介绍
端粒是位于染色体顶端的DNA区域。它们由重复核苷酸序列（5'-TTAGG-3'）组成。这些功能性非编码重复序列保护真核生物染色体末端免受磨损和损伤。端粒在有丝分裂细胞分裂期间缩短，因为DNA聚合酶不能完全复制DNA滞后链的末端。这通常被称为“最终复制问题”。
端粒长度（TL）逐渐减少，每年大约减少20-40个碱基对(1). 端粒的缩短可以被端粒酶逆转，端粒酶在高增殖细胞（如男性生殖细胞、活化淋巴细胞、干细胞和癌细胞）中具有活性(2,三). 然而，在大多数成人体细胞中，端粒酶的表达不足，并且TL随着年龄的增长而降低(1). 端粒酶活性与妊娠并发症有关(4,5). 此外，端粒缩短在癌症、心血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎和精神疾病等各种疾病和与年龄相关的疾病中也得到了关注(6-10). 此外，TL是体细胞复制过去和复制潜力的生物标志物。以往的研究主要集中于估计年龄相关疾病的平均TL（MTL）(11,12); 然而，目前的概念强调了极短端粒在细胞内环境稳定中的关键作用(13). 瓦科纳基等以前证明TL和药物滥用之间存在关联，导致过早的生物老化(14). 最近，据报道，创建了一个名为“BIOTEL 2.4版”的数据库，即端粒长度数据库项目（TLDP）(15). 该数据库是一个功能性半自动工作表，用于计算各种TL统计数据，因此是一个有用的工具，可应用于端粒生物学研究以及生物年龄估计(15). 值得一提的是，当端粒长度缩短到阈值以下时，细胞生长受到限制，细胞衰老或凋亡(16). 未经历衰老的细胞中，端粒持续缩短，导致端粒极短（<3kb），易于染色体融合。融合染色体在有丝分裂中不均匀断裂，导致细胞分裂期间基因组不稳定和染色体重排(17). 事实上，较短的端粒负荷已成为比MTL或端粒酶表达更有效的生物标记物(18,19). 事实上，最近的研究表明，短TL与几种与年龄相关的疾病有关，包括CAD、中风、癌症、关节炎、骨质疏松症、白内障、2型糖尿病、高血压、精神病、慢性阻塞性肺病和痴呆(9,20-22). 戈格兰等提示端粒较短的个体死亡率高于端粒较长的个体(23). 人类研究表明，TL可以通过端粒的直接遗传和亲代配子中发现的特定遗传因子进行遗传(24). 此外，端粒缩短可能受到环境因素的影响，包括体力活动、体重指数（BMI）、激素替代疗法、吸烟、慢性炎症、氧化应激、饮食抗氧化剂以及重要的维生素摄入(25-28).
一些研究已经检测了个别营养素与TL的相关性。事实上，B12维生素缺乏与TL和DNA甲基化改变有关(26). 此外，缺乏维生素B12和叶酸会导致DNA甲基化不足、基因组不稳定和端粒缩短(29-31). 在之前的一项研究中，在慢性肾病患者中观察到ω-3（n-3）脂肪酸对热释光的有益作用，这归因于氧化应激的减少(32). 此外，研究表明，ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）可以减轻炎症和氧化应激(33-35)从而保护端粒免受磨损(36). 另一项研究表明，更年期前女性和饮食和补充β-胡萝卜素维生素C或E摄入量较低的女性，较短的TL与乳腺癌风险显著增加有关(37).体外实验表明，抗坏血酸或其衍生物可以延缓端粒缩短(38-40)α-生育酚可以延长某些体细胞的寿命(41). 迄今为止，TL与单一维生素或微量营养素的摄入有关，而对两者结合对端粒状态的影响知之甚少。Tsoukalas最近的一项研究等表明营养物质和天然化合物的协同作用可以激活端粒酶在体外，人外周血单个核细胞；为了揭示端粒酶通过天然分子激活的健康益处，需要对这些制剂进行人体临床研究(42). 流行病学研究表明，多种微量营养素同时缺乏在全球非常普遍，并与慢性病相关；这些研究强调需要通过饮食和营养补充剂（NS）来恢复这些缺陷(43,44).
本研究的目的是分析使用NS组合的人群的TL特征，并与未服用任何补充剂的健康人群相比，评估补充剂对TL的假定影响。
材料和方法
材料和试剂
My Health（Lumis Research SA）的一粒胶囊含有以下成分：混合维生素（抗坏血酸、天然维生素E醋酸盐50%、烟酸、维生素B1、维生素K2 Mena Q7 0.2%、维生素B6、β-胡萝卜素、维生素B12 1%），抗结块剂（微晶纤维素、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、硬脂酸镁和二氧化硅。一滴维生素D（纯D3，天然医生）含有2000 IU维生素D。一粒完整D3和K2辅因子（天然医生）胶囊含有2000 IU维生素D3、100µg K2和56 mg镁。两粒欧米茄3-6-9胶囊（Lumis Research SA）含有以下成分：740 mg鱼油、740 mg亚麻籽油、7400 mg琉璃苣油(博尔戈药用植物L）、200 mg磷虾油、370 mgα-亚麻酸、312.6 mg二十碳五烯酸（EPA）、154.2 mg二十二碳六烯酸（DHA）、162.8 mgγ-亚麻酸（GLA）、400 mg亚油酸和273.8 mg油酸。四粒My抗氧化剂胶囊（Lumis Research SA）含有以下成分：混合维生素（抗坏血酸、抗坏血酸钙、抗坏血酸棕榈酸酯、50%天然维生素E醋酸盐、维生素B3、维生素B12、1%β-胡萝卜素、维生素B5、维生素B6、维生素B2、维生素B1、叶酸、维生素D3生物素），一粒My益生菌胶囊（Lumis Research SA）含有以下物质：冻干的开菲尔谷物，干酪乳杆菌（LMG-S27763），罗伊氏乳杆菌（LMG S-27759），双歧双歧杆菌(双歧杆菌; LMG S-27761），嗜酸乳杆菌（LMG S-27762）、菊粉、阿拉伯胶纤维和羟丙基纤维素。一勺My Gastro（Lumis Research SA）含有以下成分：2500 mg L-谷氨酰胺（Kyowa®)和500毫克低聚果糖（FOS）。我的泛喹啉（Q10）胶囊（Lumis Research SA）含有50毫克泛喹啉。
研究设计
TL估计过程如所示图1参与者是从访问雅典私人诊所进行常规检查的个人以及赫拉克利翁大学医院的人员中挑选出来的。获得了基本的人口统计学数据和慢性病病史。人口统计数据包括姓名、姓氏、出生日期和性别。病史包括所有慢性病的自我报告，如糖尿病、癌症、类风湿关节炎等，可能接触杀虫剂（职业）和使用抗抑郁药物。报告有任何慢性病病史的个人被排除在外。根据这些标准，选择了47名受试者进行研究。他们在研究之前从未服用过任何补充剂，他们属于40-55岁年龄组。参与者身体健康，饮食不受限制。他们被分为两组，如下所示：实验组由16名补充NS的个体组成，对照组由31名未补充任何NS的个体构成。根据制造商的建议分配所有补充剂的每日剂量。从所有个体采集血样，柠檬酸盐用作抗凝剂。所有参与者的补充期持续6至12个月。本研究方案由克里特大学患者和生物材料伦理委员会批准，参考号为63/22.03.2019。根据欧盟一般数据保护条例（GDPR），患者的生物材料和信息是通过书面知情同意书获得的。在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序都符合1964年赫尔辛基宣言及其后续修订的道德标准，或类似的道德标准。
定量荧光原位杂交（Q-FISH）分析
从所有参与者采集外周血样本（2.5 ml）。肝素化血液在添加10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素和链霉素（均来自Sigma-Aldrich）的RPMI-1640培养基中培养，并在CO中刺激72 h2含有植物血凝素的培养箱。中期染色体制备，10µ在收获前2 h向每个培养物中添加g/ml的秋水仙碱，然后进行KCl低渗休克和甲醇/乙酸（3:1）固定。如前所述，对中期进行Q-FISH分析(14,15).
使用63X物镜和电荷耦合设备相机，以1024×1024像素的分辨率和8位的深度拍摄每张幻灯片的图像。对于每一张幻灯片，从3个独立的生物复制品中获得了>10个不同的扫描图像。使用徕卡Q-FISH软件[Leica Application Suite-Advanced Fluorescence（LAS-AF）version 3.1.3 for Leica TCS SP8]对图像进行最大投影和反褶积，并使用ImageJ分析端粒荧光强度(https://imagej.nih.gov/ij/)由两名独立调查人员执行。使用L5178Y-S细胞（分类号93050408；英国公共卫生部文化收藏中心）将端粒荧光值转换为kb，TL稳定且已知，估计约为7kb(45).
统计分析
估计TL（整个端粒基因组）和短端粒TL（TLS）的百分位数（TL<20%）。使用Kolmogorov-Smirnov检验和Liliefors校正评估TL和TLS正常性检查。在未达到假设的情况下，使用皮尔逊齐方检验或费希尔精确检验检验比例差异。年龄比较采用独立样本t检验。在对年龄和性别进行调整后，应用多元线性回归检验NS对TL和TLS长度的影响。Box和Whisker图和bar-charts用于数据图形表示。使用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行数据分析，对零假设的接受程度设定为P=0.05。
结果
对照组（CG）和NS组（NSG）参与者的人口统计学特征如所示表一两组之间的性别分布没有显著差异（P=0.609），NSG（n=9，37.5%）和CG（n=15，62.5%）中男性的比例相似。将人群划分为5年间隔组后的年龄分布显示，这两组人群年龄匹配（P=0.505）。为了阐明人口统计学是否对TL有任何影响，我们对两组患者的性别进行了统计分析。对各年龄组进行单独分析。如所示表二，女性TL比男性长，TL差异为248到474个碱基，TLS差异为195到200个碱基。然而，这些差异并没有达到统计学意义，因为在两种性别之间，整个端粒或短端粒的四分位都没有表现出统计学意义上的差异（P>0.300）。
对两组参与者的TL（整个端粒基因组）和TLS（<20%）进行了评估。NSG和CG之间TL和TLS的差异如所示图2和三根据每个患者的原始数据分别估算TL和TLS的四分位数。与CG相比，NSG组的TL值有统计学显著差异（P<0.05），第1和第2个四分位（中位数）的平均四分位值增加。NSG组的TL测量值比CG组高844和953个碱基。相应地，TLS在第二（中位数）和第三四分位中的值在统计学上显著增加，分别为P=0.044和P=0.033。在第1个四分位比较中发现了差异趋势（P=0.051）。
NSG和CG在TLDP数据生成的列线图中的位置(13)如所示图4显示了TL与年龄的第1、第2（中位数）和第3四分位线，显示了年龄下降。两组的平均年龄（2SD）和TL（2SD。很明显，NSG的平均TL水平高于健康人群的中值线，而CG的平均TL-水平低于健康人群的中线。观察到大约1000个碱基的差异。
此外，如中所示图5，有关详细信息，请参阅表SI，各年龄组TL无显著差异（P>0.500）。TL与年龄的P值在第一个四分位为0.964，中位数为0.908，第三个四分位数为0.537，而TLS与年龄的P-值在第1个四分位元为0.741，中位数是0.826，第3个四分位点是0.912。
对平均TL（或TLS）应用多元线性回归模型，并将其四分位数设置为因变量。解释性变量为NSG、参与者的年龄和性别。每个回归模型的结果如所示图6在NSG中，平均TL（β：918；95%CI:38-1799）、第一四分位TL（beta:889；95%CI:65-1714）、中位数TL（beta:1004；95%CI:125-1883）都有积极影响，但第三四分位TL（beta：953；95%CI:-128-2035）没有积极影响。中位TLS（beta:0.728；95%CI:1-1521）和第三四分位TLS也有积极影响（beta:842；95%CI:45-1639），在平均TLS（P=0.051）和第一四分位TLS（P=0.060）中观察到影响的趋势。此外，图6显示了根据年龄和性别（贝塔系数和95%置信区间）进行调整后，多元线性回归得出的效应（贝塔系数）。
讨论
本研究的结果表明，每日服用NS对端粒的长度有良好的影响，与性别和年龄无关。尽管NS作用的潜在机制尚不清楚，但其对几个关键机制的影响，包括氧化应激和慢性炎症，可能与TL维持有关(46). 事实上，研究表明，牙周炎患者氧化应激和炎症的增加与白细胞TL的降低有关(47)以及帕金森氏病患者(48). 此外，马等据报道，患有中心性肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和抗氧化水平较低的老年人白细胞TL较短；特别是，作者证明，1型和2型糖尿病患者的TL降低与氧化应激增加相关(49). 此外，氧化应激与衰老期间TL缩短有关，一项比较研究得出结论，与相应的荷兰老年男性群体相比，希腊老年男性的氧化应激指数较低，抗氧化水平较高(50). 作者认为，与荷兰人口相比，希腊人的白细胞端粒长度明显更长，因为荷兰人口生活在压力更大的城市环境中，饮食中缺乏抗氧化营养素。事实上，抗氧化剂和抗炎剂已被证明可以降低TL缩短的速度(51). 在之前的研究中，Paul将维生素B和D的可用性与白细胞（LTL）联系起来(52). 此外，在该研究中，血清叶酸及其代谢产物与LTL呈正相关。有人认为，这些营养因子减轻端粒磨损的机制是抗氧化活性、DNA甲基化和防止DNA损伤(53). 此外，研究表明，类胡萝卜素、ω-3-脂肪酸、辅酶Q10、硒和维生素D可以降低端粒缩短率(51). 2013年，Kiecolt-Glaser等研究表明，40-85岁的男性和女性服用包括ω-3脂肪酸在内的补充剂后，氧化应激降低，TL增加(54).
在这项研究中，我们展示了对服用复合维生素补充剂的参与者进行TL评估的结果。本研究的一个优点是TL测量方法。我们使用高灵敏度（Q-FISH）方法测量外周血白细胞的TL，以使用BIOTEL生成TL和TLS（<20%）百分比的数据(15). 我们确定NS的TLS和TL在统计学上显著增加。这是一个非常有趣的发现，因为有证据表明短端粒负载比MTL或端粒酶的表达对细胞内环境稳定更为重要(18,17). 以百分比衡量的短端粒的增加预测了哺乳动物的寿命，并与大多数与年龄相关的疾病相反。虽然白细胞亚群TL的大多数测量都是通过flow-FISH或实时PCR进行的，后者给出了短端粒的平均长度，但Q-FISH提供了单个端粒的中位长度、短端粒百分比的结果，并概述了端粒缩短率和寿命(13).
在这项研究中，我们对两种性别之间的TL和TLS进行了分析，并没有发现男女之间存在统计上的显著差异。这一发现可能归因于该群体规模相对较小。Herrmann之前的研究等这表明女性端粒较长是因为雌激素水平较高，从而增加端粒酶活性并具有抗氧化作用(53).
本研究的局限性包括参与者人数少，以及并非所有影响TL和端粒酶活性的生活方式参数都已确定。考虑到这一局限性，本文提出的NS对TL的影响突出了进一步评估潜在机制的必要性。
总之，在本研究中，我们证明NS可能影响短端粒的长度。短端粒对细胞内稳态至关重要，迄今为止，Q-FISH是评估短端粒分布的唯一可靠方法。因此，本研究证明NS的抗氧化作用与TL维持有关。需要进一步研究NS影响端粒缩短的机制。
补充资料