不同肿瘤细胞药物反应特征的高含量表型分析

在过去二十年中，高通量靶向药物发现一直是制药和生物技术部门青睐的研究范式。尽管在后基因组时代，人们越来越多地发现了假定的治疗靶点，随着靶向药物发现的广泛采用，针对新靶点的药物批准数量稳步下降，由于毒性和不良反应，候选药物在临床前和临床开发期间的消耗显著增加(1, 2). 定向靶向筛选鼓励了简单生化或工程细胞分析的应用。尽管这些方法易于高通量筛选，并已导致发现有效且高度选择性的激动剂和拮抗剂，但它们提供的治疗药物如何影响复杂生理系统的信息有限。这种限制是导致药物开发过程后期高消耗率的一个因素。

自动化高内容成像和图像分析方法的进展为传统的目标导向筛选方法提供了一种替代方案(三–5). 应用成像技术分析细胞或组织水平上分子或药物扰动的表型反应，可以研究治疗反应，而不考虑假定的靶点活性(6, 7). 最近的研究使用高含量细胞分析来显示表型分析的价值，首先确认细胞活性，其次结合多元聚类技术来阐明药物作用模式或主要靶点未知的作用机制（MOA）(8–10).

患者、肿瘤部位和疾病分期之间的获得性耐药性和内在异质性对靶向药物成功治疗癌症提出了重大挑战(11–13). 为了促进有效抗肿瘤药物的发现和开发，有必要在早期药物发现中重新概括肿瘤异质性。作为异质患者群体或不同癌症表型替代物的不同癌症细胞系的药理学反应的表型分析可能有助于开发针对冗余肿瘤耐药机制或不同遗传和表观遗传特征的治疗或药物组合物(14–16). 迄今为止，高含量表型分析的实际例子主要局限于细胞系和表型反应标记，包括外源表达的蛋白质，这些都适用于预定义的图像分析解决方案(8, 17, 18). 大多数高含量分析和相关图像分析算法都是针对特定细胞系进行手动优化的，或者使用限制为独立于不同细胞形态的通用特征的有限参数集。这些方法排除了对生理相关细胞群中选择性药物诱导的复杂异质反应或细胞形态细微变化的详细分析。

在本报告中，我们描述了基于多参数高含量细胞的分析和定制设计的图像分析算法的开发和应用，以实现对不同类型癌症细胞的细胞骨架、核和细胞形态变化的详细监测。多参数高含量表型分析的一个重要瓶颈是数据处理，包括质量验证、归一化和二次多元统计分析(19). 我们描述了集成到自动数据分析工作流中的三种新的多参数高含量分析方法的应用：Mahalanobis hit分层，以识别由多参数表型反应测量确定的活性化合物和剂量，Kohonen神经网络分析用于监测剂量反应和细胞类型的多参数表型反应，KNN分类用于对化合物相似性进行排序并预测由多参数图像分析读数确定的MOA。这些方法能够在药物筛选级联所需的时间范围内快速查询跨多个细胞系的复杂高含量表型反应数据。我们用小分子化合物库对四种不同的癌细胞株进行微扰后的表型反应进行了分析，展示了这些方法的实用性。我们的数据和分析方法为以下四种代表不同组织起源和p53突变状态的癌细胞系的药理反应提供了新的见解：Ovcar3（卵巢）、MiaPaCa2（胰腺）和MCF7细胞野生型和突变型p53（乳腺）。

细胞系MCF7-wt（表达野生型p53的乳腺癌）、MCF7-p53（转染显性阴性截断型p53突变基因）、MiaPaCa2（胰腺癌）和Ovcar3（卵巢癌）在以下培养基中进行继代培养：含有RPMI 1640、10%胎牛血清、1%谷氨酸MAX（200 mmol/L）、，和900μg/mL G418；含DMEM的MiaPaCa2、10%胎牛血清和1%谷氨酸MAX（200 mmol/L）；以及含有RPMI 1640、10%胎牛血清和1%谷氨酸MAX（200 mmol/L）的Ovcar3。所有培养基和补充剂均由Sigma提供。所有细胞保持在37°C，5%CO₂和100%湿度。对于高含量分析，细胞在Accutase（Sigma）中重新悬浮，并使用WellMate孔（基质）在95μL培养基中每孔5000个细胞的情况下，将细胞镀在胶原蛋白涂层的黑色96-well透明底板（Becton Dickinson）上，但Ovcar3除外，Ovcar3在每孔12000个细胞的条件下镀。随后在37°C、5%CO下培养这些平板₂添加化合物前，保持100%湿度24小时。所有细胞系最初均来自美国类型培养物收集。对MCF7-wt细胞进行基因工程，以表达显性阴性、反式激活不足的p53突变，获得稳定表达克隆，并在抗生素（900μg/mL G418）选择培养基中进行继代培养。随后，通过对保守DNA片段进行条形码测序，并与美国类型培养物收集DNA图谱进行比较，所有细胞系均被鉴定为代表原始亲本衍生物。LGC有限公司于2009年使用标准化ABI3730xl测序平台进行了所有细胞系DNA测序。

制备所有化合物，并在96-well微量滴定板中以八点半对数剂量反应在100%二甲基亚砜中以1000倍最终药物浓度滴定。每种化合物的最高浓度都是从先前公布的表明细胞分析活性的数据中选择的。使用帝肯自动分配系统制备复合稀释液。使用Biomek Fx–自动分配系统，将化合物稀释板中的5μL分配到含有250μL细胞培养基的中间板中，并在将5μL转移到每个细胞板之前进行混合。细胞板与化合物和0.1%二甲基亚砜对照在37°C、5%CO下培养₂，和100%湿度下放置24小时和48小时。

使用cell-IQ仪器（Chip-Man Technologies Ltd）对不同细胞类型的化合物反应进行动力学分析。Cell-IQ是一个完全集成的培养箱、相控图像采集和人工智能解决方案，用于化学扰动后的动力学分析表型反应。细胞接种于7.5×10^三在添加化合物之前，在48孔多孔板（Nunclon）中每孔培养24小时。然后，Cell-IQ在120小时内每隔20分钟对每个井的三个感兴趣区域进行成像。所提供的补充数据代表了每个化合物治疗从一个角度来看的一致示例。

所有免疫染色程序均在室温下在96个钢板中进行。除非另有说明，否则所有体积均为100μL。将PBS中的100μL 8%多聚甲醛直接添加到细胞中（最终浓度为4%），然后固定细胞，并培养20分钟。细胞在PBS中清洗三次，并在封闭缓冲液（含有1.1%牛血清白蛋白和0.2%Triton X100的PBS）中培养30分钟。在封闭缓冲液（1:500；小鼠抗β-微管蛋白IgG1，Sigma T5293）中稀释的一级抗体溶液以40μL/孔的速度加入，并孵育1小时。用封闭缓冲液清洗细胞三次，并用封闭缓冲溶液培养30分钟。（40μL）Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG（H+L；分子探针A21202；以1:500稀释）、与Alexa Fluor 568缀合的Phalloidin（分子探针A12380；以1:500稀释）和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma D8417）的二抗溶液在封闭缓冲液中以1:250稀释，与细胞在黑暗中孵育45分钟。用PBS清洗细胞三次。添加以1:120000稀释的深红色HCS细胞膜（分子探针，H34560），孵育10分钟。细胞用PBS清洗两次。成像前用黑板密封剂密封板。

所有图像都是在自动化ImageXpress 5000A高内容成像平台（分子器件）上采集的，使用×20 PanFluor ELWD Ph1 DM物镜和16位相机装箱分辨率为1。使用针对细胞板和细胞类型优化的基于激光的自动聚焦参数，每个孔获得四个独立的视野。使用Definiens-Cellenger认知网络软件创建的定制分析算法进行图像分析。对图像进行如下处理以进行分析。

第一步：质量控制检查。使用DAPI和肌动蛋白层强度的平均值和标准差以及细胞膜层的平均强度的预期值，创建聚合分数。此分数必须高于指定的阈值，图像质量才能继续。此过程是自动运行的，以确保每个图像的质量都可以接受，从而实现准确的细胞分割。

第二步：核分割。DAPI通道中像素对比度和强度值的组合用于查找核区域。基于DAPI通道上形状和强度度量的迭代设置的重塑方法用于分离离散核，并从控制和复合扰动细胞系中准确分割一系列不同的核表型。

第三步：细胞分配和细胞质分割。Definiens使用基于对象的方法，因此在“细胞核级别”之上创建了一个基于细胞掩码和指骨样蛋白相关参数的更高对象级别，以使用距离分水岭技术将细胞核分配给各自的细胞。通过定义背景上方的感兴趣区域，计算三个非DAPI通道乘积的对数分数，并忽略低于定义阈值的区域，可以实现细胞分割。

步骤4：子群体分类。根据亮度级别和形状度量，单元格被分类为“其他”或“圆形”。设置手动形状度量阈值，以确保其他细胞在形态上不是椭圆形或圆形。Definiens中的一个定制功能用于通过将对象的“形状指数”除以其“密度”来确定具有细长且不规则细胞骨架形态的细胞形状索引在Definiens中定义为对象的边界长度除以其面积平方根（表示“边界平滑度”）和“密度”的四倍定义为形成图像对象的像素数除以基于协方差矩阵的近似半径（“图像对象像素的空间分布”）。因此，对于含有“假足类”的细胞，由于像素的空间分布更大，密度应该更低，而形状指数应该更高，因为假足类突起的存在，边界应该更粗糙。因此，将形状指数除以密度可以得到更高的数值。随后测定细胞膜和指骨蛋白染色的形状指数和密度，从而能够更稳健地检测跛足和伪足结构。如果细胞膜和指骨蛋白层之间的面积和形状/密度度量存在显著差异（反映出更细长和不规则的细胞骨架形态），则细胞被归类为伪足；如果没有显著差异，则分配“正常”表型。对这一自动分类操作的目视检查证实，自动分类为假荚的细胞代表了比正常细胞含有更多假荚延伸的细长细胞。

步骤5：对单个细胞进行分割，计算150个不同参数，包括DAPI核强度、核面积、Phalliodin强度细胞质/核、微管蛋白密度细胞质/细胞核、细胞周长、细胞数量等。此外，我们计算了圆形、正常和假足类的亚类化作为总细胞的比例。测量参数的完整列表见补充图S2。

所有图像分析测量值均取每个微孔样品的细胞群平均值，以给出“良好水平”测量值。

为了说明基于强度的测量中每周的可变性，通过减去每个微量滴定板的阴性对照的中位数，在逐个特征的基础上对数据进行归一化。

通过单独的微量滴定板对三硅酸盐样品进行平均，得出每个测量参数的中值。

作为探索和可视化多参数图像分析数据的初始工具，主成分分析（PCA）在R中运行，并在每个细胞系和每个时间点的基础上应用于所有可用数据，包括所有化合物和对照DMSO处理的样品。

从主成分图和手动检查的相应井图像中识别阴性对照云（DMSO对照样品）的异常值。如果图像显示实验伪影，则删除观察结果。

对于每个单元类型和时间点，马哈拉诺比距离度量(20)作为多参数命中分层工具，应用于所有化合物和对照DMSO处理的样品。我们将表型分析中的活性定义为与DMSO阴性对照物云显著不同的东西。我们计算了多维空间中每个负控制观测值与DMSO云中心之间的马氏距离。然后，我们计算样本观测值与DMSO控制云中心之间的马氏距离。如果观察结果与阴性对照非常相似，则此距离将很小。或者，如果化合物的作用与二甲基亚砜对照组显著不同，则距离会很大。对每种化合物在其每种剂量下重复此过程会产生一个距离向量。然后，可以应用马氏距离阈值来识别形状或与DMSO对照的距离方面的非典型反应。显著性值为的手动定义的马氏度量阈值P（P）<0.01被用作自动命中分层工具的基础，以确定DMSO控制云中各细胞类型和时间点的复合处理样品之间的任何显著差异。如果马哈拉诺比斯距离显著大于至少一个测试剂量的选定阈值，则认为该化合物具有活性。

使用所有细胞类型和时间点的多参数表型反应数据生成二维Kohonen网络（或自组织图），以便于对不同细胞类型、时间点和复合剂量的表型药物反应进行比较分析。使用Spotfire Decision-Site软件创建了Kohonen网络。

用于Kohonen网络训练的数据取自多个视场平均后和板内效应归一化后的点。

然后在训练之前，对150个图像特征中的每一个进行Z评分标准化（减去平均值，然后除以SD）。这确保了具有更高幅值的特征不会支配训练算法使用的加权和计算。

地图大小设置为50×50网格，邻域大小为40。

使用高斯邻域函数，初始半径大小为30，在迭代过程中减小为半径2。这种线性递减的半径函数用于使高层结构比使用恒定的半径尺寸更快地出现。

学习率设定为0.05。

该网络被允许训练50000次迭代，尽管在40000次迭代后没有显示出显著的进一步收敛。

生成的图用于可视化每个复合剂量的多参数数据点。

最后，ak个-将最近邻分类算法（kNN）应用于预测变量的原始尺度上，对特定化合物的MOA进行预测。对于具有未知分类的对象（复合），我们首先确定哪个训练集与新对象最接近（最相似），然后将新对象分配给其最常见的类k个最近的邻居。该算法使用21个最近邻和欧几里德距离度量，以leave-on-out为基础进行应用。除了预测之外，我们还可以计算相关的确定性度量，该度量表示具有主要机械类别的最近邻的比例。根据到感兴趣化合物的欧氏距离，可以根据相似性对21个最近邻进行排序。

所有常规数据整理、规范化和多元统计技术的应用都被纳入了使用Pipeline Pilot软件（Accelrys）创建的自动数据处理和报告工作流中。该工作流程是使用一组核心处理组件构建的，这些组件专门用于处理基于多变量平板的高含量筛选数据，并允许根据新的分析快速定制新的工作流程。该工作流程首先将原始数据关联化合物和细胞板与Definiens图像分析的结果连接起来。来自每个井中不同视场的数据被聚集，然后被标准化为平板对照。然后使用Pipeline Pilot工作流自动执行R算法，以执行PCA、Mahalanobis命中分层和kNN聚类。

细胞在化学扰动后的表型反应本质上是不稳定的；对于任何特定的化合物和剂量，多种表型都可能短暂出现，具有不同的时间动力学。为了确定高含量表型分析的最佳时间点，我们使用Cell-IQ仪器的亮场动力学成像能力以及相关的机器学习算法来动态监测定义的表型反应（补充图S1）。补充图S1B和C显示了微管分裂药物秋水仙碱诱导的短暂有丝分裂阻滞表型的动力学如何根据细胞类型和剂量而变化。从获得的动力学表型反应数据中，选择化合物暴露后24小时和48小时的时间点进行详细的高含量分析，以确保捕获跨细胞类型的广泛瞬态和持续表型反应。

肌动蛋白和微管细胞骨架的完整性对细胞生存能力和支持细胞运动、核分裂和胞质分裂至关重要，胞质分裂推动肿瘤生长和转移(21). 我们开发了一种多重高含量细胞形态分析，以详细监测不同类型MCF7-wt（野生型p53）、MCF7-p53（突变型p53，MiaPaCa2和Ovcar3癌细胞的细胞骨架、核和细胞形态。

为了比较和对比相关癌症细胞类型之间小分子诱导的形态学变化，我们的目标是设计一种通用的图像分析算法，以自动监测不同癌症细胞类型中复杂和细微的细胞形态学变化，而无需任何手动基于图像的阈值。在所选的四种细胞类型中，对照细胞和复合处理细胞的不同异质性细胞形态使这一挑战更加复杂(图1A和B). 为了管理从筛选机械上不同的化合物中产生的各种表型，使用Definien的Cellenger软件包设计了一种定制的图像分析算法(22). 最初，该算法通过精确定义细胞和核边界来分割细胞（参见材料和方法）。该算法使用HCS CellMask全细胞染色来定义细胞细胞质、相邻细胞细胞质和背景之间的边界，从而提供了一种稳健的细胞分割算法。当应用这种方法时，即使一个群体中紧密堆积的细胞也可以成功地相互分割(图1A). 该算法使用DAPI DNA结合染色来定义核边界(图1A). 继细胞和细胞核分割之后，该算法接下来量化了每个细胞的细胞骨架和DNA标记强度、形状和纹理以及整个细胞的形状度量。由于Definiens算法是基于上下文的，因此每个度量都可以与每个分割的单元相关联。由于在细胞群体中观察到的细胞表型的广泛异质性，特别是在复合扰动后，进一步的亚群体分割是有益的(23, 24).

本研究中的亚群分割是通过基于基本原理图像分析的方法实现的，使用比率分析和所选细胞形状特征和强度测量的自动阈值（参见材料和方法）。使用这种方法，细胞最初被分为圆形和其他（非椭圆）群体。预先定义了与假足类的数量和大小相关的数值阈值，以区分假足类表型和正常形态表型。假足类表型分类对应于细长细胞，与归类为“正常”表型的细胞相比，含有丝状肌动蛋白的假足类和跛足类延伸物的细长细胞数量显著增加（详细的亚类化标准见材料和方法）。因此，在这项研究中，细胞被分成四个不同的亚群：圆形、其他、伪足和正常(图1C). 在每个子种群中，每个细胞可以提取和量化100多个直接特征参数（完整的参数列表参见补充图S3）。这样的分类可以在井水平上详细分析复杂和异质表型以及细胞亚群。在使用该算法可以检测到的多种不同表型中，我们还显示了描绘上皮细胞到间充质细胞转变的能力(图1D). 将MCF7-wt细胞与非选择性Src酪氨酸激酶抑制剂PP2以3μmol/L孵育24小时可诱导上皮表型。这种上皮表型可以与HDAC-1和一氧化氮合酶抑制剂丙戊酸在150μmol/L下孵育24小时后诱导的间充质表型相区分(图1D). 补充图S1和图S1中描述的动力学和多参数图像分析方法图1能够采用统一的方法分析复合治疗后相关细胞模型的复杂和独特的表型反应。

在适用于药物发现的时间范围内，对包含时间序列和不同细胞类型的多维分析格式的大量多参数数据进行分析是一项重大的后勤挑战。在Accelrys的Pipeline Pilot软件的支持下，我们开发了一种创新的数据分析协议，该协议结合了多变量统计工具，可以自动整理、分析和排序多参数高含量表型结果。

PCA可以简单地可视化剂量反应中的大型、复杂、多参数表型反应。图2A显示了样本分数对前三个主要成分的投影，这解释了数据集中约60%的变化。中间的红色云是阴性对照组（0.1%二甲基亚砜处理样品）；图中的每个点代表特定剂量的化合物。这些点用化合物着色，并用剂量之间的线连接。在三个主要成分的三维散点图中，剂量范围内的不同表型反应通常显示为不同的轨迹(图2). 马氏距离度量是一种多参数距离统计(20)，可通过确定非典型反应的形状或与DMSO载体云的距离来定义分析中的活性-阴性对照（见材料和方法）。如主成分分析所示，通过手动检查DMSO控制云周围的控制和复合处理图像，为每次分析校准马氏距离阈值。用户定义的马氏距离度量和适当的置信限(P（P）<0.01），然后自动应用于所有总化合物和剂量，为多参数高含量数据提供稳健和敏感的命中分层方法(图2A).

PCA分析见图2B显示了我们对化合物处理的MCF7-wt细胞进行的高含量形态分析的多参数分析。蛋白质合成抑制剂（茴香霉素、环己酰胺、依米汀和雷帕霉素）可以与蛋白酶抑制剂类[ALLN（N-乙酰基-Leucine-Leucine-Norleucinyl）、阿霉素、蛋白酶体抑制剂1、MG132和氯霉素]区分开来。尽管蛋白酶抑制剂类由不同的化学组组成，在很大的表型空间上描绘出广泛的表型簇，但仍会出现这种情况。在这种化学多样性蛋白酶抑制剂组中，存在与不同表型结果相关的靶选择性和结构活性关系的证据。仅有的两种活性肽醛抑制剂MG132和ALLN紧密地聚集在一起，并与该蛋白酶类的其他蛋白酶分开(图2B). DNA复制抑制剂（蚜虫精、阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、丝裂霉素、氟尿苷、羟基脲和丝裂霉素C）分别聚集在一起，可以与一组肌动蛋白分解剂（细胞松弛素B、细胞松弛素D、latrunculin B和茉莉糖苷；图2B). 在肌动蛋白分裂剂簇内，茉莉基内酯虽然表现出与latrunculin B和细胞松弛素B和D相似的表型切线，但在较高剂量下也会分开分段，这可能是由于报道的与丝状肌动蛋白上的阴茎肽结合位点竞争而表现出不同的作用模式(25). 中显示的主成分分析散点图的特征值图2B如下：PC1，58.9%；PC2，27.58%；和PC7，13.5%。PCA分析不仅可以区分肌动蛋白和微管分裂剂，还可以根据井水平的异质表型反应进一步区分微管分裂和稳定剂(图2C). PCA散射图的特征值显示在图2C如下：PC1，63.74%；PC2，29.85%；PC6，6.4%（微管破坏剂）；PC1占58.9%；PC2，27.6%；PC3，13.5%（紫杉醇/埃博霉素B与秋水仙碱/诺卡唑）。癌细胞的上皮-间充质转化与肿瘤转移和治疗反应具有显著相关性。通过PCA分析，我们表明我们的Definiens算法和多参数高含量分析可以区分MCF7-wt细胞的上皮（AG1478和PP2）和间充质（Y27632和丙戊酸）表型(图2D). 中显示的主成分分析散点图的特征值图2C（上皮细胞与间叶细胞）如下：PC1，58.9%；PC2，27.6%；和PC3，13.5%。所有PCA数据显示在图2为MCF7-wt单元（未显示其他单元类型的数据）。自动Mahalanobis和PCA协议在管道中运行，实现了快速、稳健的命中分层，并可视化了复合剂量反应的复杂表型反应。特征值和相关PCA负荷的参考表明了区分化合物诱导反应的精确表型特征，从而告知化合物MOA。

为了监测不同癌症细胞类型的不同表型反应，我们使用了神经网络方法(26). 生成Kohonen网络（自组织图），以二维网格格式显示跨越剂量响应和细胞类型的每个化合物的多维表型数据(26). Kohonen网络能够直接可视化本研究中测试的四种细胞系对特定复合治疗的不同多参数表型反应(图3). 当Kohonen网络聚合时，彼此相似的数据点（在本例中代表相似的多参数表型响应）将在地图的相似区域聚集在一起。通过分析地图上点之间的拓扑关系，我们可以深入了解数据集中存在的表型关系。在本研究中测试的化合物的参考库中，选择的化合物在我们的细胞面板中引发了各种抗性和敏感性模式，这是由随后在地图上对特定表型特征（包括细胞数值和原始图像）的表型空间进行交叉引用确定的。此外，一些化合物在四个细胞系中产生了相同的表型反应，其中剂量反应上的数据点在二维网格内聚集在一起。化合物，如去甲胆碱，根据细胞系组织起源在剂量反应上聚集(图3C); 例如，MCF7-wt和p53突变细胞聚集在一起，代表一种典型的微管破裂表型，以核碎裂和弥散微管染色为例（参见图4A). MiaPaCa2和Ovcar3细胞分别聚集在一起，表现出高度敏感的反应，分别表现为细胞数量减少、细胞毒性表型和部分耐药表型(图3C). 微管稳定剂Epothilone B在所有测试的四种细胞系中诱导类似的表型反应(图3B). 催产素处理后，Ovcar3细胞与MCF7和MiaPaCa 2细胞分开聚集；此外，MCF7-wt细胞的表型反应与MCF7-p53细胞不同(图3D). 与MCF7-wt和Ovcar3细胞相比，MiaPaCa2和MCF7-p53细胞对应的催吐剂表型反应模式与细胞数量值和图像表明，它们对催吐剂治疗更敏感（如细胞数量减少和细胞毒性外观所示）。

Kohonen网络可以使化合物诱导的表型反应在包括剂量反应和细胞类型在内的多个维度上快速可视化。细胞类型对细胞毒性表型特征和细胞类型特异性突变状态的相应表型反应模式可以快速阐明细胞模型的治疗敏感性和耐药性，以及揭示与遗传背景和突变状态相关的新的机制见解（例如，如图3D).

kNN算法是一种简单但直观的算法，它根据新对象与带注释的训练集的表型相似性对未知组中的新对象进行分类。它从训练集上的多变量测量开始，对于这些测量，正确的分类（MOA）是已知的。对于分类未知的对象，我们首先确定哪个训练集与新对象最接近（最相似），然后将新对象分配给其最常见的类k个-最近的邻居。kNN允许根据与形态学分析的多参数Definiens分析定义的注释参考化合物集的表型相似性来预测测试化合物的定量聚类和MOA。图4显示了一个交互式kNN分类器工具的样本输出，该工具使用Accelrys的Pipeline Pilot软件与高内容分析数据和Mahalanobis点击识别方法集成。此工具允许用户从高含量分析中选择任何活性化合物或剂量，然后在整个参考集上运行kNN分类器。输出显示所选感兴趣的化合物、其剂量和基于参考集中21个最近邻中最流行的MOA的预测MOA。分配的MOA的概率分数是通过其21个最近邻居代表主要MOA的比例来计算的。

此外，根据欧几里德距离度量确定的相似性，对21个最近的化合物或邻居进行排序，距离越短，表型越相似(图4A和B). 当交叉参考MCF7-wt细胞暴露于1μmol/L脱甲胆碱（一种微管分裂剂）24小时后的表型特征时，kNN工具以95%的KNNCV概率预测脱甲胆碱实际上是一种微管活性化合物(图4A). 与去甲胆碱最接近的13个特指微管分裂剂(图4A). 显示了对照MCF7-wt细胞的原始采集图像以及暴露于1μmol/L去甲胆碱和0.3μmol/L长春新碱（最接近1μmol/L去甲胆碱）24小时后的图像，以验证交互式kNN结果(图4A). 同样，对于微管稳定剂紫杉醇0.03μmol/L的表型读数，最近的七个邻居也是微管稳定剂(图4B).

最近邻的欧氏距离可用于进一步比较跨细胞系面板的复合MOA。表1根据Definiens高含量形态学研究（化合物治疗后24小时），显示了四种细胞类型中七种选定化合物在选定活性剂量下的前五个最近邻及其剂量（括号内）和欧氏距离相似性度量（括号内的星号）。

对于1μmol/L的去甲胆碱，最接近的是长春新碱，其次是在所有细胞类型中具有短欧氏距离（高度相似性）的一系列长春新汀剂量。这表明去甲胆碱和长春新碱在每个细胞系中都有类似的MOA（微管不稳定剂）。然而，借助Kohonen网络，我们推断脱甲胆碱在细胞板的组织来源之间具有不同的表型反应和潜在的细胞毒性（补充图S5；图3). 对1.5μmol/L的喜树碱（拓扑异构酶I抑制剂和DNA损伤致病菌）进行表型分析表明，其最近的邻居是所有细胞类型中唯一的DNA损伤或DNA复制抑制剂。这些结果显示了我们的检测和相关的kNN工具识别DNA损伤和DNA修复剂的能力。有趣的是，MCF7-wt和MCF7-p53细胞的五个最近邻是氟尿苷、丝裂霉素C和米托蒽醌，而MiaPaCa2和Ovcar3细胞的最近邻是足叶乙甙和蚜虫灵(表1). 这些结果表明喜树碱和/或其最近邻在不同的细胞类型中显示出修饰的MOA。另一种DNA损伤剂，博莱霉素，在1.5μmol/L的浓度下，在细胞板上显示出一组更为多样的最近邻。在这里，MiaPaCa2细胞的前五个最近邻都是DNA复制或DNA损伤剂，MCF7wt细胞系的最近邻也主要在这类化合物中。相比之下，Ovcar3细胞的主要最近邻是氟化钠，MCF7-p53突变细胞的最近化合物由一系列类别组成，没有一种特定的机制普遍存在(表1). 这种机制相似性的变化可能是因为与特定的靶向抑制剂相比，博莱霉素对多种机制有影响，这些机制可能受到特定细胞背景的遗传和表观遗传因素的影响。

在用蛋白合成抑制剂Emetine以1μmol/L处理后，MCF7-wt、MCF7-p53突变体和MiaPaCa2细胞确实有蛋白合成抑制剂作为其最近的邻居(表1). 相反，对于Ovcar3细胞，没有出现蛋白质合成抑制剂作为依米汀的最近邻居，这表明与依米汀孵育24小时对1μmol/L的蛋白质合成没有特定影响，或者与我们在该细胞系中的训练集中的其他蛋白质合成化合物具有不同的MOA。在MCF7-p53细胞中，肌动蛋白干扰物细胞松弛素D和B与1μmol/L的依米汀最接近(表1). 事实上，在原始图像中可以观察到肌动蛋白断裂的证据增多，圆形细胞比例更高（补充图S6）。这提供了一些证据表明，依米汀可能对MCF7细胞内p53状态依赖的细胞骨架和核形态有明显影响。当用Kohonen网络分析催吐剂时，这一假设得到了进一步的加强，因为MCF7-wt和MCF7-p53突变细胞彼此分开聚集，如图所示图3.

虽然辛伐他汀和洛伐他汀是我们参考文库中仅有的两种降脂化合物，但我们的细胞骨架形态分析和方法足够强大，可以根据其表型指纹的相似性将其紧密聚类，辛伐他汀在除Ovcar3外的所有细胞系中都是其最接近的邻居，其中辛伐他汀是第三接近的；然而，在这里，辛伐他汀在2μmol/L时跨细胞类型的欧氏距离最小（4.87），这表明与洛伐他汀具有相似的表型。

我们展示了kNN工具的应用如何通过参考带注释的训练集来预测测试化合物的作用机制。我们进一步展示了结合欧氏距离度量的kNN交互工具如何将化合物相似性排序为感兴趣的化合物，从而根据期望的表型响应促进化合物选择和决策。当应用于我们的多参数高含量形态分析数据时，我们显示了监测不同细胞类型的复合MOA差异的能力。通过基于井水平分析的细微和复杂异质表型变化识别MOA，我们进一步显示了该方法的敏感性和鲁棒性。

使用Accelrys的Pipeline Pilot软件在这项工作中创建和实现的全自动数据分析工作流的示意图如所示图5从Definiens算法中获取的原始数据最初与相关化合物、剂量、细胞类型和时间点进行比较。然后，在归一化为DMSO阴性对照的中位数之前，将每个井四个视场的数据进行汇总。一旦数据标准化，该管道将创建多个输出文件，包括原始数据的Microsoft Excel文件、Spotfire中的PCA可视化、产生有效剂量“命中”识别列表的Mahalanobis命中分层工具，以及交互式kNN-html工具。使用此自动化管道试点工作流程可以快速、稳健地应用上述多元分析和统计工具，从而提高数据的质量、一致性和完整性。这一自动化系统使科学家能够常规使用高端统计和计算分析，在适合高通量筛选的时间线内可视化和量化复杂的药物诱导表型。

基于图像的高内容技术的一个主要目标是提供一个信息量更大、生理相关的筛选平台，以选择用于进一步开发的高质量候选药物(3, 8, 27). 预计在发现和开发的后期阶段，此类方法应通过优先考虑具有改进疗效和毒性特征的新类别治疗药物，减少高水平的化合物消耗(27). 为了实现这种预测能力，有必要对高含量分析的复杂性进行概括体内生物学，包括不同的遗传和表观遗传变异体，这些变异体代表了跨异质患者群体和进化疾病病理生理学的广泛生理学和疾病病理学。在本文中，我们描述了一种灵活的定制高含量表型方法，该方法集成到自动化数据处理工作流中，以快速、稳健地监测生理相关细胞面板的表型反应，这些细胞面板反映患者突变状态或不同的癌源。我们描述了一系列新的图像分析和数据处理工具的应用，这些工具集成到标准的高内容表型分析工作流中，以促进基于相关表型读数的进一步开发的化合物优先排序。本文中描述的高内容工作流首先应用自动延时相控显微镜和机器学习算法来定义适当的时间点，以详细监测细胞表型反应。使用Definiens认知网络技术创建定制设计的图像分析算法，可以测量细胞亚群的特征，从而捕获相关细胞类型的复杂和微妙的表型反应。Mahalanobis度量提供了一种基于多参数表型反应的稳健命中分层方法。手动校准马氏距离阈值以定义DMSO控制的主动响应，然后自动应用于整个数据集，可以在广泛的表型空间内对任何测试化合物、剂量和时间点的化合物活性进行稳健识别。与费力的图像视觉检查相比，这种统计驱动的命中识别方法具有显著优势，不仅在客观性、再现性和科学家节省的时间方面，而且在灵敏度方面。根据我们的经验，马哈拉诺比斯撞击分层工具能够检测到化合物诱导的表型，这些表型代表了人眼可能忽略的细胞形态的细微变化。Kohonen网络的生成使复杂的多维数据集能够简单地可视化。在本研究中，我们应用Kohonen网络策略评估跨剂量浓度和细胞类型的多参数表型反应特征。由于我们开发了一种通用的定制图像分析算法，可以自动测量不同细胞类型的高质量形态学参数，因此只能应用Kohonen网络来比较不同细胞类型之间的表型反应。在本研究中，使用与欧几里德距离度量对齐的kNN（最近邻）分类器，基于与注释参考集的表型相似性对化合物进行排序，然后为任何选定的化合物赋予预测的MOA和相关的概率分数。

在本研究中，我们展示了如何将Kohonen和kNN方法应用于多参数高含量数据，通过将化合物诱导的表型反应与细胞类型和遗传背景相关联来揭示新的机制见解。例如，使用Kohonen网络分析，我们发现与MCF7-p53突变细胞相比，依米汀在MCF7-wt细胞中诱导了明显的表型反应。这些结果表明，催吐剂对癌细胞系肌动蛋白细胞骨架的诱导作用可能依赖于p53功能。据我们所知，这是第一篇报道，描述了催乳素诱导的细胞功能对p53的需求。事实上，以前的研究已经得出结论，p53在催吐剂诱导的肿瘤细胞凋亡中不起作用(28). 对复合物诱导的细胞骨架结构变化的新型p53需求的鉴定可能对肿瘤侵袭和胞质分裂产生重要影响。此外，Kohonen和kNN分析强调了Ovcar3细胞和其他细胞类型之间的几种不同的表型反应。图像的手动可视化显示表明，与其他细胞类型相比，Ovcar3细胞对几种机械化合物类的影响更具抵抗力。相比之下，在许多情况下，MiaPaCa2细胞似乎对复合扰动更敏感。本研究中的kNN分析结果进一步验证了所用方法和工作流程的实用性，显示了自动定义不同机械类别化合物的生物相似性的能力，包括微管分离剂和微管稳定剂、蛋白酶抑制剂、，DNA复制抑制剂和他汀类药物。

将高含量表型分析应用于本研究中描述的相关细胞类型和表型，可以测试明确的临床假设，确保收集具有生物学意义的高含量结果，从而促进化合物选择。我们进一步展示了如何将这些方法集成到通用数据处理工作流中，以便基于化学和生物相似性进行快速决策。

如本文所示，定制设计Definiens图像分析算法以捕获用户定义的具有挑战性的细胞类型和异质性反应的表型的能力表明了将这些方法应用于原发性、患者源性肿瘤细胞的潜力。这些方法可以提供对异质性肿瘤细胞类型（包括癌源性干细胞群体）进行复合治疗后的表型结果之间的直接相关性。

我们预计，本文所述方法的应用与生理相关的高内容屏幕相一致，有可能推动新一代治疗药物的开发，包括根据适当的疾病背景和细胞亚型定制的药物成分或多药。

没有披露潜在的利益冲突。

我们感谢安迪·哈格里夫斯（Andy Hargreaves）、艾玛·库克（Emma Cooke）、丽莎·德鲁（Lisa Drew）、克里斯托弗·丹兹（Christopher Denz）、卢西恩·朗科（Lucienne Ronco）、于丽华（Lihua Yu）和赖忠武（Zhongwu Lai。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记此物品广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。