扭曲过度表达通过诱导上皮-间充质转化与肝细胞癌转移相关

肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见恶性肿瘤，也是香港第二大癌症死亡原因(1, 2). 即使在手术切除后，HCC也有很高的血管侵袭、转移和复发的可能性，导致预后不良(三). 文献中大多数报道，50%以上的肝癌切除后患者发生肝内和肝外转移，肝内转移发生率更高(三). 肝外转移的常见部位包括肺、骨、腹膜、脾和淋巴结(三). 肝癌侵袭性与肿瘤细胞侵袭包膜和门静脉的能力有关(4, 5). 上皮-间充质转化（EMT）是肿瘤侵袭过程中的一个关键事件，上皮细胞层失去极性和细胞间接触，细胞骨架发生戏剧性重塑(6). EMT的一个特征是E-cadherin表达缺失(6). E-cadherin是维持细胞极性和环境的细胞间粘附连接的核心成分(7, 8). 在HCC中，E-cadherin表达缺失与肿瘤侵袭性、转移和预后相关(7). E-cadherin的表达是通过基因突变、杂合性丢失和其启动子在各种癌症中的高甲基化在遗传水平上调节的(9–13). 然而，E-钙粘蛋白启动子甲基化与E-钙黏蛋白表达的缺失没有密切关系(13)因此，最近有人提出了其他抑制机制。E-cadherin的调节机制存在争议，尚未达成共识。

几种EMT诱导调节因子通过与近端E-cadherin启动子的特定E-box相互作用抑制E-cadherin转录(6). 与蜗牛相关的锌指转录因子（蜗牛和Slug）是最显著的转录因子(14, 15). 最近，碱性螺旋-环-螺旋转录因子Twist被鉴定为黑腹果蝇(16, 17)作为原肠胚形成期间EMT的组织者和中胚层分化的调节器，已被添加到发育基因列表中，在E-cadherin抑制和EMT诱导中起关键作用(6). 与它在EMT中的功能一致，Twist已被发现与包括乳腺癌和前列腺癌在内的各种癌症的转移有关(6, 18). 转移性乳腺肿瘤中RNAi方法的扭转敲除可能通过阻断灌注来阻止转移(6). 此外，Twist在两种人类上皮细胞系中的过度表达导致了EMT和E-cadherin的完全抑制(6). 然而，目前尚不清楚Twist是通过E2A蛋白直接还是通过间接机制与这些电子盒相互作用。

由于EMT被发现是促进肿瘤侵袭性的关键步骤，因此研究Twist在HCC中的作用非常有意义。到目前为止，还没有关于Twist在HCC中的作用的数据。本研究的目的是通过配对原发性和转移性肝癌的组织芯片（TMA）研究Twist在肝癌转移中的表达及其可能的作用。此外，通过对TMA标本进行免疫染色和将Twist cDNA异位转染到HCC细胞系中来检测Twist和E-cadherin之间的相关性。我们的证据表明，Twist通过抑制E-cadherin与肝癌转移相关。

患者样本。来自TMA的组织标本取自1995年至1999年在中国上海东方肝胆外科医院接受肝切除术治疗HCC的60名患者，随后发生肝内或肝外转移。为TMA获得配对的原发性和转移性肝癌样本。

TMA的建设。HCC TMA的建造如前所述(19). 简单地说，用于阵列研究的石蜡包埋的所有组织样本都是新鲜切片并用H&E染色的。两位病理学家仔细审查了病变的代表性区域并确定了其范围。根据临床病理信息，将标本分组在组织圆柱体中，从供体块的选定区域取直径为0.6 mm的标本，然后使用组织阵列仪器（马里兰州银泉市比彻仪器公司）将其精确穿入受体石蜡块。用切片机连续制作5μmol/L的微阵列块切片。最后，构建了60对原发和匹配转移性肝癌的TMA切片，包括31个肝内和29个肝外转移（19个腹膜转移、6个淋巴结转移、1个肠转移、2个脾转移和1个肺转移）。

免疫染色。将厚度为4μm的福尔马林固定和石蜡包埋切片在二甲苯和分级醇中脱蜡，水合，并在PBS中洗涤。在微波炉中预处理[在柠檬酸钠缓冲液（pH 6）中12分钟]后，内源性过氧化物酶被0.3%H抑制₂O（运行）₂30分钟，切片与10%正常山羊血清孵育30分钟。主要抗体【兔子多克隆抗扭曲，H-81（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；小鼠单克隆抗E-cadherin，克隆4A2C7（加州南旧金山Zymed Laboratories Inc.）】在4°C的潮湿室内放置过夜。采用标准的抗生物素-生物素过氧化物酶技术（DAKO，Carpindia，CA）。简单地说，生物素化的山羊抗兔免疫球蛋白、山羊抗鼠和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物分别施加30分钟，在PBS中洗涤15分钟。反应最终由Dako Liquid DAB+底物显色系统（Dako）展开。

质粒。pcDNA-Twist是加利福尼亚州杜阿尔特市贝克曼研究所格拉金博士赠送的礼物(20)E-cadherin启动子是香港大学解剖系S.W.Tsao教授的礼物。

细胞系。两种转移性肝癌细胞系MHCC-97L和MHCC-97-H（分别为低转移和高转移潜能，来自中国上海复旦大学肝癌研究所；参考文献。21)，非转移性原发性肝癌细胞系Huh-7（日本札幌北海道大学医学院H.Nakabayashi博士馈赠；参考。22)、PLC（日本癌症研究银行，日本东京）和H2P和H2M（一对原发性和与其匹配的转移性肝癌细胞系；参考文献。19)在37°C、含5%CO的湿润大气中，用补充有10%热灭活胎牛血清（生命科技）、100 mg/mL青霉素G和50μG/mL链霉素（生命科技₂。本研究中使用的所有细胞系均对应于恶性肝细胞。

定量逆转录-PCR。根据制造商的方案（Invitrogen，Carlsbad，CA），使用Trizol试剂分离总RNA。cDNA是使用SuperScript第一链合成系统（Invitrogen）合成的。使用SYBR Green PCR试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）对部分双链cDNA进行PCR。扩增方案包括94°C培养15秒、63°C培养30秒和72°C培养60秒。使用ABI PRISM 7700序列检测系统（PE Applied Biosystems）实时监测SYBR Green染料在PCR产物中的掺入，从而确定阈值循环(C类_T型)产品开始指数放大。目标cDNA相对于18S cDNA的数量由C类_T型使用序列检测器1.6.3版软件（PE Applied Biosystems）对值进行扩增，然后使用Twist和E-cadherin引物进行PCR扩增：Twist-f，5-CGGACAAGCTGAGAGAGT-3和Twist-r，5-CCTTCTGGAAAACAATATC-3；E-cadherin-f，5-TAACCGATGAAATGAC-3和E-cadherin-r，5-TTTGTCAGGAGCGAT-3。

扭曲和E-钙粘蛋白免疫荧光染色。细胞在DMEM培养基中约70%的汇合处放置于培养皿载玻片上24小时。将其固定在冰镇丙酮和甲醇（1:1）中，用PBS洗涤，然后在4°C下用小鼠抗E-钙粘蛋白和抗兔扭体染色过夜。清洗后，在室温下用山羊抗鼠FITC或抗兔TRITC结合二级抗体涂敷细胞30分钟，然后在室温下使用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染1分钟。在荧光显微镜下检查细胞。

细胞转染。使用Lipofectin（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Life Technologies Inc.）将pcDNA和pcDNA-Twist转染到PLC细胞中，并使用G418以800μg/mL的剂量选择转染剂池（～150-200个菌落）。

荧光素酶启动子分析。PLC单元（5×10⁴将每个孔的细胞）置于24孔培养板中，并让其生长24小时。E-cadherin启动子（由S.W.Tsao教授提供）和pRL-CMV-Luc与pcDNA-Twist或pcDNA通过Fugene 6试剂（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）共同转染到细胞中。转染48小时后对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega，Madison，WI）对荧光素素酶活性进行分析。在转染后48小时测量萤火虫荧光素酶活性，然后用Renilla荧光素酶活性对读数进行标准化，该活性作为转染效率的内部控制。通过转染E-cadherin启动子和pRL-CMV-Luc对稳定的PLC-pcDNA和PLC-Twist转染体进行荧光素酶检测。每个实验在重复的孔中至少进行三次，每个数据点代表平均值和SD。计算E-cadherin启动子荧光素酶活性相对于载体对照的下降百分比。荧光素酶活性的平均下降百分比作为最终结果，平均值的SD用作误差线。

伤口愈合试验和侵袭试验。通过测量细胞在200μL移液管（时间0）形成的无细胞瘢痕区域的运动来评估细胞运动，并在24小时后监测伤口闭合速度。侵入分析使用24孔BioCoat Matrigel侵入室（Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ），使用5×10⁴细胞置于无血清DME中，并被镀到控制或Matrigel-coated过滤器上。将来自PLC或PLC-Twist细胞的条件培养基作为化学引诱剂放置在较低的腔室中。培养22小时后，用棉签刮除过滤器上表面的细胞。侵入基质层并粘附在膜底部的细胞用结晶紫溶液染色。用10%乙酸洗脱细胞相关染料，并测定其在595nm处的吸光度。每项实验一式三份，并给出平均值±SE。

蛋白质印迹。对细胞进行裂解并提取蛋白质。样品在10%SDS丙烯酰胺凝胶中分离，并电泳转移至聚偏二氟乙烯膜（英国白金汉郡阿默沙姆）。用10%的脱脂牛奶吸干膜，清洗，然后用Twist、肌动蛋白、纤维连接蛋白和Sm-actin（Santa Cruz Biotechnology）、E-cadherin、β-连环蛋白和α-连环素（Zymed Laboratories）进行探测。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠、抗兔或抗山羊抗体（Amersham）孵育，然后根据制造商的方案通过增强化学发光Plus进行可视化。

统计分析。连续数据表示为中位数和范围，并使用Mann-Whitney对各组进行比较U型测试。使用χ比较分类变量²测试（或Fisher精确测试）。所有统计分析均使用统计软件（SPSS 9.0 for Windows；SPSS，Inc.，Chicago，IL）进行。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

扭曲过度表达与肝癌转移显著相关。为了确定Twist在肝癌转移中的可能作用，我们通过免疫染色评估了Twist蛋白在TMA中的表达。在60对原发性肝癌及其匹配的转移性肿瘤中，分别在54例（26%）中的14例和57例（58%）肿瘤中的33例中检测到核Twist表达(图1A). Twist表达与肝癌转移显著相关(P（P）= 0.001). Twist蛋白在原发性和匹配转移性肝癌中的表达总结如下表1为了进一步证实Twist与转移的相关性，我们通过逆转录-PCR比较了不同转移潜能肝癌细胞系中Twist的表达。与非转移性Huh-7、H2P和PLC细胞系相比，MHCC-97H、MHCC-97 L和H2M中mRNA水平的Twist显著增加(图1B). 具有较高转移能力的MHCC-97H细胞系的Twist水平高于MHCC-97 L(图1B).

肝癌中扭曲过度表达与E-cadherin表达呈负相关。为了进一步评估Twist表达与E-钙粘蛋白的可能相关性，我们评估了另一组TMA标本中E-钙粘蛋白的蛋白表达。发现Twist与E-cadherin表达呈负相关(P（P）= 0.001,第页= −0.443;图2A). E-钙粘蛋白在TMA中的表达总结如下表1通过逆转录-PCR检测上述具有不同转移潜能的肝癌细胞系中E-cadherin mRNA的表达，研究了肝癌中Twist与E-cadherin的相关性。与非转移原代肝癌细胞系相比，转移性肝癌细胞系中Twist表达增加图1B，我们发现转移性肝癌细胞系中E-cadherin mRNA表达降低(图2B).

异位引入Twist通过E-cadherin阻遏导致EMT激活。鉴于肝癌标本和细胞株中Twist和E-cadherin之间呈负相关，我们随后通过将Twist cDNA异位转染到PLC细胞中来研究Twist激活对EMT的影响。转染后，通过G418稳定选择后分离出一个克隆库（150-200个克隆）。有许多报告显示CMV启动子甲基化在肝细胞中导致基因沉默(23, 24). 在本实验中，长期培养PLC-Twist转染体后，Twist表达持续。因此，肝细胞中的启动子甲基化可能是细胞系特异性的。通过免疫荧光染色，我们发现与空载体对照相比，PLC-Twist转染剂中的核Twist蛋白表达增加(图3A). 扭曲过度表达导致从紧密聚集的菌落到分散生长结构的形态学变化(图3B). 为了进一步检测PLC-Twist转染剂中EMT的分子变化，我们检测了上皮和成纤维细胞标记物的表达。如所示图3CPLC-Twist转染剂中上皮标记物E-cadherin、β-catenin和α-catenin-蛋白减少，成纤维细胞标记物纤维连接蛋白和Sm-actin增加。由于EMT的特征是E-钙粘蛋白表达缺失，而膜定位表明其生物学功能，因此我们进行免疫荧光染色以检查E-钙黏蛋白在PLC-Twist转染剂中的定位。E-钙粘蛋白主要定位于用空载体转染的PLC细胞的细胞膜，而E-钙粘蛋白主要在PLC Twist转染的细胞质中检测到(图3D). 与空载体对照组相比，PLC-Twist转染组E-cadherin启动子活性持续下降(图3D). 为了进一步检测Twist是否通过转录使E-cadherin失活，我们随后将pcDNA3.1或pcDNA3.1-Twist与含有E-cadherin启动子的荧光素酶报告子共转染，并生成瞬时转染物。我们发现，与载体对照组相比，Twist转染组E-cadherin启动子活性降低了约7.8倍(图3E).

扭曲上调导致入侵能力增强。上述结果表明，扭曲诱导了PLC细胞系中的EMT变化。鉴于E-cadherin的下调是转移性肝癌中最常见的特征之一，并且在PLC-Twist转染剂中发现膜E-cadherin表达降低，我们假设Twist调节可能导致非转移性肝癌细胞系侵袭能力的增加。为了验证这一假设，我们研究了异位Twist转染后PLC的侵袭和迁移能力。如所示图4A在Matrigel侵袭试验后，与空载体对照组相比，在Twist转染的PLC细胞系中观察到约81%的细胞侵袭增加。这一结果表明，Twist增强了肝癌细胞的侵袭能力。通过创伤愈合试验研究细胞运动。与载体对照组相比，PLC-Twist显示出更高的细胞运动能力(图4B). 这些结果表明，Twist激活可能通过调节EMT的变化导致肝癌细胞株侵袭力的增加。

HCC侵袭性是导致转移的关键步骤，导致预后不良(三). 因此，研究肝癌侵袭性的分子机制具有重要价值。最近，越来越多的证据表明，胚胎发生中首次发现的EMT过程(25)，介导肿瘤进展，包括局部侵袭、通过循环扩散和转移。一些诱导EMT的发育基因被证明是E-钙粘蛋白阻遏物。第一种是锌指蛋白蜗牛，它是一种DNA结合因子，识别E-钙粘蛋白等靶启动子中的E-box基序(15). Yang等人的最新发现将Twist添加到EMT诱导剂类别中(6). Twist最初被认为是致癌基因(26, 27). 例如，异位扭体导入促进小鼠胚胎成纤维细胞在软琼脂中的集落形成(27). 最近，发现Twist过度表达与黑色素瘤的恶性转化有关(28). Twist在乳腺癌模型中首次报道了其在肿瘤转移中的作用，这表明Twist诱导的EMT可促进肿瘤侵袭(6). 然而，EMT介导的肿瘤转移的作用仍存在争议。一些研究表明，Twist过度表达与前列腺癌和乳腺癌中EMT介导的转移相关(6, 18). 相反，其他研究报告称胃癌和结肠癌之间没有相关性(29, 30). 在这项研究中，我们首次报道了Twist在肝癌组织中的过度表达与TMA的转移相关。通过比较Twist在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达，进一步证实了这一结果。如所示图1B我们发现，与非转移原代细胞相比，Twist在转移细胞系中过度表达。上述结果强烈提示了Twist在肝癌转移中的作用。

Twist与其他EMT诱导转录因子（如蜗牛、鼻涕虫和SIP）一样，使用类似的E-box序列基序结合DNA，抑制E-cadherin(15). 因此，我们假设Twist通过E-cadherin阻遏诱导EMT介导的转移。为了证实这一点，我们通过在另一张TMA玻片上进行E-钙粘蛋白免疫染色来评估HCC临床样本中Twist和E-钙粘蛋白之间的相关性。从TMA中，我们发现Twist和E-cadherin蛋白表达之间存在显著的负相关(P（P）= 0.001,第页= −0.443). 通过评估具有不同转移潜能的细胞系中E-钙粘蛋白mRNA的表达，进一步证实了这一结果。如所示图2B我们发现转移细胞系中E-cadherin mRNA表达不足，Twist表达较强。总之，我们的结果表明，Twist可能通过抑制E-cadherin的表达而与肝癌转移相关。

由于E-cadherin表达的缺失是EMT的特征，我们通过将Twist cDNA稳定异位转染到PLC细胞中来检测Twist是否直接诱导了EMT的变化。Twist转染后，异位Twist主要位于细胞核内。该染色模式与我们在HCC临床样本上的免疫染色结果以及之前关于横纹肌肉瘤的报告一致，该肉瘤显示细胞核Twist表达(27). 异位扭转导致从上皮到成纤维细胞外观的形态学改变，伴随着间充质标记物的增加，如纤维连接蛋白和sm-actin，以及上皮标记物的丢失，如E-cadherin、β-catenin和α-catenin-蛋白。此外，这些变化伴随着E-cadherin从膜到细胞质的易位增加，表明功能失活。为了检测Twist是否通过蜗牛靶向的E-box抑制E-cadherin启动子的转录，我们进行了启动子分析。结果表明，Twist通过抑制E-cadherin启动子转录抑制E-cadtherin的表达(图3E). 然而，Twist与这些电子盒子的相互作用是直接的还是通过其他介质的，还有待确定。尽管启动子甲基化已被广泛研究为控制E-cadherin表达的主要机制之一(11)，E-cadherin启动子甲基化与E-cadherin表达的缺失没有密切关系(13). 在这项研究中，我们发现扭曲介导的转录抑制为肝癌中E-cadherin的丢失提供了一种新的机制，而不是遗传控制。异位Twist导入PLC细胞后，EMT变化与侵袭性增加相关(图4A和B). 结合TMA标本的免疫染色结果，我们发现Twist通过促进细胞侵袭性增加了HCC的转移潜能。尽管越来越多的证据表明Twist在人类癌症的发展和进展中的重要性，但其潜在功能仍存在争议。最近，有报道称Twist基因启动子甲基化在乳腺癌中，特别是在转移病灶中(31). 这些对比数据表明，Twist在肿瘤进展中的作用可能是细胞类型特异性的。Twist在癌症进展中的作用值得进一步研究。

总之，我们首次表明Twist与肝癌转移相关，并且Twist通过抑制E-cadherin表达和诱导EMT诱导肝癌侵袭。我们的研究结果不仅为Twist在肝癌转移中的作用提供了分子基础，而且为抑制肝癌转移提供了一个新的治疗靶点。