介绍
结直肠癌（CRC）是人类最危险的恶性肿瘤之一，是美国男性和女性中第三大最常见的癌症。根据美国癌症协会的数据，2023年美国将新增106970例结肠癌和46050例直肠癌(1). CRC很常见，尤其是在经济发达国家，它与生活方式的改变有关，例如当前的饮食习惯、吸烟率的增加、缺乏锻炼以及超重和肥胖人数的增加(2). CRC复发率高，术后5年生存率低，转移率高(3). 在许多情况下，化疗药物是CRC患者最常用的治疗方法。然而，这些疗法会引起一些剂量限制性的不良反应，包括延迟腹泻、胃肠粘膜炎、中性粒细胞减少和骨髓抑制(4). 因此，开发副作用较少的新型有效抗肿瘤药物仍然至关重要。
已经证明，细胞周期阻滞依赖于DNA损伤信号通路的激活，这也会影响癌细胞的增殖(5). 以前的研究报告称，选择性靶向参与细胞分裂或凋亡调节的特定生物标记物可以对肿瘤生长或癌细胞的支持环境产生重大影响，而对正常细胞的影响最小(6–8). 能够抑制细胞周期和诱导细胞凋亡的化合物的鉴定显示了开发用于CRC治疗的潜在药物的前景。大量研究表明，内质网应激作为一种分子机制在肿瘤治疗中发挥着重要作用。在药物刺激下，未折叠的蛋白质可以在细胞质中积累，从而导致内质网应激的启动(9,10). 持续内质网应激激活PERK下游信号eIF2α，导致蛋白翻译抑制；这最终导致细胞损伤和凋亡(11).
本研究合成了一种新型小分子化合物1-[（4-乙氧基苯基）氨基]-7a，11a-二氢-3H-萘酚[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮（化合物225#），并探讨了化合物225#是否能同时抑制CRC的增殖在体外和体内本研究进一步讨论了其机制，以确定其是否可以被视为CRC治疗或辅助治疗的潜在候选药物。
材料和方法
<秒>试剂和抗体
抗P21（类别号2947T）、细胞周期蛋白B1（类别号4138T）、磷酸化（p）-检查点激酶2（CHK2）（类别号2197T）、CHK2（类别号2662T）、p-ATR（类别号2853T）、ATR（分类号2790S）、p-BRCA1（类别编号9009T）、BRCA1。X（产品目录号9718T），H2A。X（分类号7631T）、p-P53（分类号9286T）、P53（类别号9282T）、P27（分类号2552T）、S-相激酶相关蛋白2（SKP2；分类号4358T）、PARP（分类号9542T）、PUMA（分类号4976T）、calnexin（分类号2679T）、蛋白质二硫键合酶（PDI；分类号3501T）、p-eIF2α（分类号3398T）、eIF2β（分类号5324T）、PERK（分类号编号5683T），泛素（Ub；分类号20326T）和LC3B（分类号3868T）购自Cell Signaling Technology，Inc。；抗α-微管蛋白（分类号AF0001）和CDK1（分类号AF0111）的一级抗体购自Beyotime生物技术研究所；和抗细胞周期蛋白A1的一级抗体（类别号13295-1-AP）购自Proteintech Group，Inc.。所有一级抗体均用西方一级抗体稀释液（类别号AZ100；Beyotime生物技术研究所）稀释至1:1000。抗兔IgG（DyLight™800 4X PEG偶联物；猫编号5151P）和抗鼠IgG二级抗体（DyLight™680偶联物；猫编号5470P）来自Cell Signaling Technology，Inc.（1:15000）。MTT（分类号ST316）、BeyoClick™EdU-594细胞增殖检测试剂盒（分类号C0078S）、0.5%结晶紫（分类号CO121）、碘化丙啶（PI；分类号ST512）、RNase A（分类号ST 578）、Annexin V-FITC（分类号C1062S）和BCA试剂盒（类别号P0010）购自Beyotime生物技术研究所。二甲基亚砜（DMSO；目录号D2650）和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自MilliporeSigma。
化合物225的合成#
化合物225#的合成如所示图1将氯乙酰氯（1.5当量）添加到1-氨基蒽醌化合物1（1当量）在苯中的搅拌悬浮液中。将混合物在70°C下搅拌12 h。通过过滤分离沉淀物，并依次用饱和NaHCO清洗3去离子水和乙醇。将黄色化合物2在真空下干燥24小时，获得89%的产率。随后，将化合物2和三乙胺（3当量）在乙醇中的混合物回流12小时。将混合物冷却至室温后，将其置于4°C。过滤掉固体沉淀物，用少量冷乙醇洗涤，并风干，得到化合物3（15%产率）。为了获得化合物225#，将化合物3（1当量）、4-乙氧基苯胺（1当量，得到了收率为7%的目标化合物。1H和13C NMR在Bruker 400光谱仪上测量（Bruker Corporation）(图S1).
细胞培养
人类结肠癌细胞系HCT116和SW620，以及正常人结肠癌细胞株FHC和293T细胞均来自美国型培养收集。HCT116细胞在补充有10%胎牛血清（FBS；猫编号10100147，澳大利亚原产）（均来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的McCoy 5a培养基（猫编号16600108）中培养。SW620细胞在补充有10%FBS的高糖DMEM（目录号SH30022.01；Hyclone；Cytiva）中培养。FHC细胞在补充了10%FBS（目录号11330032；Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的DMEM:F12K培养基中培养，10 ng/ml霍乱毒素（分类号HY-P1446；MedChemExpress）、0.005 mg/ml胰岛素（分类号I9278；MilliporeSigma）、0.005mg/ml转铁蛋白（分类号T3309-1；MilliposeSigma。所有细胞均在37°C的培养箱中，在5%CO的湿化环境中培养2.
细胞活力测定
细胞活力和IC50使用MTT法测定化合物225#的值。对HCT116和SW620细胞进行计数，并以1×10的密度接种到96个平板中3细胞/孔，含200µl完整培养基。预培养12小时后，将细胞暴露于37°C下不同浓度的化合物225#（0、1.5、3.1、6.25、12.5、25、50、100和200 nM）中1-4天和5天。为了评估细胞活力，向每个孔中加入20µl MTT溶液（在PBS中为5 mg/ml），并再孵育4小时。然后移除培养基，加入200µl DMSO以溶解甲赞晶体。将平板搅拌10分钟，然后使用微孔板阅读器（BioTek Instruments，Inc.）在570 nm的吸收波长下测量光密度。实验重复三次，增殖抑制曲线和IC50值是使用GraphPad Prism 5（Dotmatics）生成的(12).
EdU染色分析
使用BeyoClick™EdU-594细胞增殖检测试剂盒评估细胞增殖。对CRC细胞株（SW620和HCT116）进行计数，并以1×10的密度接种到96个培养板中4细胞/孔，含200µl完整培养基。预培养12小时后，用0、12.5、25和50 nM化合物225#在37°C下处理SW620和HCT116细胞24小时。随后，将EdU添加到每个孔中，并在37°C下培养2 h，然后在室温下用Hoechst 33342染色30 min。使用高含量分析系统Operetta CLS™（PerkinElmer，Inc.）进行分析。
集落形成分析
菌落形成试验用于评估在体外用指定浓度的化合物225#处理后CRC细胞的增殖。简单地说，CRC细胞系（SW620和HCT116）以1×10的密度接种在6孔板上3细胞/孔置于2ml培养基中。培养12小时后，用0、6.5、12.5和25 nM化合物225#在37°C下处理SW620和HCT116细胞10天。随后，用PBS清洗细胞两次，并在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟。在另一轮清洗后，在室温下用0.5%结晶紫（分类号C0121；Beyotime生物技术研究所）对细胞染色15分钟，并检查菌落形成情况（菌落定义为>50个细胞）。清洗掉过多的结晶紫，并使用爱普生扫描仪（爱普生公司）观察和分析菌落。
细胞周期分析
PI染色后，使用流式细胞仪（Accuri™C6；BD Biosciences）评估化合物225#对细胞周期分布的影响。将SW620和HCT116细胞以2×10的密度接种在6厘米的培养皿上6细胞/培养皿。过夜培养后，在37°C下用不同浓度的化合物225#（0、25、50和100 nM）处理细胞24小时。随后，将细胞固定在4℃的70%冰镇乙醇中24 h，再悬浮在含有1µl PI（5 mg/ml）和1µl RNase A（5 mg/ml）的200µl PBS中，并在37℃的黑暗中培养30 min。使用流式细胞仪测量PI荧光，并通过FlowJo7.6软件（FlowJo，LLC）分析获得数据(4).
细胞凋亡的流式细胞术分析
将SW620和HCT116 CRC细胞接种在6 cm培养皿（2×10）上6细胞/培养皿）。过夜培养后，将细胞与化合物225#（0、50、100和200 nM）在37°C下培养48小时。收集细胞后，用冰镇PBS清洗细胞，然后将其重新悬浮在含有5µl Annexin V-FITC和5µl PI（50µg/ml）的200µl PBS中。在室温下黑暗培养15分钟后，使用流式细胞仪（Accuri™C6；BD Biosciences）分析样品，并通过FlowJo7.6软件分析获得数据。
mCherry-GFP-LC3B的荧光观察
为了进一步研究化合物225#是否能够调节自噬流量的进程，HCT116细胞被一个对pH敏感的双标记mCherry-GFP-LC3B报告子感染。这允许评估自噬体和溶酶体的融合效率。利用慢病毒感染，建立了稳定表达mCherry-GFP-LC3B（分类号P4837；武汉妙龄生物科技有限公司）的HCT116细胞。使用Lipo8000™转染试剂（分类号C0533；Beyotime生物技术研究所）以1:1:1的比例将mCherry-GFP-LC3B、Pspax2（分类号P0261；武汉妙龄生物技术科学）和pMD2G（分类号JY03028；南京江源生物技术有限公司）载体共同转染到293T细胞中。在37°C下培养72小时后，提取慢病毒颗粒，然后将其导入HCT116细胞培养基中，感染倍数约为10，并添加10µg/ml聚brene。在37°C下24小时后，更换培养基，并使用10µg/ml嘌呤霉素选择稳定表达mCherry-GFP-LC3B载体的细胞。细胞在6厘米的培养皿（2×106细胞/培养皿），然后用化合物225#（0、25、50和100 nM）在37°C下处理48小时，然后在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗涤数次，并使用高含量分析系统Operetta CLS™（PerkinElmer，Inc.）分析数据。
蛋白质印迹
在37°C下用化合物225#（0、50、100和200 nM）处理24小时后，收集SW620和HCT116人CRC细胞，并将其添加到含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（类别号P0013；贝约泰生物技术研究所）中；在冰上30分钟后，将样品在4°C下以16602×g离心15分钟。使用BCA试剂盒评估上清液中的蛋白质浓度。随后，用8-15%SDS-PAGE分离等量的蛋白质，转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂牛奶培养1小时，然后在4°C下用一级抗体培养过夜。在室温下与二级抗体孵育1小时之前，用TBS-0.5%吐温冲洗膜。最后，在Tanon 5200成像系统（Tanon Science and Technology Co.，Ltd.）上对膜进行可视化。利用ImageJ 1（美国国立卫生研究院）分析条带的灰度，并以α-微管蛋白为参考计算目标蛋白的表达水平。
异种移植小鼠模型
从湖南四甲实验动物有限公司获得30只裸鼠Balb/c雌性小鼠（年龄4-6周；体重约20g）。将小鼠培养在特定的无病动物室中，在温度28°c、湿度50%的通风笼子中，在光照10 h、黑暗14 h的条件下进行培养，并提供随意获得足够的食物和水。实验过程是在2.5%异氟烷气体麻醉下进行的。皮下注射HCT116细胞（5×106细胞）建立异种移植模型。当肿瘤达到约100毫米的平均体积时330只小鼠随机分为3组（n=10/组），分别为对照组（0mg/kg）、复方225#组（10mg/kg）和30mg/kg组。化合物225#组接受10或30 mg/kg化合物225#溶于100µl溶剂（5%DMSO、30%PEG300、10%吐温-80和55%生理盐水）的胃内给药。给药疗程为6天（连续3天每天一次，然后停药3天），共进行5个疗程。每隔3天用游标卡尺测量肿瘤长度（L）和宽度（W），并用标准公式计算肿瘤体积：（L×W2)/2. 32天后，通过颈椎脱位对所有小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重以进行进一步分析。
统计分析
所有数据均使用GraphPad Prism 5.0和SPSS 18.0（SPSS，Inc.）进行分析，并以至少三个独立实验的平均值±SD表示。使用单向方差分析对两组以上患者进行统计分析，然后进行Tukey事后检验。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
<秒>化合物225#抑制体外CRC细胞增殖
为了研究化合物225#对人CRC细胞的抗增殖活性，用化合物225#处理HCT116和SW620细胞1-4和5天，并用MTT法测定细胞活力。集成电路50HCT116和SW620细胞的化合物225#的值显示在表一。如所示图2A，人CRC细胞的存活率呈剂量和时间依赖性下降。此外，在相同浓度下，化合物225#对人直肠粘膜细胞（FHC）几乎没有影响(图2A)表明其对正常细胞毒性低。同样，菌落形成试验表明，化合物225#能够以剂量依赖的方式有效地减少菌落的大小和数量(图2B). 与对照组相比，暴露于化合物225#后，EdU阳性细胞数量显著减少，且呈剂量依赖性(图2C)表明化合物225#具有抑制HCT116和SW620细胞增殖的能力。这些结果表明，化合物225#实际上是抑制人CRC细胞增殖的抑制剂。
化合物225#诱导细胞周期阻滞于G<sub>2</sub>/M期
为了进一步阐明化合物225#抗CRC作用的机制，本研究研究了其对细胞周期进程的影响。流式细胞术显示化合物225#诱导G细胞数量显著增加，且呈剂量依赖性2/孵育24小时后的M期(图3A). 值得注意的是，100nM化合物225#增加了G中SW620细胞的数量2/与对照组相比，M期减少了68.8%，S期减少了36.4%。同样，用100 nM化合物225#处理后，G组HCT116细胞数量显著增加（62.3%）2/M期和S期细胞数与对照组相比明显减少（21.3%）(图3A). 为了进一步评估其对有丝分裂进程的影响，通过蛋白质印迹分析了细胞周期相关蛋白的表达水平。与对照组相比，化合物225#降低了细胞周期蛋白A1、细胞周期蛋白B1、CDK1和SKP2的表达水平，而P21和P27的表达水平呈剂量依赖性增加(图3B). 根据这些数据，化合物225#可能通过调节G2/M相。
据报道，细胞周期阻滞依赖于DNA损伤途径的激活(4). 因此，使用蛋白质印迹法检测DNA损伤相关蛋白，以评估CRC细胞中是否存在DNA损伤。正如预期的那样，p-CHK2、p-ATR、p-BRCA1和γ-H2A的表达水平。化合物225#处理后，HCT116和SW620细胞中X上调，而p-P53略微下调(图3C). 因此，这些结果表明化合物225#可能会导致CRC细胞的DNA损伤，从而导致G细胞周期阻滞2/M相。
化合物225#诱导人CRC细胞凋亡
本研究调查了细胞凋亡是否是响应于化合物225#而触发的。流式细胞仪分析结果表明，化合物225#诱导SW620和HCT116细胞凋亡，并以浓度依赖性的方式增加晚期凋亡中的细胞比例（SW620细胞从1.8%增加到29.5%；HCT116电池从6%增加到36.1%）(图4A). 随后，通过western blotting评估凋亡相关蛋白的表达水平。正如预期的那样，经225#化合物处理后，PARP裂解表达水平增加(图4B). 值得注意的是，经化合物225#处理后，PUMA在SW620和HCT116细胞中的表达水平也增强(图4B). 总之，这些数据表明化合物225#可能具有调节凋亡相关蛋白活性的能力，从而诱导人CRC细胞凋亡。
化合物225#诱导内质网应激反应和CRC细胞内泛素聚集
一般来说，当细胞受到外部因素的刺激时，如细胞病毒感染和细胞营养素缺乏，内质网管腔中会出现大量未折叠或错误折叠的蛋白质积累，这种积累最终导致内质网应激和随后的细胞凋亡(13). 据推测，内质网应激可能在暴露于化合物225#后激活，因为检测到诱导凋亡。因此，利用western blotting研究细胞内错误折叠蛋白积累对内质网应激的影响。如所示图5AER应激相关蛋白，包括p-eIF2α、PDI、PERK和calnexin的表达水平呈剂量依赖性增加。这些发现表明，用化合物225#处理可能导致未折叠或错误折叠的蛋白质积累。
据报道，在刺激内质网应激之前，未折叠或错误折叠的蛋白质将被Ub标记(14)；因此，本研究研究了225化合物处理后泛素化蛋白是否聚集。如所示图5B经化合物225处理后，泛素化聚集体的积累呈剂量依赖性增加。总之，这些观察结果表明，化合物225#诱导了泛素聚集物的积累，这可能会进一步引发内质网应激。
化合物225#诱导人CRC细胞自噬
多项研究表明，内质网应激可诱导自噬激活，通过自噬体的形成吞噬应激内质网(15). 为了确定化合物225#是否能够调节自噬，采用western blotting检测抑制剂治疗后LC3-II的变化。值得注意的是，化合物225#在SW620和HCT116细胞中以剂量依赖的方式诱导LC3B-II的积累(图6A)表明自噬被激活。
化合物225#对自噬通量的调节如所示图6B; 与对照组相比，化合物225#处理的HCT116细胞中红色荧光点更明显，几乎没有产生黄色荧光点，这表明用化合物225#处理后，溶酶体的酸性环境导致GFP荧光猝灭，自噬体与溶酶体发生融合，表明自噬通量增加。
化合物225#体内抑制CRC肿瘤生长
研究化合物225#对大肠癌生长的影响体内建立了HCT116×转基因小鼠模型。如所示图7A，给予化合物225#32天显著抑制HCT116肿瘤小鼠的肿瘤生长。治疗6天后，10 mg/kg和30 mg/kg化合物225#治疗组的平均肿瘤体积显著小于对照组(图7B). 到第32天，10 mg/kg和30 mg/kg化合物225#治疗组的平均肿瘤体积分别仅为对照组的27.4%和14.3%。此外，与对照组相比，10 mg/kg和30 mg/kg化合物225#治疗组的肿瘤重量分别减少72.7%和90.6%(图7C). 此外，在第32天，与对照组相比，使用化合物225#的小鼠体重减轻，但不显著(图7D). 总的来说，这些结果表明化合物225#可以有效抑制HCT116 CRC肿瘤生长体内在中体内设置。
讨论
CRC是一种常见的影响消化系统的恶性肿瘤，其全球发病率在恶性肿瘤中仅次于肺癌(2). 化疗对CRC患者的治疗和预后至关重要。然而，由于副作用和耐药性的出现，目前的化疗药物在疗效方面存在局限性。因此，开发和鉴定具有更大效力和更低毒性水平的新药势在必行。在本研究中，合成了化合物225#，并对CRC细胞表现出一定程度的抗增殖活性。这一发现鼓励进一步研究其抗增殖作用和相关分子机制。结果表明，化合物225#能有效抑制CRC细胞的增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，促进细胞自噬。首先，研究了化合物225#在CRC细胞中的抗癌活性及其对正常人结直肠上皮细胞的细胞毒性。值得注意的是，化合物225#有效地抑制了CRC细胞的活性，而对正常人类大肠上皮细胞的活性只有轻微影响，表明其具有高抗肿瘤活性和低毒性。此外，使用集落形成和EdU分析评估化合物225#对CRC细胞增殖的影响。结果表明，化合物225#对集落形成和EdU阳性细胞数量有明显的剂量依赖性抑制作用。其次，在体内异种小鼠模型，其肿瘤生长表现出剂量依赖性抑制。此外，用225#化合物治疗的小鼠的体重减轻没有显著高于对照组，表明其低毒性。基于两方面的研究结果在体外和体内研究表明，化合物225#有望成为CRC的治疗剂。
细胞周期进程的失调是癌症的一个关键特征。诱导细胞周期阻滞，尤其是在G2/M期，可能是解决癌细胞失控增殖的有效策略(16). 细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白A1与CDK1一起作为G中的特定调节因子2/M相，它们有助于将一个细胞分裂为两个(17). 流式细胞术分析显示化合物225#诱导G2/CRC细胞中的M期阻滞。进一步的western blotting显示，化合物225#处理增强了p-CHK2、p-ATR、p-BRCA1和γ-H2A的表达水平。十、 同时降低p-P53的表达水平，表明DNA对细胞周期的损伤。以前有报道称，p-P53的下调与DNA损伤和CHK2激活有关(18). P21以P53依赖或独立的方式在阻断CDK1/细胞周期蛋白B1的激活中起关键作用(19). 从机制上讲，化合物225#处理显示引起SKP2的显著下调。两种重要的肿瘤抑制因子P21和P27(20)在本研究中，发现化合物225#处理的CRC细胞中SKP2底物上调。本研究结果表明，化合物225#具有抑瘤作用，部分归因于抑制SKP2并促进其下游靶点P21和P27。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的主要机制之一，在维持人体内的稳态方面发挥着关键作用(21). 诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌药物的主要作用机制。因此，研究抗癌药物诱导细胞凋亡的作用具有重要意义。本研究采用流式细胞术检测化合物225#对大肠癌细胞凋亡的影响。结果表明，化合物225#显著诱导HCT116和SW620 CRC细胞凋亡。值得注意的是，位于P53基因下游的PUMA是一个促凋亡启动子基因，可以通过P53依赖途径激活凋亡，从而诱导肿瘤细胞凋亡。PARP被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶作为底物分解，形成裂解的PARP，最终导致细胞死亡。化合物225#通过增加促凋亡蛋白PUMA的表达水平和裂解PARP诱导HCT116和SW620细胞凋亡。
ER广泛存在于真核细胞中，负责蛋白质合成、折叠、组装和运输以及药物代谢。外部环境刺激可导致细胞内质网功能障碍，内质网应激通过错误折叠蛋白的积累而发生，这是一种自我保护机制(22). 然而，当错误折叠的蛋白质数量超过内质网的处理能力时，会发生一系列病理反应(23). 通常，当内质网应激发生时，细胞内分子伴侣的水平会相应升高(24). Calnexin在内质网中以钙的形式存在2+-需要凝集素样分子伴侣蛋白，该蛋白与尚未完全折叠的新合成蛋白质的寡糖链结合，防止蛋白质相互聚集和泛素化，并抑制不完整蛋白质离开内质网(25). 值得注意的是，Ub蛋白聚集是蛋白质降解的异常表现。然而，在本研究中，经化合物225#处理后，calnexin的蛋白表达水平增加，表明泛素化蛋白的聚集和不完全折叠蛋白的溢出并没有被阻止，这与westernblot检测泛素化蛋白表达增加的结果一致。
在内质网应激条件下，为了暂时削弱细胞整体水平上的mRNA翻译，从而释放细胞内蛋白质的压力，PERK形成二聚体，随后被自身磷酸化激活，从而进一步促进下游eIF2α的磷酸化(26). PDI不仅是一种催化二硫键形成和异构化的酶，而且还是一种重要的伴侣分子(27). PDI的数量随着内质网中错误折叠或未折叠蛋白的增加而增加。在过去几年中，PDI作为药物靶点的潜力，特别是在癌症治疗中，受到了相当大的关注(28). PDI在通过ER相关降解促进错误折叠蛋白的降解中起着关键作用。这一过程涉及受损蛋白质从内质网转移到细胞质，随后在细胞质中泛素化并被蛋白酶体水解酶降解(29). 化合物225#治疗后，为了维持细胞蛋白质内环境稳定，防止蛋白质错误折叠和聚集，分子伴侣的防御被触发，分子伴侣表达升高，这反过来表明内质网应激反应的发生。因此，在本研究中，化合物225#导致PDI、p-eIF2α和PERK的蛋白表达水平升高。CRC细胞中的蛋白质代谢失衡和ER应激有望成为抑制CRC细胞增殖的机制之一。因此，靶向内质网应激信号通路可能是治疗大肠癌的一种有前景的策略。
内质网应激是一种众所周知的细胞应激反应，在激活自噬中起着关键作用。自噬是一种高度重要的进化保守机制，负责维持细胞内环境的稳定(15). 先前的研究表明，自噬的激活依赖于内质网应激的诱导(30,31). 内质网应激诱导的自噬可以通过GFP-LC3点的增加和LC3-II的积累来证明。LC3-II促进自噬的扩展和成熟，自噬被认为是自噬激活的信号(32).
GFP-mCherry-LC3B串联荧光蛋白是一种融合蛋白，专门用于检测自噬通量水平。当细胞中只有红色荧光而没有绿色荧光时，没有重叠，因此没有黄色荧光，表明融合蛋白位于溶酶体或自噬溶酶体中，即自噬通量激活(33). 这突出了其作为抗癌药物开发潜在靶点的重要性(34,35). 激活癌细胞的自噬被认为是提高癌症治疗中化疗有效性的一种有希望的策略。然而，至关重要的是要确保自噬能在癌细胞中被高度激活，才能被视为一种可行的治疗靶点(36). 本研究表明，化合物225#诱导自噬可抑制CRC细胞的增殖活性。本研究是对化合物225#抗癌作用的初步研究。总之，本研究为化合物225#在大肠癌中的显著抗癌活性提供了证据在体外和体内具体而言，化合物225#通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和自噬来抑制CRC细胞的增殖。值得注意的是，内质网应激有助于化合物225#介导的CRC细胞的病理反应。本研究结果表明，化合物225#可能是治疗CRC的有效治疗剂或佐剂。虽然本研究为化合物225#对抗CRC的显著抗癌活性提供了证据在体外和体内，有一些局限性。首先，本研究只是对化合物225#抗癌作用的初步研究，其确切作用机制尚不完全清楚，需要进一步探索。其次，关于该物质的其他具体研究，如与现有抗癌药物的联合，尚未开展，这一领域可以在未来的研究中进一步探索。最后，尽管本研究表明内质网应激可能是化合物225#介导的CRC细胞病理反应的原因之一，但其他可能的机制尚未完全阐明，这还需要进一步的研究来完善。因此，仍需对化合物225#的抗癌作用及其机制进行更深入、更全面的研究。