活性Ras通过过度刺激大胞饮引起胶质母细胞瘤细胞死亡

胶质母细胞瘤是最具侵袭性的人脑肿瘤之一(1, 2). 尽管努力改进手术、放射学和化疗治疗策略，但胶质母细胞瘤患者的预后仍然很差。一个主要问题是原发性肿瘤手术切除后残留的细胞会迅速对化疗药物产生耐药性(三). 此外，胶质母细胞瘤通常含有调节程序性细胞死亡的基因突变（例如。，PTEN，RB公司，以及第53页)使其对传统促凋亡刺激产生抵抗力(4). 这些特征激发了人们对识别诱导胶质母细胞瘤细胞死亡的替代途径的兴趣。

细胞凋亡是程序性细胞死亡的最典型形式。然而，非凋亡形式的细胞死亡现在被认为在胚胎发育、神经退行性变和癌症消退中起着重要作用(5). 在这些情况下，细胞活性的丧失可能以一种独立于半胱天冬酶激活的方式发生。自噬细胞死亡（II型程序性细胞死亡）是研究最广泛的非凋亡细胞死亡形式。其诊断形态学特征是自噬体和降解自溶体的堆积(6). 据报道，几种类型的癌细胞发生自噬死亡(7)，但它在胶质母细胞瘤中受到了特别关注，在那里它可以被烷基化剂诱导(8)，三氧化二砷(9)，电离辐射(10)和雷帕霉素(11). 然而，自噬活性的增加是否真的是细胞死亡的直接原因仍然存在争议。最近的证据支持另一种观点，即自噬体的积累可能意味着一种生存反应，旨在清除细胞中错误折叠的蛋白质或受损的细胞器(12-14).

1999年，Chi等人(15)据报道，激活的Ras GTPase的异位表达通常用于刺激细胞增殖，可触发胶质母细胞瘤和胃癌中的非凋亡细胞死亡。这被描述为自噬死亡，因为细胞形成了许多细胞质空泡。然而，还没有后续研究证实Ras诱导的空泡是自噬体。在本研究中，我们确定了在表达活化H-Ras的胶质母细胞瘤细胞中积聚的大液泡实际上来自大松果体。细胞破裂与这些大胞饮细胞空泡的持续扩张相一致。这些发现为一种新形式的细胞死亡提供了证据，其特征是过度刺激囊泡液体吸收和肿胀的大松果体积聚。我们把这个过程称为methuosis（来自希腊语单词墨脱，意思是喝醉）。

U251细胞存在促凋亡基因突变PTEN公司和第53页并被广泛用作人类胶质母细胞瘤的模型(16). 为了详细描述胶质母细胞瘤细胞中活化Ras表达触发的细胞表型，我们建立了稳定的U251胶质母细胞癌细胞系（U251-C18），该细胞系在添加强力霉素（Dox；图1A). 我们对这些细胞的初步观察大体上与Chi等人的报告一致(15). 也就是说，与myc-tagged Ras（G12V）的表达一致，细胞内充满了透明的细胞质空泡，这些空泡很容易被相控显微镜检测到(图1A). 到第6天，与对照相比，表达H-Ras（G12V）的培养物中的活细胞数量减少(图1B). 这与明显的细胞圆形和脱离培养皿的现象相吻合，大量漂浮碎片暗示细胞解体。在添加Dox后第6天收获的培养物中，分离的细胞占总细胞数的约10%（数据未显示）。在测定钙黄绿素乙酰氧基甲酯（活性）水解和乙炔同二聚体III（死亡；图1C). 另一方面，表达活性Ras的培养物中附着的细胞的存活率为阳性(图1C)并显示了与没有Dox生长的对照细胞相似的S期细胞的DNA直方图（补充图S1）。尽管它们被广泛空泡化，但在添加Dox后第6天收集的附着细胞与未添加Dox的细胞相比，ATP水平没有显著下降(图1D). 然而，与它们的活性降低一致，分离的细胞显示出ATP浓度显著降低(图1D). 综上所述，这些发现表明，导致细胞死亡的代谢衰竭在空泡细胞脱离的后期或之后突然发生。H-Ras（G12V）表达对细胞存活的长期影响在克隆形成分析中很明显，其中添加Dox导致菌落数量减少85%至90%(图1E).

当Ras（G12V）通过逆转录病毒感染（补充图S2）或瞬时核感染引入U251细胞时，观察到相同的空泡化和细胞变性模式(17). 另外七种独立衍生的人脑胶质瘤细胞系，其中一些在PTEN公司（LN229）或第53页（U87MG和A172；参考。16)在H-Ras（G12V）表达后也表现出类似的表型（补充图S2A）。然而，将myc-H-Ras（G12V）引入其他常用细胞（HeLa、HEp2和HEK293）中并没有引起空泡化（补充图S2B）。如前所述，非活动GDP被锁定(15, 17)或非肉桂酸(17)Ras的形式没有引起空泡化，表明细胞表型与特定Ras信号通路的激活直接相关。

对表达H-Ras（G12V）的胶质母细胞瘤细胞进行电子显微镜检查，发现许多直径为0.5至2μm的电子透明空泡，一些较大的空泡达到7至8μm(图2A). 液泡中通常没有细胞质成分或细胞器，尽管有些液泡中含有不明的膜内含物或少量无定形电子致密物质(图2A). 在高倍镜下，液泡周围的膜厚度估计为6至8 nm（补充图S3），与单个膜一致。大的电子透明液泡与符合“经典”自噬体描述的较小结构明显不同(18)管腔细胞质内含物周围有双层膜(图2A,黑色箭头).

为了进一步证实Ras诱导的空泡并非来源于自噬体，我们用一种抗体对细胞进行了免疫荧光染色，该抗体针对一种成熟的自噬体标记物，即微管相关蛋白轻链3（LC3）。LC3以细胞溶质形式（LC3-I）存在，并与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合（LC3-II；参考文献。19). LC3-II的相对量与饥饿和其他刺激诱导的自噬体数量相关(19). LC3抗体（Abgent，Inc.）主要与免疫印迹上的LC3-II反应。因此，我们使用该抗体来确定LC3-II是否定位于液泡膜。正如我们之前报告的那样(17)，myc-H-Ras（G12V）定位于液泡周围的膜中(图2B). 相反，LC3-II在更小的点状结构中被检测到(图2B). 共聚焦显微镜清楚地显示，myc-H-Ras（G12V）包围的大液泡与LC3-II阳性自噬体是分离的(图2C).

因为之前的研究是用瞬时核感染的细胞进行的，所以我们能够将表达myc-H-Ras（G12V）的细胞与相邻的未转染细胞进行比较(图2B,星号). 我们注意到，在转染细胞中，点状LC3荧光更为强烈，这表明自噬体可能与相前驱空泡分开堆积。为了探讨这种可能性，我们测定了稳定的U251-C18细胞中LC3-II的相对数量，这些细胞有或没有myc-H-Ras（G12V）的表达。如所示图2D(左边)myc-H-Ras（G12V）的表达与LC3-II的量增加2.7倍有关，LC3-II归一化为乳酸脱氢酶。然而，这可能反映了自噬体生物发生的增加（细胞宏观自噬途径的刺激）或LC3-II溶酶体周转的减少。一种可用于区分这些可能性的既定方法是比较溶酶体蛋白酶抑制剂存在和不存在时LC3-II的水平(20). 如所示图2D(正确的)在未诱导细胞中添加蛋白酶抑制剂（−Dox）导致LC3-II的基础水平增加3.2倍，与溶酶体LC3-II周转的预期损害一致。然而，当添加Dox诱导myc-Ras（G12V）时，LC3-II的水平比单独添加蛋白酶抑制剂引起的水平增加了2倍。这表明，Ras（G12V）表达诱导的LC3-II增加在很大程度上与自噬体形成增加有关，而不是与LC3-II转换受阻有关。当细胞被雷帕霉素（雷帕霉素的哺乳动物靶点抑制剂和成熟的大自噬诱导剂）处理时，也获得了类似的结果（数据未显示；参考文献。21).

如所示图3Ras（G12V）的表达在稳定的U251细胞系中表达时，对细胞形态和生存能力具有相同的影响，我们之前建立的U252细胞系由于自噬蛋白beclin-1的敲除而对自噬前刺激产生抵抗(22). 这表明在图2表达活化Ras（G12V）的胶质母细胞瘤细胞的死亡并不需要，细胞变性很可能与非自噬相前驱空泡的进行性积累有关。

在考虑相前驱空泡的可能起源时，我们注意到先前的一项研究表明激活的Ras可以刺激成纤维细胞中的大胞饮作用(23). 大胞饮作用是一种细胞内化胞外液的过程，胞外液被截留在质膜突起下，称为皱褶或跛足(24). 大松果体通常表现为直径为0.5至5μm的相前移小泡。细胞外液相示踪剂的快速掺入是大松果体的一个特征。当我们向培养基中添加路西法黄时，表达H-Ras（G12V）的细胞在10分钟内将示踪剂并入许多相发光液泡(图4A). 通过流式细胞术对路西法黄内化的定量分析表明，与−Dox对照组的路西法黄色摄取基础水平相比，表达Ras（G12V）的+Dox细胞对示踪剂的摄取增加了3倍(图4B). 与细胞松弛素D预孵育，破坏参与跛足形成的肌动蛋白细胞骨架，对−Dox细胞中的Lucifer黄色摄取没有影响，这表明这些细胞中的大部分Lucifer-黄色摄取是由于内吞途径的基础活性。相比之下，细胞松弛素D的添加使+Dox细胞中Lucifer黄色掺入减少了50%，这是由于内吞作用导致的基础摄取减少所致(图4B,−Dox，+CytoD).

电子显微照片显示，在表达H-Ras（G12V）的细胞中，细胞外液区域周围有许多跛足，形成新生的大松果体(图4C). 不表达Ras的对照细胞也含有一些跛足，但这些结构闭合形成扩大的大松果体并不明显（数据未显示）。

除了标记大松果体外，液相示踪剂还可以进入早期内体。大松果体缺乏一层网格蛋白外壳，可以通过其相对无法集中受体而与内体区分(25). 因此，为了证实空泡来源于大松果体，表达Ras（G12V）的细胞用大量液相示踪剂右旋糖酐-Alexa Fluor 488和转铁蛋白受体配体转铁蛋白-Alexa-Fluor 594进行短期培养。含有荧光右旋糖酐的较大囊泡与隔离转铁蛋白的较小内体不同(图4D). 与这一发现相一致，我们观察到相前驱空泡与免疫荧光检测到的较小的点状结构是分开的，免疫荧光检测出的是针对众所周知的早期内体蛋白EEA1的抗体(图4E). 这些发现，再加上形态学证据图4C，支持将Ras诱导的液泡鉴定为大松果体。

活化Ras诱导的透明液泡在形态上与溶酶体和自溶体不同，后者通常含有电子致密的细胞器残留物或降解的细胞质成分（参考文献。26;图2A和4摄氏度). 然而，仅从形态学角度来看，很难排除Ras诱导的一些液泡可能是后期内胚体肿胀的可能性，类似于在细胞中观察到的情况，在这些细胞中，多囊内胚体的形态发生被III类磷脂酰肌醇3-激酶Vps34的抑制所破坏(27, 28). 由于后者保留了晚期内体的酸性特征，它们很容易结合溶酶体促生长剂(27). 因此，为了测试Ras诱导的一些液泡可能是晚期内体区室的可能性，我们用Lysotracker Red进行了超活染色图5A，相前驱空泡和标记有Lysotracker Red的隔室之间没有明显重叠。当细胞被吖啶橙染色时，也得到了类似的结果，吖啶橙色被隔离在晚期内体、溶酶体和自溶体中（数据未显示；参考文献。29, 30). 此外，相前驱空泡和标记有魔红RR的隔室之间没有实质性重叠，魔红是一种细胞渗透肽底物，当被组织蛋白酶B裂解时会发出荧光(图5B). 综上所述，这些结果支持这样一个结论，即大多数相前导液泡来源于大松果体，而不是晚期内体或溶酶体。

尽管液泡没有酸性或组织蛋白酶阳性的标记物(图5A和B)，我们发现其中许多含有LAMP1，这是一种典型的与溶酶体和晚期内体相关的膜蛋白(图5C). 有两种可能的模型可以解释这一点：在第一种模型中，大松果体可能与晚期内体或溶酶体融合，获得LAMP1并同时中和这些隔室的内部，因此它们无法被嗜酸剂或组织蛋白酶底物检测到。报告提出了另一种模型，即LAMP1可以直接运输到非溶酶体隔室，如早期内体(31)或新生吞噬体(32). 因此，大嵌合体可以保持与溶酶体分离，同时将LAMP1直接募集到它们的膜上。为了区分这些模型，我们用Lysotracker Red培养空泡化胶质母细胞瘤细胞3小时，以预先标记其溶酶体室。然后，在从培养基中取出溶酶体后，我们添加荧光葡聚糖4小时，以确定葡聚糖标记的隔间是否会与预先标记的溶酶体合并(图5D). 4小时后，我们检测到一些较小的右旋糖酐标记结构与溶酶体阳性腔室的合并，可能代表了内体与溶酶体内的融合。然而，即使在这一延长期之后，较大的右旋糖酐标记的液泡似乎仍与预先标记的溶酶体隔室分离(图5D). 当组织蛋白酶底物魔红RR用于预标记溶酶体时，也观察到类似的结果（数据未显示）。这些观察结果与LAMP1直接补充到大胞饮细胞空泡膜的概念一致，这些小室和溶酶体之间的融合最小。

大胞饮作用的机制尚不清楚，但以前的研究表明Rac1 GTPase及其效应器PAK1是该过程的关键调节因子(33, 34). 因为Ras的下游靶点包括可刺激Rac1活化的鸟嘌呤核苷酸交换因子（例如Tiam1；参考。35)，我们假设Rac1可能位于Ras的下游，在胶质母细胞瘤细胞中触发大松果体积聚的途径中。

为了测试这种可能性，我们询问组成活性形式Rac1的表达是否可以模拟Ras（G12V）在U251胶质母细胞瘤细胞中的作用。如所示图6A和B在U251细胞中活化的myc-Rac1（G12V）的条件性表达触发了与Ras（G12V）观察到的相似的空泡表型。与表达Ras（G12V）的细胞一样，在添加Dox后的第4天和第8天，表达Rac1（G12V）的细胞的存活率下降，同时出现严重的空泡化和细胞脱落(图6C). 此外，表达Rac1（G12V）的细胞在液泡结构中对路西法黄的吸收显著增加(图6D). 我们之前已经报道过，其他Rho家族GTP酶的活化形式（例如Cdc42和RhoA）不会引起U251细胞的空泡化(17). 因此，过度刺激大胞饮作用似乎是Ras（G12V）和Rac1（G12V）的特异性作用。

在描述Ras诱导的胶质母细胞瘤细胞死亡的初始报告中，Chi等人(15)在空泡化的细胞中没有发现胱天蛋白酶激活的证据。然而，根据我们的观察，细胞活力的丧失与基质的脱离相一致(图1C)，我们通过评估附着和分离细胞群中caspase底物的裂解来重新研究这个问题。如所示图7A在附着的、大部分存活的空泡细胞中，没有聚ADP-核糖聚合酶（PARP）或层粘连蛋白A/C的裂解。然而，在分离的细胞中，检测到PARP和层粘连A/C片段的分子量与caspase-3裂解一致。这些片段的大小与用staurosporine（一种已知的凋亡诱导剂）处理的细胞中观察到的片段大小相同(图7A). 对低于75kDa的PARP印迹部分的检查没有发现任何50-kDa片段表明溶酶体蛋白酶降解(36). 根据PARP裂解，49.6%的分离细胞caspase-3活性染色阳性（补充图S4A），反映了分离群体中非活性细胞的百分比(图1C). 琼脂糖凝胶电泳显示，附着细胞中没有DNA断裂的迹象，但从分离细胞中回收的DNA被广泛降解，可检测到的梯状物表明存在核小体DNA断裂（补充图S4B）。

为了确定表达Ras（G12V）的细胞的死亡是否依赖于caspase激活，我们在细胞活力开始丧失的关键时期（第4-6天）添加了广谱caspase抑制剂羧苯氧基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮（z-VAD-fmk）。PARP出现图7B表明z-VAD-fmk在阻断caspase激活方面非常有效。然而，这并不能阻止空泡化（未显示）或细胞活力的丧失(图7C). 因此，尽管半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活与胶质母细胞瘤细胞的死亡同时发生，但这并不是死亡机制的必然特征。在单独的研究中，我们还测试了组织蛋白酶和钙蛋白酶抑制剂保持空泡化细胞活力的能力（补充图S5）。与缺乏替代50-kDa PARP裂解产物一致，溶酶体蛋白酶抑制剂在防止Ras（G12V）表达诱导的细胞死亡方面无效。

根据上述观察结果，我们检查了分离的胶质母细胞瘤细胞的形态，以确定这些细胞是否表现出典型的凋亡特征(图7D). 电子显微镜显示，至少80%的分离细胞含有大量的大细胞质空泡，其形态与先前所述的附着细胞中的大松果体相似(图2A和4摄氏度). 与附着细胞相比，细胞通常膨胀至直径20至30μm，附着细胞的直径通常为10至15μm。在大约一半的细胞群体中，液泡的膨胀是如此之大，以至于这些结构填满了大部分细胞质空间(图7D). 而有些细胞含有许多大小不等的液泡(图7D,我)，其他只包含几个非常大的液泡(ii（ii）和三)，暗示这些结构的最终合并。除了具有完整外周膜的变形细胞外，还有许多破裂的细胞残留物(图7D,iv（四）). 然而，即使在严重空泡化或破裂的细胞中，细胞核通常是完整的，并且含有弥漫的染色质和显著的非碎裂的核仁。这些观察结果表明，濒死胶质母细胞瘤细胞的形态学特征类似于细胞死亡的坏死样形式，而不是典型的凋亡。

许多类型的癌细胞对凋亡的抵抗激发了人们对识别可能以减缓肿瘤进展为目标的非凋亡细胞死亡途径的兴趣。许多不同的非凋亡形式的细胞死亡现已被描述出来。包括II型或自噬细胞死亡(5, 7, 12)，截瘫(37, 38)、胀亡(39-41)和坏死性下垂(42, 43). 甚至坏死这个术语，以前用来表示“被动”细胞死亡或细胞的死后状态(39)，最近被用来描述程序性细胞死亡的形式，包括进行性溶酶体损伤、溶酶体蛋白酶泄漏和细胞膜早期破坏(44-47). 在本研究中，我们详细描述了在胶质母细胞瘤细胞中观察到的一种新形式的非凋亡细胞死亡，即Ras信号通路的结构性刺激。这种细胞死亡的标志性细胞病理特征是来自大松果体的充满液体的大液泡的显著积聚。电子显微镜显示，细胞解体与大胞饮细胞空泡数量和大小的逐渐增加有关。这些观察结果高度暗示了大细胞吞噬液摄取的失调与细胞最终的代谢崩溃和破裂之间的因果关系。这种相互关系的最终证明必须等待新方法的发展，以长期抑制大胞吞作用，因为目前用于阻断这一过程的药物（例如阿米洛利和细胞松弛素）在应用于培养细胞数小时以上时是有毒的(48).

与之前的报告相比(15)我们发现，通过检测表达Ras（G12V）的分离细胞，我们实际上可以检测到caspase激活和DNA片段。然而，与大多数其他非凋亡性死亡形式的情况类似，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活似乎不是Ras诱导死亡程序中的强制性步骤。此外，我们对细胞形态学的研究没有显示凋亡细胞中观察到的典型细胞收缩、起泡和核染色质凝集。因此，我们的结果支持将Ras诱导的大细胞吞噬细胞死亡归类为非凋亡性。如下文所述，与其他已知类型的非凋亡性死亡进行比较表明，大细胞吞噬性细胞变性是一种独特的细胞死亡形式。

自噬性死亡是目前公认的最广泛的非凋亡细胞死亡类型。这种死亡的诊断特征是吞噬细胞质和细胞器并吞噬细胞的自噬体和自溶体的增殖(5, 12). 在表达活化Ras的细胞中，最终填充退化细胞的大的巨噬细胞液泡在形态学上与自噬体不同。尽管自噬体似乎与大细胞吞噬空泡平行积聚，但我们对beclin-1敲除细胞的研究表明，Ras（G12V）诱导的大细胞吞噬空泡化和细胞死亡可能独立于自噬机制发生。因此，在这种情况下，自噬可能反映了细胞试图在由大量巨噬细胞积累造成的不利代谢条件下生存，而不是细胞死亡的直接原因。这将与越来越多的证据一致，即自噬可以作为一种保护策略，对抗代谢应激下细胞的凋亡或坏死(14).

激活的Ras或Rac诱导的细胞病理学也与几种较少见的细胞死亡形式不同。在半胱天冬酶被抑制的情况下，死亡受体的刺激可以触发坏死(42, 43). 细胞肿胀和膜破裂，但囊泡液体摄取量的大量增加不是坏死性下垂的诊断特征。此外，我们观察到坏死抑制素是一种有效的坏死下垂抑制剂，不会阻止Ras诱导的空泡化或细胞死亡。¹

Ras的激活突变长期以来被认为是致癌的，因为它们导致对细胞增殖重要的信号通路的慢性刺激(50). 活化的Ras也可能通过保护转化细胞免受凋亡而促进肿瘤进展，尽管一些报道描述了Ras的促凋亡功能相反(51). Ras激活对非凋亡死亡机制的刺激突出了Ras信号通路的一个相对未探索的方面。我们的发现是，激活的Ras可以在多种人脑胶质瘤细胞系中诱导空泡化和细胞变性，包括那些含有PTEN公司和第53页使其相对抗凋亡的突变（例如，U251和T98G）表明，存在能够过度刺激大胞饮作用和/或抑制大胞饮体清除或再循环的Ras反应通路可能是人类胶质母细胞瘤的一般特征。如果是这样的话，对相关信号机制的进一步描述可能会为操纵这一途径以触发这些难治性肿瘤中的细胞死亡提供建议。在这方面，我们以前的研究表明，刺激胶质母细胞瘤细胞的空泡化并不依赖传统的Ras效应器，如Raf、磷脂酰肌醇3-激酶和Ral-GDS(17). 在考虑其他可能性时，值得注意的是Rac1 GTPase被认为是大胞饮症的调节因子(33). 事实上，正如我们在这里所显示的，胶质母细胞瘤细胞中激活的Rac1（G12V）的表达可以模拟Ras（G12V）的作用。因为Ras的下游靶点包括鸟嘌呤核苷酸交换因子，如Tiam1，可以刺激Rac1的激活(35)我们的工作假设是，这些交换因子可能是Ras的关键效应器，参与通过Rac向大细胞吞噬机制传输信号。

我们的研究通过将胶质母细胞瘤细胞与HeLa、HEK293和HEp2细胞进行比较，表明Ras刺激脱毒的能力具有明确的细胞类型特异性。Chi等人得出了类似的结论(15)他在胶质母细胞瘤和两种胃癌细胞系中观察到Ras诱导的空泡化，但在膀胱癌细胞中没有。因此，更好地了解某些细胞类型对方法的特殊敏感性的基础，对于评估这种细胞死亡的治疗潜力非常重要。右旋糖酐示踪剂的结果(图5D)表明，与正常的大松果体不同，Ras诱导的液泡在内化后不会消散或与溶酶体室融合。这就提出了这样一种可能性，即对甲硫磷敏感性差异的解释不仅存在于诱导大胞吞作用的水平上，也存在于细胞内运输或膜通道功能的水平上。

未来研究的另一个重要问题是，除了Ras或Rac的异位表达外，其他刺激是否会引发脱毒。在这方面，值得注意的是，细胞质空泡化通常被认为是由细胞毒性药物或不良环境条件引起的坏死细胞死亡的形态学特征，但很少有迹象表明空泡的具体来源。因此，可以想象，大胞饮失调可能是标记为坏死的细胞死亡形式中的常见现象，因此可能比以前认识的更广泛。

U251胶质母细胞瘤细胞从DCT肿瘤库（国家癌症研究所）获得。其他细胞系来自同一来源或美国类型培养物收集。细胞保持在37°C和5%CO₂补充10%热灭活胎牛血清的DMEM。通过使用配备有数码相机和SPOT成像软件（Diagnostic Instruments，Inc.）的奥林巴斯IX70显微镜获得活细胞的相控图像。

为了产生能够条件Ras表达的稳定细胞系，用pTet-on（Clontech）对U251细胞进行核感染，pTet-onClontech编码逆转录激活物。用500μg/mL G418筛选细胞，并在瞬时转染试验中测试克隆系，以确定哪些克隆系使用tet-responsive pTRE载体（Clontech）获得了最严格的Dox调节基因表达。其中一个克隆被用于通过pTRE核感染产生永久性细胞系(myc-H-RasG12V型)与pTK-Hyg一起使用。在含有200μg/mL潮霉素+200μg/mL G418的培养基中选择克隆，并筛选以测量myc-H-Ras（G12V）在1μg/mL Dox作用下的表达。克隆系U251-C18被选用于本研究，尽管其他克隆在诱导Ras（G12V）表达时表现出基本相同的形态学表型。对于Rac1（G12V）的表达，美国医药来源有限责任公司（America Pharma Source，LLC）在tet诱导启动子的控制下产生了包含myc-tagged Rac1基因（G12V）的慢病毒颗粒。这些慢病毒颗粒与包含急变菌素抗性基因的慢病毒粒子混合，用于联合感染U251 pTet-on细胞。克隆是在含有10μg/mL杀囊虫素和200μg/mL G418的培养基中选择的。通过向培养基中添加1μg/mL Dox诱导myc-Rac1（G12V）的表达。

Myc-tagged公司H-Ras公司构件(G12伏和第17条)被子克隆到生态R1级-巴姆逆转录病毒表达载体pFBneo（Stratagene）的H1位点。以前已经描述过逆转录病毒产生和胶质瘤细胞感染的程序(22).

H-Ras（G12V）将其亚克隆到pCMV5中，该pCMV已被修改为编码框架内myc表位标签（MEQKLISEEDL）。使用Amaxa，Inc.的Nucleofector II系统，通过核感染将表达载体导入U251细胞，使用溶液T和程序T-30。用不同的溶液和程序对其他细胞系进行核感染：HEK293细胞，溶液V用程序Q-001；HeLa细胞，溶液R，程序I-013；和HEp2细胞，方案V，程序G-016。

抗体来源如下：myc表位、EMD Biosciences；PARP，BD PharMinen；层粘连蛋白A/C，细胞信号技术；乳酸脱氢酶和α-微管蛋白，西格玛；和LC3（APG8b，N-术语），Abgent。使用Bio-Read试剂（Bio-Rad，Inc.）通过比色法对细胞裂解液中的蛋白质进行定量。如前所述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(22)使用增强化学发光检测（GE Healthcare）。使用柯达440CF图像工作站或Alpha Innotech FluorChem HD2成像系统量化免疫印迹信号。

为了阻止内源性LC3-II的溶酶体周转，在LC3的Western blot分析之前，将细胞在含有蛋白酶抑制剂E64D（10μg/mL）和胃蛋白酶抑制素A（10μg/mL；肽国际）的培养基中培养48小时。用500 nmol/L staurosporine（Cayman Chemical Company）处理细胞18至24小时，作为诱导PARP和与凋亡相关的层粘连断裂的阳性对照。

使用活性/细胞毒性检测试剂盒（Biotium，Inc.）通过荧光显微镜评估单个细胞的活性，该试剂盒测量钙黄绿素乙酰氧基甲酯（活性）的水解和乙炔同二聚体III（死亡）的摄取。对每个样本至少50个细胞进行计数，以确定死亡率，并对所有样本进行三次分析。使用Sigma的细胞生长测定试剂盒测量3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）到甲赞衍生物的转化率，通过代谢活性测定量化培养细胞群的活力。通过使用Spectra Max 384 Plus平板读取器在570 nm处测量其吸光度，对甲赞衍生物进行定量。根据制造商提供的说明，使用NucView荧光检测法（Biotium）检测Caspase-3活性。

为了比较空泡细胞和非空泡细胞中ATP的相对水平，通过胰蛋白酶化收集细胞，并使用Promega的CellTiter Glo试剂盒进行分析。荧光素酶对荧光素的ATP依赖性单氧化所产生的发光被归一化为添加到分析中的细胞数量，并用Coulter计数器测定。

对于集落形成分析，细胞接种在100 mm培养皿中，每皿1400个。电镀后第二天，通过在培养基中加入1μg/mL Dox，在一半培养物中诱导H-Ras（G12V）表达。每2至3天更换一次所有培养基。培养3周后，用PBS清洗培养物，将细胞在冰镇甲醇中固定10分钟，并用1%结晶紫在35%甲醇中染色10分钟，以此评估菌落形成。在解剖显微镜下对含有至少50个细胞的菌落进行计数。

细胞周期分布由流式细胞仪对所述制备的细胞进行分析后生成的DNA直方图确定(52)使用Beckman-Coulter EPIC XL MCL细胞仪。使用多周期DNA细胞周期分析软件（Phoenix Flow Systems）分析数据。

通过Herrmann等人的方法分离DNA片段(53)并在1.2%琼脂糖凝胶中电泳分离。在用溴化乙锭染色凝胶后，使用FluorChem HD2系统获得图像。

如前所述，准备细胞进行免疫荧光(27). 使用单克隆抗体（EMD Biosciences）检测Myc-tagged蛋白，然后使用与Alexa Fluor 568（Invitrogen）偶联的山羊抗鼠IgG。为了检测内源性LC3，我们使用来自Abgent的纯化兔多克隆抗体APG8b（MAP1LC3B，N-Term），然后使用与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG。用于EEA1和LAMP1免疫荧光定位的抗体分别来自Abcam和发育研究杂交瘤库。使用配备数码相机和ImagePro软件（媒体控制论）的尼康Eclipse 800荧光显微镜或使用488 nm和561 nm激光激发线的徕卡TCS SP5多光子共焦显微镜检查细胞。

如前所述，将细胞颗粒固定、脱水并渗透(27). 在300米长的铜支撑栅上收集超薄切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在Philips CM 10透射电子显微镜下进行检查。

Lucifer黄和右旋糖酐-Alexa Fluor 488（10000 MW）购自Invitrogen/Mollecular Probes。细胞与荧光素黄（HBSS中1.5 mg/mL）在37°C，5%CO中孵育15分钟₂孵化器。去除荧光素黄，用HBSS清洗细胞一次。使用配备数码相机和SPOT成像软件的Olympus IX70显微镜立即拍摄活细胞的相控和荧光图像。通过流式细胞术对路西法黄的摄取进行定量。简单地说，细胞在无酚红培养基中生长，如上所述与荧光素黄培养，通过胰蛋白酶化收获，并悬浮在HBSS中。对于每个样品，用Beckman Coulter EPICS Elite ESP细胞仪分析10000个细胞，该细胞仪具有488nm的激发激光和505至545nm的发射。在减去从无荧光素黄培养的平行对照样品中获得的自体荧光背景后，测定群体的平均荧光强度。在一些研究中，在添加荧光素黄之前，用细胞松弛素D（1μmol/L；Sigma）预培养细胞30分钟。

为了用右旋糖酐-Alexa Fluor 488标记，用含有10%胎牛血清的无酚红DMEM冲洗细胞两次，然后用0.5 mg/mL右旋糖胺-Alexa-Fluor 48在同一培养基中培养，培养时间如图图例所示。在没有示踪剂的相同培养基中清洗细胞两次，然后按照路西法黄色染色的描述采集活细胞的图像。在某些情况下，在无血清DMEM中，用右旋糖酐-Af488和与Alexa Fluor 594（Invitrogen/Mollecular Probes）偶联的人全转铁蛋白在细胞上共标记15分钟。

通过在37°C下培养活细胞来标记细胞内酸性隔室，将Lysotracker Red DND-99（Invitrogen）添加到最终浓度为1μmol/L的无酚红DMEM中。通过用Magic Red RR（免疫化学技术）培养活细胞，对组织蛋白酶B活性的细胞内隔室进行染色根据制造商提供的说明。

没有披露潜在的利益冲突。

我们感谢托马斯·索耶（Thomas Sawyer）和凯伦·多梅尼科（Karen Domenico）在流式细胞术方面的帮助，感谢威廉·冈宁（William Gunning）博士和米歇尔·勒万多夫斯基（Michelle Lewandowski）在电子显微镜方面的帮助。