招聘和样品收集。乳腺癌幸存者是通过肿瘤登记列表、报纸广告、传单和其他媒体报道从洛杉矶大都市地区招募的。对于肿瘤登记处确定的参与者,一封招募信中包含了对研究的简要描述和回复表。对于那些表示对研究感兴趣的女性,进行了电话筛查,以验证以下资格标准:(一)最初诊断为0、I或II期乳腺癌;(b条)诊断后1~5年;(c(c))完成了除三苯氧胺/芳香化酶抑制剂外的所有癌症治疗;(d日)没有癌症复发的证据;(e(电子))年龄≤75岁;((f))没有涉及免疫系统的慢性疾病(如自身免疫性疾病)或定期使用免疫抑制药物;(克)无精神障碍或精神分裂症;以及(小时)不经常吸烟,也不每周饮用超过14杯的酒精饮料。
因为这项研究的重点是持续疲劳的乳腺癌幸存者,所以还使用SF-36活力量表筛选潜在参与者的疲劳状态(32). 标准化活力量表的得分范围为0到100,分数越高表示功能越好(即能量水平越高)。得分高于50的中点表示健康,而低于50的分数表示与疲劳有关的限制或残疾。在我们之前的研究中,SF-36活力量表得分低于50分的乳腺癌幸存者与得分高于70分的人相比,在免疫、神经内分泌和行为状态方面表现出显著的变化(4, 20, 21, 33, 34). 如果妇女在两到三次评估中的平均活力得分≤50,则她们有资格参加研究(32, 35). 我们还确定了一组平均活力得分超过70分的非疲劳幸存者作为对照组。在基线评估时验证了疲劳状态。
在通过肿瘤登记联系的489名女性中,240名受访者接受了电话筛查。此外,74名响应媒体广告打电话的女性也接受了电话审查。共有50名符合条件的参与者进入了研究方案:32名被归类为疲劳,18名被归类于非疲劳。不合格的常见原因是50至70分的中度疲劳评分、晚期癌症阶段和治疗后>5年。
程序。参与者完成了自我报告问卷,以评估人口统计学、医学和治疗相关特征。采用贝克抑郁量表(BDI;参考文献。36)由于之前的研究发现,乳腺癌幸存者的抑郁症状与疲劳有关(20). 所有样本采集和访谈均在早上进行,以控制日变化,从原肿瘤切除术对侧的肘前静脉采集血液。加州大学洛杉矶分校机构审查委员会批准了所有研究程序,并获得了所有参与者的书面同意。
白细胞亚群和蛋白表达。将外周血收集到肝素化管中,使用Ficoll(Amersham,Piscataway,NJ)密度梯度分离外周血单个核细胞(PBMC)。用于流式细胞术评估细胞表面抗原,5×105细胞在含有荧光结合抗体鸡尾酒的人AB血清(Gemini Bioproducts,Woodland,CA)中在黑暗中4°C孵育15分钟。然后用荧光激活细胞分选缓冲液清洗细胞,并固定在4%多聚甲醛中(BD PharMinen,San Diego,CA)。流式细胞术数据通过FACScan流式细胞仪(BD Immunocytometry,San Jose,CA)获得,白细胞门控基于前向散射和侧向散射。在白细胞群体中建立二级门,以确定特定的细胞亚型。使用CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)计算阳性细胞百分比和平均荧光值。
CD4细胞+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞,CD14+单核细胞,自然杀伤细胞,CD25+/CD69型+活化的T淋巴细胞、髓样树突状细胞(HLA-DR/CD11c/CD14)和表达IL-6R(CD3)的单核细胞−/CD126型+/CD14号机组+)使用CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD56、CD62L、CD69、CD126、CD103、CD45RA、HLA-DR(加利福尼亚州富勒顿免疫技术公司Beckman Coulter)、CD120和CD121(BD-PharMinen)的荧光偶联抗体进行评估。
细胞内细胞因子的产生。使用周蛋白-叶绿素蛋白标记的CD14单克隆抗体、别藻蓝蛋白标记的抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体和藻红蛋白标记的IL-6抗体,通过流式细胞术评估单核细胞内IL-6和TNF-α的产生。将肝素处理过的血液(1 mL)与100 pg/mL LPS(西格玛,圣路易斯,密苏里州)和10μg/mL brefeldin A(西格马)混合,并在37°C的平台混合器中培养4小时,然后在4°C下培养过夜。在荧光激活的细胞分选裂解溶液(BD Biosciences)中裂解RBC,将剩余细胞在荧光激活的细胞分选透化缓冲液(BD Biosciences)中透化,并在室温下在黑暗中加入荧光缀合的抗体30分钟。然后清洗细胞并将其重新悬浮在1%多聚甲醛中,以便使用Coulter Elite软件在Coulter精英流式细胞仪上进行分析。前向散射和侧向散射用于单核细胞和粒细胞的选通。约12000 CD14+对事件进行计数,以确定分泌细胞因子的单核细胞的百分比,并根据未刺激细胞设置象限坐标。从刺激百分比中减去非刺激性细胞因子阳性事件百分比,以获得净刺激性细胞激素阳性事件百分比。
血浆细胞因子。按照制造商的规范,使用高灵敏度ELISA(明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司)评估血浆IL-6、sIL-6R、IL-1ra和TNF-rII。在室温下培养2小时的100-200μL血浆中进行分析物捕获,并持续振荡,之后洗涤平板,并在室温下与偶联抗体一起培养2小时。然后清洗平板,并在室温下与基质(30分钟)、放大器(60分钟)和停止溶液(30分钟。在Multiskan MCC/340 ELISA板阅读器(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上以490 nm波长读取吸光度。根据制造商提供的重组细胞因子标准,使用标准曲线计算将吸光度值转换为pg/mL。
体外炎症信号对细胞因子受体表达的调节。体外调节细胞因子受体的表达,以确保细胞IL-6R(CD126)水平的变化可以作为促炎细胞因子活性的有效指示。如上所述,从健康供体血液中分离出PBMC,并在37°C、5%CO、RPMI 1640和10%胎牛血清中培养2当需要时,单独或联合添加10 ng/mL IL-6、IL-1β和TNF-α。流式细胞术分析细胞,使用FITC-结合抗CD3排除T细胞,使用藻红蛋白结合抗CD126(IL-6R)和PC5-结合抗CD14识别单核细胞。
统计分析。初步分析使用t吨连续变量和χ的检验2分类变量测试。对疲劳幸存者和对照组之间比较中可能存在的混淆因素进行协方差分析。协变量包括年龄、体重指数、治疗后时间、治疗方式和BDI评分(以控制先前确定的疲劳和抑郁之间的关系;参考文献。37, 38). 治疗方式编码为一系列三个指标变量,反映了放疗(是/否)、化疗(是/不是)和三苯氧胺/芳香化酶抑制剂的使用(是/没有)。用Spearman相关系数评估免疫学变量之间的关系。所有统计检验均为双尾检验。技术障碍阻碍了一些样品的采集,这些实例在图例中进行了识别。
生物标记物定义和分类性能。根据Dillon和Goldstein概述的通用方法,开发了一种复合生物标记物(39). 为了确定区分疲劳幸存者和非疲劳幸存者的免疫变量的最佳组合,我们使用SAS PROC STEPDISC逐步构建线性判别函数模型,将组间差异显著的所有免疫或炎症变量用作潜在预测因子。变量选择使用默认的严格性变量,使用非参数判别函数分析得出了相同的结果(k个最近邻)和后向消去模型的建立(40). 一旦开发出最佳预测模型,我们使用SAS PROC DISCRIMINANT评估基于免疫标记物预测幸存者疲劳状态的准确性。除了分类准确度的标准度量外,我们还使用坚持交叉验证来评估预测性能,以估计未来数据集中对构建预测模型没有贡献的模型准确度(40).