介绍
膝关节骨性关节炎（KOA）是影响中老年人生活质量的常见疾病(1). 随着社会日益老龄化，KOA的发病率每年都在增加(2). 临床表现包括关节疼痛、肿胀、活动受限和关节摩擦，疾病的末期可能导致残疾(三). KOA的病因主要与性别、年龄、肥胖、遗传因素、机械力和先天性关节异常等因素有关。KOA是软骨细胞、细胞外基质和软骨降解和合成之间正常耦合不平衡的结果。它是由机械和生物因素共同作用引起的，导致软骨下骨降解和合成的正常耦合失衡，关节软骨退化是KOA的特征和基本病理变化(4——6).
软骨细胞是软骨组织的核心组成部分，具有维持软骨正常结构和生理的功能。当软骨细胞数量减少时，例如由于自噬、衰老和凋亡，软骨的结构和功能受到影响(7——10). 聚[ADP-核糖]聚合酶-1（PARP-1）依赖性细胞死亡，称为parthanatos(11——13)是由PARP1过度激活引起的，PARP1催化细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）分解代谢产生聚[ADP-核糖]（PAR），PAR转运到细胞质并结合到线粒体的外表面，导致凋亡诱导因子（AIF）的释放巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）向细胞核募集，MIF在细胞核中作为DNA内切酶与核酸外切酶G协同作用，诱导染色质凝聚和DNA断裂，产生约50 kb长的片段，并诱导处女膜凋亡(12，14，15). 没有研究表明PARP1/AIF与软骨细胞凋亡有关。
荣金娘汤方（RJNTF）源于陈克己学者编纂的《青宫培方济成》，由六味中药组成，牛膝布鲁姆（牛西），当归（奥利夫）迪尔斯（当归），Heracleum铁杉迪尔斯（杜霍），韦伯巴里亚纳汉森尼亚（Fedde ex H.Wolff）皮姆（Qiang Huo），防风（Turcz.）Schischk（Fang Feng）和乌拉尔甘草Fisch（干草）。作为一种著名的中国传统民间药物，用于活血化瘀，缓解关节痛引起的疼痛，滋养肝肾，促进血液循环；它通常用于治疗各种疾病，包括KOA(16). 众所周知，RJNTF的某些活性成分直接作用于软骨细胞(17，18)但其作用机制尚未被彻底调查和解释。本研究旨在为RJNTF在KOA治疗中的应用提供科学依据。RJNTF能否通过调节PARP1/AIF信号通路抑制软骨细胞凋亡尚不清楚。为了进一步阐明该药物的作用机制并评估其作为KOA治疗药物的潜力，目前的研究使用基于网络的药理学分析工具和在体外实验。最后，本研究结果表明，抑制PARP1可以有效抑制软骨细胞凋亡，为理解民间药物的作用机制提供了新的见解，有助于促进民间医学在KOA治疗中的临床翻译，并为进一步研究和临床实践提供重要参考。
材料和方法
<秒><title>网络药理学分析
从基因表达综合数据库（登录号GSE75181）检索并下载正常人软骨和KOA软骨的数据(19)，并使用R（4.0.5版）和R Studio（4.0.5版本）中的limma包分析合并的基因表达矩阵(20——22)筛选差异表达基因（DEG）。KOA的DEG是通过使用标准log2（折叠变化）|≥1和P筛选获得的形容词<0.05，并使用Hiplot Pro绘制了火山图（BGI Group；网址：http://hiplot.com.cn/). 中药系统药理学（TCMSP）数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)用于识别RJNTF的活性成分，然后是相互作用化学品的搜索工具(网址：http://stitch.embl.de/)数据库用于检索每种活性成分的潜在靶点。文恩图用于可视化RJNTF与KOA DEG的重叠目标。Cytoscape软件（3.8.2版）的BisoGenet插件中使用了蛋白质相互作用（PPI）分析(23)，并使用CytoNCA插件根据拓扑参数对结果进行分析(http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca)获得RJNTF的关键目标(24). 使用R（版本4.0.5）中的clusterProfiler包对RJNTF的潜在靶点进行了京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径富集分析，这些靶点是KOA的常见DEG；获得了与凋亡信号通路相关的潜在靶点，并利用Cytoscape构建了关键靶点信号通路图(25，26).
初级试剂和抗体
RJNTF包括牛膝、当归、白芷、大叶寒带、防风和乌拉尔甘草以4:2:3:2:2的比例。RJNTF的煎煮方案包括以1:10的固液比加水，每次煎煮三次，每次1.5小时，然后每次过滤液体以除去渣滓，在合并和混合之前，将混合液体蒸发冻干成粉末，将冻干粉末储存在真空干燥箱中（国家发明专利授权配方的制备方法和使用；专利号：ZL201710284659.8和ZL201810899834.9）(27). 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试剂购自MedChemExpress。DAPI购自北京索拉比奥科技有限公司。Novolink™聚合物检测系统购自福州迈新生物科技有限公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯根生物科技有限责任公司。L-DMEM购自上海巴赛尔媒体科技有限公司过氧化氢（H2哦2)FBS从MilliporeSigma购买。PARP1敲除慢病毒载体由上海基因化学有限公司构建。PCR引物和使用的核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒来自上海生物科技有限公司。PARP1抑制剂PJ34购自MedChemExpress。
关节软骨细胞的分离培养
共30只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（4周龄；80±10 g）购自SLAC实验动物技术有限公司[动物许可证编号SCXK（Hu）2019-0007]，用于从相对容易获得的膝关节软骨中获取软骨细胞。4周龄大鼠软骨细胞生长发育活跃，代谢活跃，软骨细胞数量多，能更好地适应在体外文化环境(28，29). 根据福建中医药大学动物护理和使用委员会（IACUC第FJTCM IACUC 2022044号）和赫尔辛基宣言收集组织。通过腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠对4周龄SPF级SD雄性大鼠实施安乐死。通过停止呼吸和心率来确认大鼠的死亡。膝关节软骨是在无菌条件下获得的。软骨用PBS冲洗三次，然后用手术刀切成1×1×1mm的碎片，再次用PBS清洗，然后转移到60mm的培养皿中；5 ml 0.2%II型胶原酶溶液，含1%青霉素、链霉素和两性霉素B三重抗生素溶液，购自上海巴斯德传媒科技有限公司，置于5%Co的细胞培养箱中237°C进行消化，每2小时收集一次细胞。用移液管吸取上清液，并通过200米的尼龙筛过滤。滤液转移至15 ml Eppendorf管中，在室温下以1000×g离心3 min，并丢弃上清液；用4ml完全培养基重新悬浮细胞颗粒，然后在T25细胞培养瓶中均匀培养，并培养软骨细胞。将5 ml含有1%抗生素的0.2%胶原酶溶液添加到原来的60-mm培养皿中，共进行三次消化。24小时后，当细胞粘附时更换培养基，每2天更换一次培养基。用倒置光显微镜观察细胞生长。当细胞融合达到~90%时，用2.5g/l胰蛋白酶（Promega Corporation）和0.02%EDTA对软骨细胞进行传代培养。第二代的软骨细胞用于随后的实验。
细胞活力测定
根据制造商的说明，使用CCK-8试剂盒分别评估不同浓度H的影响2哦2PJ34和RJNTF对软骨细胞活性的影响。将第二代软骨细胞接种在96个板中（2000个细胞/孔），然后暴露于H2哦24小时（0、100、200、300、400、500、600、700或1000µM），PJ34持续4.5小时（0.001、0.01、0.1、1、10、100或1000μM），RJNTF（0、100200、400、800、1600、3200、6400或12800µg/ml）持续24、48或72小时。用10%CCK-8溶液处理每个孔，并在37°C下再培养2 h。使用EnSpire在450 nm处检测吸光度®多模读板器（PerkinElmer，Inc.）。
DAPI染色
软骨细胞（2×105细胞/孔）接种到放置在6孔板中的细胞爬行器中。培养24小时后，将细胞爬行体转移到一个新的6孔板中，并用PBS清洗两次。用4%多聚甲醛固定液（Beyotime生物技术研究所）固定30分钟后，用PBS冲洗两次，软骨细胞在室温下用500µl DAPI染色10分钟，然后用PBS洗涤两次，每次洗涤共3分钟。在徕卡DMi8倒置荧光显微镜下观察细胞形态（徕卡微系统公司）。
流式细胞术
根据制造商的方案使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒。简单地说，收集软骨细胞并用PBS冲洗两次。接下来，在黑暗中用500µl 1×结合缓冲液和5µl PI及5µl Annexin V-FITC标记软骨细胞15分钟。使用细胞FLEX流式细胞仪（Beckman Coulter Inc.）和CytExpert（2.4版；Beckman Coolter，Inc.）测量细胞凋亡率。
PARP1的拆卸
软骨细胞（2×105细胞/孔）接种到96个板中。带有绿色荧光蛋白的短干扰RNA（si）阴性对照物（NC）、si-PARP1#1（阳性病毒114447）、si-PARP1#2（阳性病毒144448）和si-PARM1#3（阳性病毒113449）购自GeneChem，Inc(表一). 24小时后，将病毒储存在−80°C下，需要时取出，放在冰上解冻。使用完全培养基将这四种病毒分别稀释至100、50和10的多重感染（MOI）。从细胞中丢弃培养基，使用核酸浓度为1×10的核酸转染试剂盒（上海基因化学有限公司）8根据分组添加TU/ml和有效转染增强剂HiTransG A和HiTransG P（GeneChem，Inc.），并在37°C下与5%CO混合培养2转染后，用10%FBS-DMEM替换培养基，并在37°C下用5%CO培养细胞248h后，在荧光显微镜下观察转染效率。转染效率计算如下：转染效率=（荧光细胞数/细胞总数）×100。挑选出转染效率高的病毒后，复制软骨细胞凋亡模型。
逆转录定量PCR（RT-qPCR）
软骨细胞（3×106细胞/孔）接种在6孔板中，并用上述不同的siRNA构建物之一处理。使用TRIzol从细胞中提取总RNA®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和RNA浓度被测量。根据制造商的协议，使用Evo M-MLV RT试剂盒（湖南阿克雷生物工程有限公司）合成cDNA，并使用SYBR Green Pro Tap（湖南阿克里生物工程有限责任公司）在Bio-Rad CFX96放大器上进行qPCR扩增。热循环条件为95°C，持续3分钟；然后在95°C下进行40次10秒和60°C下30秒的扩增。以β-actin为内部对照，将相关基因表达归一化为β-actinmRNA表达，并使用2-ΔΔCq方法(30). 引物的序列列于表二.
蛋白质印迹
用冷PBS洗涤细胞三次并吸干，然后在冰上加入补充有1mM PMSF的120µl RIPA（Beyotime Institute of Biotechnology）缓冲液30分钟；培养皿每10分钟振荡一次，将裂解物转移到1.5 ml EP管中，该管在4°C下以12000×g离心5分钟。收集上清液，共5µl上清液用于BCA蛋白定量，并将5×SDS-PAGE蛋白取样缓冲液加入剩余上清液中。根据制造商的说明，使用核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒（Beyotime生物技术研究所；目录号P0028）提取细胞核和细胞质蛋白质，将缓冲液与蛋白质上清液混合，然后在99°C的恒温金属浴中加热10分钟，使蛋白质充分变性并储存在−80°C。每个通道共装载30µg蛋白质样品，并用10%或15%的SDS-PAGE在30 V下分离10分钟，80 V下分离30分钟，110 V下分离55分钟，然后转移到0.45-µm PVDF膜上；15%的PAGE凝胶用于caspase-3、cleaved-caspase-3、AIF、MIF、组蛋白和β-actin，而10%的PAGE胶用于PARP1、cleaved-PARP1、PAR和β-attin。靶蛋白和相应的内部参照物均在同一膜上运行；将其切成条状，并分别进行探测，以确保每个蛋白质都能与特定抗体孵育。在25°C下用NcmBlot封闭缓冲液封闭膜10分钟后，用抗PARP1的一级抗体（1:5000；Proteintech Group，Inc.；cat.no.66520-1-Ig）、caspase-3（1:1000；Proteitech Group，Inc.，cat.no.19677-1AP）、裂解的PARP1（1:1000，Cell Signaling Technology，Inc.；cat.no.94885S）、，裂解caspase-3（1:1000；Cell Signaling Technology，Inc.；目录号9661S）、PAR（1:200；Enzo Life Sciences，Inc.；分类号ALX-804-220-R100）、AIF（1:1000，目录号5318S；Cell信号技术，Inc.）、MIF（1:11000；Abcam；目录号Ab175189）、β-肌动蛋白（1:1000）、细胞信号技术，Inc；目录号8457S）或组蛋白（1:100；Abcam；猫。编号Ab1791），在4°C下过夜。第二天，用TBST（含0.1%吐温-20，10X的TBS）清洗膜三次，然后用相应的HRP结合二级抗体（1:20000；Cell Signaling Technology，Inc.；目录号7074S）在25°C下培养1小时。用TBST冲洗膜三次，并使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.）对信号进行可视化，该系统使用增强化学发光western印迹底物。使用ImageJ（win64版本；美国国立卫生研究院）进行密度测定分析，并将其归一化为相应的β-肌动蛋白或组蛋白带。
协同免疫沉淀（IP）测定
将抗AIF（1:1000；类别号5318S；Cell Signaling Technology，Inc.）、MIF（1:11000；类别号Ab175189；Abcam）和β-actin（1:1000，类别号8457S；Cell-Signaling Technical，Inc.）的稀释抗体（400µl）吸入50µl磁珠中并充分混合，然后在4°C下孵育2 h。磁选后，收集磁珠，添加500µl磷酸盐缓冲液（上海巴赛尔传媒科技有限公司），将磁珠搅拌均匀，磁选后丢弃上清液。清洗四次。添加总共200µl的裂解缓冲液（贝约泰姆生物技术研究所），然后在4°C下裂解30分钟，每10分钟搅拌一次细胞，以确保与裂解缓冲液完全接触，然后在12000×g的温度下在4°C下离心10分钟。收集上清液并将其置于4°C。在BCA定量后，将20µl SDS-PAGE加载缓冲液添加到磁珠中并均匀混合，然后将磁珠在99°C下加热10 min，分离磁珠并使用上清液进行western印迹。
统计分析
使用GraphPad Prism（8.0版；Dotmatics）进行数据分析。采用非配对双样本t检验比较两组之间的差异。对于多组比较，使用单向方差分析，然后使用Tukey的事后检验。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
<秒>网络药理学分析，以确定RJNTF治疗KOA的关键靶点和核心信号通路
KOA的差异基因和RJNTF的关键靶点
共获得644个显著改变和影响的差异基因，包括423个上调基因和221个下调基因(图1A). 利用TCMSP数据库筛选得到RJNTF共45个活性成分，对应234个靶点。KOA和RJNTF之间有29个共同目标，如图1B; 每种药物对应的活性成分数量为6牛膝Blume，10代表乌拉尔甘草Fisch，4个代表韦伯巴里亚纳汉森尼亚（Fedde ex H.Wolff）Pime，3人Heracleum铁杉模具，11个防风防风（Turcz.）Schischk和11当归（橄榄色）狄尔斯(图1C).
RJNTF治疗KOA的关键目标
将RJNTF治疗KOA的靶点导入Cytoscape生成PPI网络，共获得1966个相关靶点和48840个靶点之间的相互关系；进一步使用插件CytoNCA根据网络节点的拓扑属性，利用度中心值对网络节点进行过滤，通过剔除无关节点，得到531个相关目标和2218个目标-目标关系。最后，通过中间中心值筛选，获得143个关键靶点和3600个靶点-靶点相互关系，包括STAT3、PI3K、RAF、RAS、AKT、PARP1和JALK2，其机制包括增殖、炎症和凋亡。经过层层筛选，在多个靶点中发现了一个特殊的凋亡靶点PARP1(图2A).
RJNTF治疗KOA的核心信号通路
KEGG分析结果表明，RJNTF可以通过干扰NF-κB、凋亡、HIF-1信号通路、JAT-STAT信号通路和IL-17信号通路等多种信号通路来治疗KOA(图2B) (31——34). 根据大量先前研究的结果表明，PARP1/AIF通路与细胞凋亡密切相关(35——37)网络药理学结果表明，RJNTF治疗KOA与PARP1凋亡途径有关；然而，目前还没有研究评估PARP1/AIF通路与软骨细胞凋亡之间的关系。因此，随后的实验旨在确定潜在的机制。
通过调节PARP1/AIF通路抑制软骨细胞凋亡
关节软骨细胞凋亡模型的建立及鉴定
正常软骨细胞的特征如所示图3A在软骨细胞培养过程中，通过倒置相差显微镜观察，1天后，软骨细胞完全贴壁并开始分裂生长，大多数细胞呈圆形或椭圆形。培养7天后，软骨细胞数量显著增加，并以人行道形状成簇生长；簇间以长条状相互连接，增殖速度加快。当细胞生长到80%的密度时，可以进行传代培养以获得F1软骨细胞。培养3天后，细胞质丰富，细胞核清晰可辨，细胞边缘锐利。培养~4天后，可通过替换获得F2细胞；此时F2细胞仍能保持较好的形态，没有明显的肥大和降解趋势，而F3细胞似乎肥大和退化较多，边缘重叠模糊，伪足较多，增殖速度较慢。因此，选择F2细胞进行后续细胞实验。在图3B用免疫细胞化学（DAB法）对软骨细胞细胞外基质中的胶原蛋白II进行染色，细胞质呈棕黄色，细胞核呈蓝色。在阴性组中，细胞核呈蓝色，而细胞质中没有棕色。结果表明，实验细胞能够合成胶原蛋白II和蛋白聚糖，并具有软骨细胞的功能，因此进行了鉴定。CCK-8检测结果表明，软骨细胞的抑制率随着H的增加而增加2哦2浓度(图4A). 同样，流式细胞术结果也表明，细胞凋亡率随着H的增加而增加2哦2浓度(图4C). 随后，使用DAPI染色，与对照组相比，模型组用500µM H2哦2在凋亡早期，由于染色质在细胞核侧面聚集，细胞核出现凝缩，导致细胞核DAPI染色不均匀。在凋亡的后期，凋亡细胞的细胞核出现大小不等的圆形小泡，可能是凋亡小泡(图4B). Western blotting结果显示，与对照组相比，模型组PARP1的表达降低，而裂解的PARP1表达增加(图4D-F)表明成功建立了关节软骨细胞凋亡模型，可用于后续实验。
PARP1敲低对软骨细胞凋亡的影响
当使用HiTransG P转染增强溶液和100的MOI时，所有三种病毒的转染效率均达到>80%。所有三种PARP1敲除慢病毒的有效转染条件包括MOI=100，转染增强试剂为HitransG P，转染后改变溶液的时间长度为16 h(图5A). RT-qPCR和western blotting结果显示，转染si-PARP1#3的细胞中PARP1表达最低(图5B-D); 因此，该结构用于所有后续实验。流式细胞术结果显示，与si-NC组相比，si-PARP1组软骨细胞凋亡减少。与si-NC组相比，si-NC+H组细胞凋亡率增加2哦2组。si-PARP1+H中软骨细胞凋亡率降低2哦2与si-NC+H组比较2哦2组(图5E和F). 同时，PARP1的敲除导致PARP1、PARP1裂解、PAR和细胞核AIF及MIF水平降低，细胞质AIF和MIF表达增加（P<0.05；图6A-I). 综上所述，PARP1的敲低有效地抑制了软骨细胞的凋亡。
PJ34介导PARP1抑制对软骨细胞凋亡的影响
凋亡与靶PARP1密切相关，尽管PJ34是一种常用的PARP1抑制剂，但其对软骨细胞的抑制作用尚不清楚。为了确定PJ34的细胞毒性作用，软骨细胞暴露于不同浓度（0、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000µM）的PJ34中4.5 h。在所有测试浓度下，PJ34对软骨细胞的活性均无影响(图7A). 基于先前的研究(12)，选择10µM PJ34进行后续实验。此外，用PJ34盐酸盐预处理细胞后，细胞凋亡减少，表明PARP1依赖性通路在软骨细胞凋亡中起着关键作用(图7B和C). 为了了解其作用机制并确定PJ34对软骨细胞的影响，对关键因素进行了免疫印迹分析。与模型组相比，抑制剂组PAR、细胞核AIF和MIF蛋白表达水平下调，细胞质AIF和MI蛋白表达水平上调（P<0.05），caspase-3、裂解caspase-2、PARP1和裂解PARP1蛋白表达水平差异无统计学意义。Co-IP结果表明，AIF与MIF相互作用，PJ34的加入降低了这种相互作用。总之，抑制PARP1可有效降低软骨细胞凋亡(图8A-K).
RJNTF通过调节PARP1/AIF通路抑制软骨细胞凋亡
如上所述，软骨细胞凋亡至少部分由PARP1/AIF途径介导。使用CCK-8分析，最终选择800、1600和3200µg/ml RJNTF处理细胞48小时，用于后续实验(图9A). 流式细胞仪结果显示，与模型组相比，RJNTF低、中、高剂量组软骨细胞凋亡率降低，而RJ34治疗组软骨细胞的凋亡率较低（P<0.05；图9B和C). Western blotting结果显示，与模型组相比，RJNTF中、高剂量组的裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、裂解PARP1、PAR、细胞核AIF和MIF的蛋白表达水平下调，而PARP1，caspase-3和细胞质AIF及MIF的表达水平上调（P<0.05）。与抑制剂组相比，RJNTF高剂量组caspase-3和PARP1蛋白表达水平上调，RJNT高剂量组裂解caspase-2、裂解PARP1和蛋白表达水平下调（P<0.05；图10A-F). 在模型组和RJNTF组的沉淀物中均检测到AIF和MIF蛋白表达水平，表明AIF与MIF之间存在相互作用，并且这种相互作用在添加RJNTF后减弱(图11A-E). 综上所述，RJNTF通过抑制PARP1/AIF通路而有效减少软骨细胞凋亡。
讨论
蛋白质相互作用的网络药理学分析表明，RJNTF通过调节STAT3、PI3K、RAF、RAS、AKT、PARP1、JALK2和PARP1对KOA发挥有益作用。太阳等(38)通过在C57BL/6J小鼠中构建OA动物模型，发现TANK结合激酶1（TBK1）在KOA中高水平表达。TBK1激活JAK/STAT信号通路，TBK1的敲除抑制细胞外基质降解。通过用STAT3过表达质粒转染细胞，TBK1基因敲除的有益作用被消除。AKT1是PI3K/AKT信号通路中的一个重要下游靶激酶，它可以调节mTOR信号通路和其他通路，IL-1β诱导软骨细胞增殖，并可以减少细胞凋亡(39). 研究表明，Ras独立抑制Erk1/2的激活。这种效应与转录因子（如Elk-1）的激活减少有关，Elk-1通过抑制参与KOA软骨降解过程的主要分解代谢因子抑制软骨损伤(40). 上述结果表明KOA的作用机制包括增殖、炎症和凋亡(41——44).
KEGG分析表明，RJNTF通过干扰NF-κB通路、凋亡通路、HIF-1信号通路、JAT-STAT信号通路、IL-17信号通路和其他治疗膝关节的信号通路，对KOA发挥作用(45——48). NF-κB与炎症密切相关，网络药理学结合在体外实验证实，风湿骨痛胶囊治疗KOA的作用机制与NF-κB信号通路有关(49). 已经注意到，在软骨下骨中维持缺氧环境可以缓解骨关节炎的进展。HIF是诱导缺氧基因、修复细胞氧环境并在OA治疗中发挥重要作用的核心调节因子(50，51). 已有研究表明，IL-17信号通路在KOA患者的滑膜组织中高度调节，表明IL-17通路在KOA软骨细胞和滑膜组织具有较好的转录反应，可诱导关节炎疾病中的破骨细胞生成和骨侵蚀；因此，IL-17信号通路可能是KOA治疗和诊断的潜在靶基因(52，53). 几种途径在KOA中起调节作用；其中，PARP1与细胞凋亡密切相关(37，54). 例如，伴侣介导的自噬可以通过抑制PARP1蛋白的裂解表达来抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡(55); 极光激酶A敲除通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和-9以及PARP1的裂解促进EB病毒感染的非典型腺细胞的凋亡(56). 此外，PARP-1/AIF在细胞核中的共定位表明，PARP-1在AIF介导的碳离子促凋亡中起着关键作用(14). 因此，我们假设RJNTF可能通过调节PARP1/AIF通路对软骨细胞凋亡产生抑制作用，随后的实验旨在验证这一假设。
PARP1是一种在大多数真核细胞中表达的DNA修复酶，通过识别结构受损的DNA片段而激活，被认为是DNA损伤，也是凋亡核心成员蛋白caspase的裂解底物(57). PARP1的主要功能是感知和修复DNA断裂(48). PARP1与DNA链断裂结合，然后将PAR多聚体转移到PARP1本身，PARP1自身招募DNA修复机制来修复DNA损伤。PARP1催化组蛋白上PAR的形成，从而诱导染色质中的染色质松弛，从而提高DNA修复机制对DNA断裂的活性。因此，PARP1被激活的caspase-3激活以抑制这些过程，并在损伤程度过大时激活凋亡。在本研究中，发现在软骨细胞中，在PARP1结合的DNA链断裂后，激活的caspase-3可以裂解PARP1，89-kDa PARP1片段从受损DNA中释放出来，因为它无法再将24-kDaPARP1片断与DNA结合。同时，PAR合成的启动导致AIF的释放，与巨噬细胞MIF一起向细胞核移位，DNA内切酶和核酸外切酶G的作用导致染色质凝聚和DNA断裂(36). 发现PARP1抑制剂PJ34可以抑制这种凋亡，但加入PJ34后，PARP1和裂解PARP1的蛋白表达水平没有改变，而PAR表达显著下调，AIF和MIF核转位现象受到抑制。因此，PJ34通过抑制PAR的合成，进一步抑制AIF进入细胞核引起的凋亡。
流式细胞术结果表明，RJNTF通过干扰PARP1/AIF通路抑制软骨细胞凋亡。然而，随着RJNTF的加入，尽管裂解的胱天蛋白酶-3、裂解的PARP1、细胞核AIF和MIF的表达降低，胱天蛋白酶-3、PARP1、细胞质AIF和MIF的表达增加，但随着RJNTF浓度的增加，其没有显示出剂量依赖性效应。结合流式细胞仪结果，RJNTF高剂量组的细胞凋亡率低于PJ34组；显著差异表明H的使用2哦2建模不仅影响PARP1/AIF的凋亡途径，还影响其他凋亡途径的参与。RJNTF不仅可以通过干扰PARP1/AIF通路来抑制凋亡，还可以通过其他途径抑制凋亡，因此与单一抑制剂相比，RJNTF在抑制凋亡方面发挥更为有效的作用。这再次为RJNTF治疗KOA的多靶向、多途径效应提供了可靠的实验依据。
总之，本研究证明RJNTF可降低H2哦2-通过PARP1/AIF信号通路诱导软骨细胞凋亡(图12). 这些发现为理解RJNTF的治疗机制提供了新的途径，并为RJNTF的进一步探索和临床应用提供了参考。然而，值得注意的是，本研究的局限性在于它是一个在体外RJNTF与软骨细胞直接接触的研究。这可能并不反映情况体内因为RJNTF是口服的，不清楚口服后RJNTF的所有成分是否直接接触软骨细胞；这将在未来的研究中进一步研究。