差异；*，经Student t检验，与不含TGFβ3的相应对照组相比，差异显著，P<0.05；**，经Student t检验，与不含TGFβ3的相应对照组相比差异显著，P<0.01](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/biolreprod/68/5/10.1095_biolreprod.102.011387/1/m_bire-68-05-15-f02.jpeg?Expires=1721156126&Signature=RTka6eIYexjLS0npELSfcCigZ8TgrZzW3kdeniQT5o340h3P2DMkp~~xsTkpBZvztYp-6HOhUlWF8nTdgeoxK1G-P5I3ACbLPSVJV4HL-uAcCrhd~oMV0J1mqmRdtbYoSnDLIl5ohje4HOlGGlnuV-vI26B9UPP6XlAkwMQbqxXKpGolguHPIsOXMKNlrFwxMX-NE~p~Mpmsdg13h4ouXs4dZidUQ5572S~LGxuSoXZOStaHMa1514cwq2sz8yswdQtrAirYzc4ZydC1sFU7ioNYAGMnOPbtnAeVusgdogGpeaJD5pJOQhcBSF-9oA7SEiOxrpWmi2DS6a5LP1nFLw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
图2。
支持细胞TJ通透性屏障和IC组装过程中支持细胞富集培养基（SCCM）中TGFβ3蛋白水平及其在支持细胞培养物中稳态mRNA水平的变化50体外支持细胞TJ屏障上的重组TGFβ3。一个)在组装Sertoli细胞TJ屏障的过程中，从特定时间点终止的培养物中提取的100微克SCCM蛋白被加载到15%T型SDS-聚丙烯酰胺凝胶。在还原条件下进行SDS-PAGE。使用0.1%抗TGFβ3抗体进行免疫印迹。B类)进行半定量RT-PCR以评估TJ屏障组装过程中支持细胞中TGFβ3的稳态mRNA水平。C类)支持细胞（1.2×106细胞/厘米2)在不同浓度TGFβ3（0.001至3 ng/ml）的Matrigel-coated双室培养基上培养。在特定时间点对细胞上皮的TER进行定量，以评估TJ屏障的完整性（见插图）。集成电路50通过绘制TGFβ3在第5天建立TJ屏障时与对照组相比对支持细胞TJ屏障的抑制百分比进行评估(年-轴）对抗不同浓度的TGFβ3，在时间0时添加到培养物中(x-轴）。为了评估抑制率，使用以下公式：[（TERCtrl键−TER（温度）出口)/TER公司Ctrl键]×100%，其中TER出口表示第5天用特定浓度的TGFβ3处理支持细胞时，以两院制单位表示的TER读数，TERCtrl键表示第5天细胞未暴露于TGFβ3的相应培养物中的TER读数。每个数据点是使用不同批次细胞的三个单独实验的平均值±SD，每个时间点有三份培养物。ns，与Student未使用TGFβ3的相应对照组无显著差异t吨-测试；*，与Student未使用TGFβ3的相应对照组有显著差异t吨-测试，P（P）< 0.05; **, 与Student未使用TGFβ3的相应对照组有显著差异t吨-测试，P（P）< 0.01
图4。
20日龄大鼠睾丸分离的支持细胞和生殖细胞中TGFβ上游信号转导子的相对表达。一个)采用半定量RT-PCR评估支持细胞和生殖细胞中Smad2、Cdc42、Rac2、MEKK2和N-Ras的稳态mRNA水平。免疫印迹在平行实验中进行，以使用相应的特异性抗体评估支持细胞和生殖细胞中这些信号传感器的相对蛋白水平（参见材料和方法). (C类).B类)该图显示了使用自射线照片或免疫印迹（如图中所示）的相应密度扫描结果一个和C类。根据S16标准化的三个不同实验中的三批细胞的结果表示为平均值±SD。每个实验都有三份培养物。这些分析表明，免疫印迹的结果与RT-PCR数据一致。统计分析由Student执行t吨-将生殖细胞与相应的Sertoli细胞进行比较的测试，该细胞被任意设置为1，Student与Sertoli细胞显著不同t吨-测试，P（P）< 0.05; **, Student与Sertoli细胞显著不同t吨-测试，P（P）< 0.01
图5。
支持素转化生长因子β上游信号转导子稳态mRNA水平的发育调控(一个,B类)和细菌(C类,D类)单元格。RT-PCR用于评估Sertoli细胞中Smad2、Cdc42、Rac2、MEKK2和N-Ras的稳态mRNA水平(一个)和生殖细胞(C类)在成熟过程中。B类,D类)相应的密度扫描结果使用自动射线照片，如一个和C类。使用两批根据两个不同实验中的S16标准化的细胞，将结果表示为平均值±SD。每个实验都有三份培养物。ns，与20日龄大鼠的培养物无显著差异B类和5或10天龄D类，由Student任意设置为1t吨-测试；*，学生之间存在显著差异t吨-测试，P（P）< 0.05; **, 学生之间存在显著差异t吨-测试，P（P）< 0.01; nd，不可检测
图6。
睾丸发育过程中TGFβ上游信号转导子稳态mRNA水平的变化。一个)采用半定量RT-PCR评估睾丸成熟过程中Smad2、Cdc42、Rac2、MEKK2和N-Ras的稳态mRNA水平。B类)该面板显示了使用自动射线图（如图中所示）进行的相应密度扫描结果一个。根据S16标准化的三只不同大鼠睾丸的结果表示为平均值±SD。ns，与5日龄大鼠无显著差异，由Student任意设定为1t吨-测试；*，学生之间存在显著差异t吨-测试，P（P）< 0.05; **, 学生差异显著t吨-测试，P（P）< 0.01.
图8。
当体外组装支持细胞TJ屏障时，在没有（对照）和存在（试验）TGFβ3的情况下，TGFβ上游信号传感器的稳态mRNA和蛋白水平发生变化。支持细胞（0.5×106细胞/厘米2)在不存在的情况下在Matrigel-coated菜肴上培养(一个,C类,E类)或存在(B类,D类,F类)转化生长因子β3（3 ng/ml）被RNA STAT-60终止或在特定时间点在SDS样品缓冲液中溶解。在还原条件下，使用10%的SDS-PAGE对每个时间点的细胞裂解物（～200μg蛋白质）进行分离T型SDS-聚丙烯酰胺凝胶。采用免疫印迹法评估Smad2、Cdc42、Rac2、N-Ras和MEKK2水平的变化(一个,E类)和存在(B类,F类)重组TGFβ3（3 ng/ml）。进行RT-PCR以评估MEKK2稳态mRNA水平的变化(C类)或存在(D类)重组转化生长因子β3（3 ng/ml）。G公司,H（H）)使用放射自显影和免疫印迹的相应密度扫描结果，如C类–F类。结果表示为使用不同批次细胞的三个单独实验的平均值±SD，并根据S16标准化。每个时间点都有重复的培养基。ns，方差分析无显著差异，其中将给定时间点的每个样本与同一实验组内所有其他时间点的样本进行比较；*，方差分析显示差异显著，P（P）< 0.01; D、 天
图9。
在没有和存在TGFβ3的情况下，体外组装Sertoli细胞TJs时，总MAPK蛋白和活化MAPK蛋白水平的变化。支持细胞（0.5×106细胞/厘米2)在缺席的情况下，在Matrigel-coated菜肴上培养（左侧面板，一个)或存在（右侧面板，一个)在组装Sertoli细胞TJ屏障的过程中，在指定的时间点裂解TGFβ3（3 ng/ml），以获得细胞裂解物。每个时间点的200微克全细胞裂解物的蛋白质被加载到7.5%T型在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶和SDS-PAGE。使用针对总JNK、p38和ERK1/2及其相应的磷酸化和活化形式：p-JNK，p-p38和p-ERK1/2的特异性抗体进行免疫印迹。B类)使用ECL印迹结果的相应密度扫描结果，如一个说明活化MAPK的蛋白质水平与总MAPK标准化。使用不同批次的细胞重复此实验三次。每个时间点都有重复的培养基。ns，方差分析无显著差异，其中将给定时间点的每个样本与同一实验组内所有其他时间点的样本进行比较；*，方差分析显示差异显著，P（P）< 0.01; **, 方差分析显示差异显著，P（P）< 0.001; D、 天
图10。
转化生长因子β3对体外用MAPK抑制剂预处理细胞上皮后支持细胞TJ通透性屏障组装的影响。支持细胞（1.2×106细胞/厘米2)用不同浓度的芹菜素（所有MAP激酶的抑制剂；箭头，一个)，SB202190（一种特异性p38激酶抑制剂；箭头，B类)和U0126（一种特定的MEK1/2激酶抑制剂；箭头，C类)分别洗涤16小时、20分钟和1小时，然后用F12/DEM连续洗涤两次以除去任何抑制剂。此后，将TGFβ3（3 ng/ml）添加到支持细胞上皮（箭头，一个–C类). TGFβ3对体外支持细胞TJ屏障组装的影响通过在指定时间点量化细胞上皮的TER进行评估。每个时间点有三份培养物，每个实验使用不同批次的细胞重复三次。结果以平均值±SD表示。在用三种抑制剂中的每一种进行预处理的培养物中，也将其与单独用TGFβ3培养的培养物进行比较（开放箭头）。ns，与相应控制无显著差异，由学生t吨-测试；*，与学生的相应控制显著不同t吨-测试，P（P）< 0.05; **, 与学生的相应控制显著不同t吨-测试，P（P）< 0.01; Ctrl，控制
结果
免疫印迹和半定量RT-PCR分析支持细胞TJ-通透性屏障组装过程中TGFβ3的变化
先前的研究表明，支持细胞TGFβ3稳态mRNA水平显著下降，与体外支持TJ屏障的组装一致[10]. 由于传统免疫染色技术的检测限较低，需要显示约10–30 ng的TGFβ3，因此在Sertoli细胞TJ组装期间TGFβ2蛋白的变化不可见[10]. 当使用增强型化学发光免疫检测系统时，与基于比色法的技术相比，该系统的灵敏度大于200倍，检测到支持细胞废培养基中TGFβ3蛋白的急剧下降与TJ屏障的组装一致(图2A). 这些结果也与RT-PCR数据一致（参见图2B).
IC的测定50体外支持细胞TJ屏障上TGFβ3的表达
在1.2×10的体外培养支持细胞中加入3 ng/ml的重组TGFβ36细胞/厘米2在Matrigel-coated双腔装置上，允许TJ组装确实会干扰Sertoli细胞TJ-渗透屏障的组装（参见插图图2C). IC50在第5天，当支持细胞完成TJ屏障组装时，在0.001到3 ng/ml之间存在不同浓度的TGFβ3时，通过量化支持细胞上皮的TER来评估TGFβ2对支持细胞TJ屏障装配的影响(图2C和插图），表现为细胞上皮上稳定的TER。值得注意的是，TGFβ3只能干扰而不能消除TJ组装事件，因为其抑制程度在0.5和3 ng/ml之间没有差异。TGFβ2诱导的抑制百分比与对照组进行了标准化，并与实验中使用的不同浓度的TGFβ4进行了标绘；集成电路50发现其浓度为9.1 pM，相当于约0.2 ng/ml TGFβ3(图2C).
支持细胞和生殖细胞的光学显微镜表征
塞尔托利(图3，A–C)和细菌(图3，D–F)从不同年龄的大鼠体内分离细胞。本文所述研究中使用的支持细胞制剂纯度大于90%(图3，A–C). 从60天龄和90天龄大鼠睾丸中获得的最终生殖细胞制剂中没有细长的精子细胞，这些精子细胞通过玻璃棉过滤步骤去除(图3、E和F). 从20日龄大鼠分离的生殖细胞主要由精原细胞和精母细胞组成，相对百分比约为50%：50%(图3D). 对于从60天和90天大鼠身上分离的生殖细胞，精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞的相对百分比为16%：19%：65%(图3、E和F)，与早期报告一致[41]. 本文所述研究中使用的生殖细胞制剂基本上没有受到体细胞污染，因为RT-PCR分析未能检测到睾丸素，这是一种假定的支持细胞蛋白[42]，在这些生殖细胞制剂中（数据未显示）。
图3。
对不同年龄大鼠的支持细胞和生殖细胞进行形态学分析，以确认其纯度。从20-(一个), 60- (B类)和90天(C类)从20-(D类), 60- (E类)和90天(F类)大鼠。将细胞固定在增加甲醇浓度（从20%到100%）的溶液中，用1%甲苯胺蓝O（0.1%，w/v）在PBS中染色。细胞制剂的纯度大于95%。巴=100μm英寸一个–C类; bar=20μm英寸D类–F类
血睾屏障后生精上皮TGFβ3上游信号转导子的相对细胞表达
如果TGFβ3确实在精子发生过程中调节支持细胞之间和/或支持细胞与生殖细胞之间的连接动力学中起着关键作用，那么可以想象支持细胞和生殖细胞表达TGFβ相关信号传感器。正如预期的那样，RT-PCR和免疫印迹分析显示支持细胞和生殖细胞都表达Smad2、Cdc42、Rac2、MEKK2和N-Ras(图4，A–C)，四个上游转化生长因子β转换器（见图1). 然而，Smad2、Cdc42、MEKK2和N-Ras在生殖细胞中比支持细胞更占优势，支持细胞与生殖细胞的比率为1:2、1:8、1:5和1:3.5(图4，A和C)分别是。然而，Rac2在支持细胞中更占优势，支持细胞与生殖细胞的相对比率为2:1(图4，A和C). 通过免疫印迹分析，获得了类似的结果(图4、B和C)，确认RT-PCR结果(图4C与图4A).
支持细胞和生殖细胞成熟过程中上游信号转导子的表达
由于支持细胞和生殖细胞之间这些信号转导子的稳态mRNA水平的差异，如图4，我们认为有必要检查这些上游信号传感器在成熟过程中是否有任何变化。值得注意的是，在成熟过程中，支持细胞Smad2和Cdc42的表达增加(图5，A和B). 相反，在成熟过程中检测到Rac2和MEKK2的急剧下降(图5，A和B). 对于N-Ras(图5，A和B)，在Sertoli细胞成熟过程中未检测到明显的表达变化。关于成熟过程中生殖细胞中这些传感器的表达，我们注意到Smad2、MEKK2和N-Ras的稳态mRNA水平在成熟过程中增加(图5、C和D). 然而，Cdc42和Rac2的表达在衰老过程中增加，在20-40天时达到高峰；此后，它们的表达在60-90天龄时下降，恢复到与未成年大鼠相似的水平(图5、C和D).
睾丸上游TGFβ信号转导子的发育调控
由于睾丸成熟过程中支持生殖细胞相互作用和连接重构显著增加，我们检测了发育中睾丸TGFβ上游信号转导子的稳态mRNA水平(图6，A和B). Smad2、Rac2和MEKK2的表达在约10–20天大时达到高峰，此时血-睾屏障形成(图6，A和B)，表明这些信号传感器可能与这些事件有关。然而，Cdc42和N-Ras的稳态mRNA水平在40-90日龄时显著增加(图6，A和B).
转化生长因子β3在生精上皮中的免疫组织化学定位
TGFβ3在生精上皮中被检测到，并以从基底部到管腔室的特定阶段方式定位(图7A). 中显示的本地化图7A由于在对照切片中未发现免疫反应性棕色沉淀物，因此似乎具有特异性(图7B与图7A). TGFβ3在I–X期发现(图7，C–E)在VII–VIII期与精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞相关，但与细长精子细胞无关(图7，C–E). 其定位在第V-VII阶段占主导地位，在第IX和X阶段减弱(图7E). 在XII-XIV期几乎检测不到免疫反应性TGFβ3(图7F). 免疫反应性TGFβ3可从支持细胞的基底区延伸至管腔室附近。
图7。
通过免疫组织化学定位，大鼠睾丸横切面显示生精周期不同阶段生精上皮中TGFβ3的变化。成人睾丸显微照片显示TGFβ3免疫染色的生精上皮(一个,C类–F类)或替代原抗体的正常兔血清(B类). 该抗体的特异性通过免疫印迹证实，如图2.C类)Ⅰ～Ⅴ期生精上皮；TGFβ3免疫反应阳性表达于从基底部向管腔室延伸的上皮细胞。TGFβ3被发现与细长精子细胞相关。D类)VII期生精上皮，免疫染色最强。然而，TGFβ3与精子细胞伸长无关。E类)精子形成后第九和第十阶段的生精上皮和免疫反应性TGFβ3水平降低。F类)第XII-XIV期上皮中未发现TGFβ3免疫染色物质。Bar=120μm，用于一个和B类; bar=50μmC类–F类.
TGFβ3介导的支持细胞TJ-通透性屏障破坏过程中支持细胞MEKK2稳态mRNA和蛋白水平的变化
结果表明，TGFβ3的表达显著下降(图2，A和B)与Sertoli细胞TJ屏障的组装一致(图2C)在TJ组装期间向体外培养的支持细胞中添加重组TGFβ3确实可以扰乱TJ屏障(图2C). 我们检测了TJ组装期间上游TGFβ信号转导子的稳态mRNA水平，以评估其表达模式是否与TGFβ3的表达模式相似。然而，在TJ屏障组装期间，在支持细胞培养物中未检测到Smad2、Cdc42、Rac2和N-Ras蛋白水平的显著变化(图8A)，与RT-PCR结果一致（数据未显示）。在TGFβ3存在下培养Sertoli细胞时也获得了类似的结果(图8B)，已知其干扰Sertoli TJ屏障（参见图2). 这些结果似乎表明Smad2、Cdc42、Rac2和N-Ras不太可能是介导TGFβ3作用的上游信号传感器。而支持细胞MEKK2 mRNA和蛋白水平在支持细胞TJ屏障组装期间保持稳定(图8、C、E和G)在TGFβ3介导的TJ屏障破坏时，其表达模式与其他TGFβ上游传感器形成鲜明对比。当TGFβ3干扰TJ屏障时，MEKK2 mRNA和蛋白质水平增加了四倍(图8、D、F和H)表明TGFβ3对TJ组装的破坏作用是通过MEKK2 MAP激酶介导的(图1).
TGFβ3通过激活p38 MAPK抑制支持细胞TJ组装
为了证实上述观察结果，我们接下来使用针对其总形式和磷酸化/活化形式的特异性抗体，通过免疫印迹法评估了三种不同下游MAPK的激活，如JNK、p38和ERK1/2。支持细胞0.5×10培养6细胞/厘米2在不在场的情况下吃Matrigel-coated菜肴(图9，A和B，左侧面板）或存在(图9、A和BTGFβ3（3 ng/ml）在组装TJ渗透屏障期间的指定时间点终止。细胞在SDS样品缓冲液中进行裂解以获得总裂解物。如所示图9，A和BTJ组装时，对照组和TGFβ3处理的Sertoli细胞裂解液中总JNK和磷酸化/活化JNK（p-54 JNK与p-46 JNK）的水平保持不变。对于ERK1/2，在Sertoli细胞TJ屏障组装过程中也检测到其磷酸化形式的蛋白水平随时间而下降，但未检测到总的非磷酸化形式，但在TJ组装过程中这种变化模式对TGFβ3没有反应(图9、A和B). 相反，Sertoli细胞裂解物中激活的p38水平（p-p38）略有下降(图9、A和B)在Sertoli细胞TJ通透性屏障形成时，约1-3天（参见图2). 更重要的是，TGFβ3以3 ng/ml的浓度存在，不仅消除了支持细胞TJ通透性屏障组装期间p-p38水平的短暂下降；相反，它诱导了p-p38蛋白水平的短暂但显著的增加(图9、A和B).
不同MAP激酶抑制剂对TGFβ诱导的支持细胞TJ-通透性屏障破坏的影响
为了证实TGFβ3确实通过p38 MAP激酶途径介导其对支持细胞TJ屏障的抑制作用，测试了不同抑制剂阻断TGFβ3-诱导作用的能力。当1 nM至1μM的芹菜素在TGFβ3（3 ng/ml）治疗前16 h添加到支持细胞上皮细胞中，阻断整个MAPK通路时，它阻断了TGFβ3-介导的效应(图10A). 这一结果清楚地说明TGFβ3通过MAP激酶发挥其作用。在TGFβ3治疗前20分钟，在支持细胞上皮细胞上添加0.1 nM至1μM的特异性p38 MAP激酶抑制剂SB202190，也可以剂量依赖性地阻断TGFβ2的作用(图10B). 相反，当MEK1/2 MAP激酶抑制剂U0126（10μM）阻断Ras/ERK1/2通路时[35]（请参见图1)，但未能阻断TGFβ3的作用(图10C)，说明了芹菜素和SB202190治疗的特异性，如图10，A和B.
SB202190和TGFβ3预处理前后TJ屏障组装过程中支持细胞总数和活化p38 MAP激酶蛋白水平的变化
因为SB202190可以阻断TGFβ3介导的对Sertoli细胞TJ屏障的抑制作用(图10)因此，研究其是否也阻断了TGFβ3介导的p-p38 MAP激酶水平的升高至关重要。为了验证这一点，Sertoli细胞在0.5×106细胞/厘米2在不在场的情况下吃Matrigel-coated菜肴(图11A)和存在(图11B)在添加TGFβ3（3 ng/ml）之前，预处理SB202190（0.1 nM）(图11C)在TJ组装期间的特定时间点终止，以获得总裂解产物用于免疫印迹分析。如所示图11当TGFβ3干扰支持细胞TJ屏障时，磷酸化/激活的p38水平受到刺激(图11B)，类似于中所示的结果图9然而，先用SB202190预处理支持细胞，然后用TGFβ3预处理，可以消除TGFβ3-诱导的p-p38 MAP激酶蛋白水平(图11C与图11B)使p-p38的表达模式类似于未经TGFβ3处理的单独培养细胞(图11A与图11、B和C). 因此，这些结果明确证明TGFβ3诱导的TJ破坏是通过p38 MAP激酶途径介导的。
图11。
重组TGFβ3对体外SB202190预处理20 min的TJ组装期间Sertoli细胞中总蛋白和活化的p38 MAPK蛋白水平的影响。支持细胞（0.5×106细胞/厘米2)在缺席的情况下培养(一个)和存在(B类)添加TGFβ3（3 ng/ml）之前，使用SB202190预处理20分钟(C类). 在TJ屏障组装期间的特定时间点，细胞在SDS样品缓冲液中溶解。每个时间点的200微克全细胞裂解物的蛋白质被加载到7.5%T型在还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶和SDS-PAGE。使用针对总p38和磷酸化/活化形式的p38（p-p38）的特异性抗体进行免疫印迹
讨论
TGFβ3是调节支持细胞TJ动力学的唯一决定因素吗？
二十多年来，人们已经知道，在大鼠第VIII-XI阶段，精母细胞通过血-睾屏障及时移动，进入管腔室进一步发育[43]，调节这一事件的参与分子和生化基础完全未知。本文的研究结果首次表明，TGFβ3通过MEKK2/p38MAP激酶途径在支持细胞TJ动力学的调节中发挥关键作用。然而，TGFβ3不太可能是控制这些事件的唯一参与者。首先，关于IC的研究50本文报道的转化生长因子β3的表达表明，虽然该细胞因子能有效干扰支持细胞TJ屏障，但它不能阻止体外支持细胞TJ-通透性屏障的组装。其次，最近关于支持细胞TJ动力学调节的研究表明，决定细胞磷酸蛋白含量的激酶和磷酸酶的相互作用在调节TJ动力学中也起着关键作用[44]. 例如，PTPi（如原钒酸钠）或PPi（如冈田酸钠）的使用都会干扰Sertoli细胞TJ屏障的组装[45]. 尽管如此，这些抑制剂无论单独使用还是联合使用，在有效且可逆地干扰支持细胞TJ通透性屏障的同时，也未能阻止体外TJ组装的整个过程[44,45]. 综上所述，很明显睾丸中的TJ动力学受一系列分子和信号通路的调节，这些分子和信号途径密切相关，但也有差异调节。这种复杂性在生理上也很重要，因为其中一个信号事件的失败不会导致生殖细胞运动的停止，从而阻止精子发生。
细胞因子在调节TJ动力学中的作用
最近使用不同上皮细胞和内皮细胞的研究表明，细胞因子如肝细胞生长因子（HFG）、白细胞介素（IL）和干扰素-γ（IFN-γ）在调节TJ动力学中的生理意义（有关综述，请参阅[46])。例如，HGF引起ZO-1的重新分布，将其从TJs位点转移到细胞质，并减少了occludin与ZO-1的结合，这反过来又扰乱了MDCK细胞中的TJ渗透屏障[15]. IFN-γ已被证明可降低T84细胞中闭塞素和ZO-1的表达[16]. 在之前的研究中，我们还证明TGFβ3可能通过抑制与TJ组装相关的闭塞素和ZO-1的及时表达而干扰支持细胞TJ屏障。然而，目前还没有进一步的研究来确定细胞因子在调节TJ动力学中调节其作用的信号通路。最近的一项研究表明，已知由支持细胞和生殖细胞产生的另一种细胞因子TNF-α（综述见[7,47])通过对金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂（TIMP）水平的影响，可以调节细胞外基质的稳态，进而调节支持细胞动力学[48]. 综上所述，这些数据清楚地说明了细胞因子在睾丸TJ动力学中的关键作用。
TGFβ3干扰支持细胞TJ屏障的分子机制
在本报告中，我们提供了令人信服的证据，证明TGFβ对支持细胞TJ通透性屏障的抑制作用是通过p38-MAP激酶途径介导的。首先，TGFβ3介导的对TJ屏障的抑制作用与MEKK2表达、p38 MAP激酶上游传感器的增加有关，但与Smad2、Cdc42、Rac2和N-Ras无关（参见图1). 这些结果强烈表明TGFβ3对TJ组装的破坏作用是通过MEKK2 MAP激酶信号通路介导的。其次，TGFβ3诱导了p-p38的短暂激增，而不是免疫印迹技术所证明的p-JNK或p-ERK。第三，也许最重要的是，TGFβ3对Sertoli细胞TJ屏障的诱导作用可以通过使用SB202190（一种特异性p38 MAP激酶抑制剂）对Sertoni细胞进行预处理来逆转，但不能通过使用U0126（一种特异性MEK1/2抑制剂）来逆转。此外，SB202190不仅可以阻断TGFβ3诱导的干扰支持细胞TJ屏障的效应，还可以阻断TGF-β3诱导p-p38 MAP激酶蛋白的瞬时诱导。在这方面，值得注意的是，TGFβ3介导的对支持细胞TJ屏障的抑制作用仅与p38-MAP激酶（p-p38）的活化和磷酸化形式的增加有关，而与整个p38-MA激酶无关。这些结果似乎表明，TGFβ3诱导的瞬时p-p38 MAP激酶增加在某种程度上触发了一个尚待定义的转录激活途径。这反过来又会关闭闭塞素、克劳丁-11和ZO-1的生产，这些是维持TJ功能所需的构建块。目前正在研究调节闭塞素启动子的相关转录因子。或者，TGFβ3可能刺激p38 MAP激酶的磷酸化，从而激活干扰TJ组装的其他分子。例如，已知p38 MAP激酶激活可诱导成纤维细胞中的MMP-13[24]. 事实上，其他研究表明，TJ和AJ（细胞-细胞肌动蛋白为基础的粘附连接，如睾丸特异性AJ类型的胞质特化）的动力学至少部分受到蛋白酶和蛋白酶抑制剂的调节[9,48,49]. 因此，TGFβ3诱导的p38激活可能通过多种途径发挥作用。值得注意的是，Sertoli细胞TJ的组装也与pERK1/pERK2蛋白表达的下降有关，这似乎表明诱导其表达可能会扰乱TJ通透性屏障。
TGFβ介导的信号通路在睾丸中的其他功能
早期研究表明，TGFβ信号机制由一个精心设计的信号传感器网络组成。这些包括Smad蛋白和MAP激酶（有关综述，请参阅[21,22]; 另请参阅图1). 例如，已知转化生长因子β信号转导子之一Smad2在小鼠支持细胞和生殖细胞中表达，并参与精子发生的调节[50]. 令人惊讶的是，自从这些TGFβ上游信号转导子在睾丸中发现以来，还没有对其在睾丸中的细胞分布和发育调控进行详细的研究。在此，我们报道了支持细胞和生殖细胞都表达所有已知的TGFβ上游和下游信号分子，这表明这些细胞配备了所有必要的传感器来调节TGFβ信号以实现各种生物功能。此外，这些结果还清楚地表明，虽然TGFβ诱导的对支持细胞TJ屏障的抑制作用是通过p38MAP激酶途径介导的，TGFβ和/或其他细胞因子可以利用这些其他信号传感器在睾丸内执行其他生物效应，对维持正常睾丸功能至关重要。更重要的是，这些结果表明生殖细胞具有与支持细胞相同的信号对应物。在建立支持细胞TJ屏障后，TGFβ3的水平仍然升高（见图2A和B），这一观察结果也表明，虽然TJ屏障需要短暂降低TGFβ三，但可能需要升高水平来维持支持细胞上皮的健康。
TGFβ3是睾丸中的一种阶段特异性蛋白
先前的研究表明，TGFβ1和-β2在大鼠睾丸中的定位具有阶段特异性，在第VIII-IX阶段发现TGFβ2的下降，在第V和VI阶段检测到TGFβ2中的定位增加[51]. 然而，尚不清楚TGFβ3是否具有阶段特异性。在本研究中，我们用免疫组织化学方法检测了TGFβ3在大鼠生精上皮中的定位。大鼠生精上皮中的TGFβ3是一种阶段特异性蛋白，在第V-VII期最高，随后下降，主要与精母细胞和早期精子细胞有关，但不与伸长的精子细胞相关，但在第XII-XIV期的上皮中几乎检测不到。
TJ动力学调控中的当前分子模型
目前有两种可用的分子模型（综述见[1]）试图解释脂肪酸、氨基酸、葡萄糖和IgG等小分子如何穿过上皮性TJ，以允许小肠吸收食物，并允许中性粒细胞和巨噬细胞在炎症反应中穿过TJ。首先，Ca2+交换机模型（有关详细信息，请参阅[52])。这个模型是基于对Ca消耗的观察2+MDCK细胞诱导TJ屏障立即破坏。添加[Ca后2+]对媒体而言，TJ屏障重新密封。我们最近发现，Sertoli TJ屏障也可以通过操纵[Ca2+]在文化媒体中[37]. 第二，ATP消耗-再补充模型[52]假设当ATP从系统中耗尽时，ZO-1与细胞骨架蛋白fodrin结合。这反过来又将ZO-1侧向拉离TJ位点，导致TJ渗漏。当ATP充满时，ZO-1和fodrin之间的结合被破坏，允许ZO-1分子移回TJ位点，重新密封TJ[53]. 然而，这些模型显然只能解释TJ在体外如何泄漏，从而允许小分子和离子通过。这与BTB的动力学形成对比，BTB必须进行分解和重组，以允许处于微米大小范围的前精母细胞和精母细胞通过。最近的研究表明，细胞磷蛋白含量是调节TJ组装/拆卸的重要决定因素。例如，TJ在血脑屏障中的组装需要闭塞素。然而，高水平的闭塞素不足以确保这些TJ中的高电阻；相反，它受闭塞素磷酸化状态的调节[54]. 最近一项关于MDCK细胞中TJ组装的研究表明，高磷酸化的闭塞素选择性地集中在TJ上，而非磷酸化或磷酸化较少的闭塞素分布在基底外侧膜上[55; 有关审查，请参阅1]. 此外，酪氨酸磷酸化增加会导致AJ-和TJ-相关蛋白的重新分布。这反过来扰乱了TJ渗透屏障[56]和AJ动态[57]. 综上所述，TGFβ可能与其他分子协同作用，但在不同的旁分泌和/或激素控制下调节细胞在BTB上运动的有趣事件。
致谢
我们感谢M.Y.Mo博士在对包括Smad2、Cdc42、Rac2、MEKK2和N-Ras在内的多个PCR产品进行核苷酸序列分析以确认其身份方面提供的出色技术支持。我们还感谢Dolores Mruk博士在整个工作过程中的关注和有益的讨论。
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作者注释
©2003生殖研究学会。
