1.简介
蛋白质磷酸化是最常见和最重要的翻译后修饰（PTM）之一(1,2). 这种可逆机制通过蛋白激酶发生，并由磷酸基团（PO）的添加组成4)各种氨基酸的极性基团R。因此，这种添加将蛋白质从疏水性极性修饰为亲水性极性，使蛋白质在与其他分子相互作用时改变构象。磷酸化氨基酸可以结合能够与其他蛋白质相互作用的分子，从而组装和分离蛋白质复合物(三).
磷酸基团的相互作用能力主要取决于其组分。它的主要元素之一是磷。它有五个外层电子，最多能形成五个共价键，有三个pK一s、 高水溶性，因其多功能性，可形成单、二、三烷基和芳基酯及羟基，也可形成酸酐(4).
特别是，许多细胞磷酸酯类是磷酸蛋白，通过催化酶和三磷酸腺苷（ATP）形成磷酸酐，作为磷酸基团的供体。
良好的能量平衡也有利于磷酸化。事实上，由激酶、磷酸酶、ATP和/或ADP（蛋白质+ATP磷酸蛋白+ADP）介导的磷酸化和去磷酸化事件之间存在恒定的平衡(5,6) (图1).
细胞信号技术PhosphoSitePlus(网址：www.phosphosite.org)和Kinexus PhosphoNET(网址：www.phosphonet.ca)这两个网站都列出了超过20万个已知的人类磷酸化位点，Kinexus网站预测还有76万个可能被磷酸化的额外位点。人类基因组编码的21000个蛋白质中，有三分之二以上被磷酸化，很可能有90%以上的蛋白质受到这种类型的PTM的影响。
三分之一以上的蛋白质磷酸化事件发生在丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）和酪氨酸残基（Tyr或Y）上(哦-磷酸化）(7). 特别是，丝氨酸的磷酸化残基为86.4%，其次是苏氨酸残基11.8%，而酪氨酸残基只有1.8%被磷酸化(8,9). 与其他PTM相比，酪氨酸磷酸化相对较少，并且是表皮生长因子受体（EGFR）家族的典型，EGFR家族拥有一个精确称为酪氨酸激酶的结构域。有时，组氨酸（His或H）和天冬氨酸残基（Asp或D）的磷酸化(N个-磷酸化）也会发生，但在这两种情况下，这种磷酸化不如其他情况稳定。
蛋白质磷酸化是一种调节机制，在大多数细胞过程中都极为重要，如蛋白质合成、细胞分裂、信号转导、细胞生长、，由于特定激酶和磷酸酶引起的磷酸化/去磷酸化事件，许多酶和受体被激活和失活，从而导致发育和衰老(10).
事实上，人类基因组包括大约568个蛋白激酶和156个蛋白磷酸酶，它们调节磷酸化事件，因此在控制增殖、分化和凋亡等生物过程中发挥着重要作用。
例如，p53蛋白被磷酸化激活，然后能够刺激基因转录以抑制细胞周期，激活DNA修复，在某些情况下导致细胞凋亡(13). p53蛋白磷酸化/去磷酸化机制的不平衡会导致蛋白本身的慢性失活，进而将细胞转化为癌细胞。
2.蛋白激酶
蛋白激酶属于激酶大家族，负责磷酸化机制。它们被磷酸化激活，磷酸化反过来激活级联事件，导致不同氨基酸的磷酸化(三). 激酶的激活或失活以不同的方式发生：通过激酶本身与顺式-磷酸化/自身磷酸化，通过与激活蛋白或抑制剂蛋白结合或检查其在细胞中相对于底物的定位(7).
蛋白激酶的催化结构域有2个亚结构域，N端和C端(8). 二者通过肽支架连接，肽支架与前袋（催化残留物）和后袋形成活性部位。进入后口袋是由一个保守的赖氨酸残基和一个残基“看门人”控制的。由于N端和C端子域的推进器向内旋转，催化域在激活时不可用。催化结构域的活化通过活化环的磷酸化或变构机制发生(8). 此外，激酶还具有非催化结构域，允许附着底物和招募其他信号蛋白(9).
高达30%的人类蛋白质可能被激酶活性修饰，已知激酶可以调节大多数细胞途径，尤其是那些参与信号转导的途径(10).
在过去的几年里，激酶被认为不仅在信号传递中起着重要作用，而且在信号转导中也起着重要的作用，控制着信号的振幅(11–13). 为了便于研究磷硅网络，设计了不同的数据库(2,14,15).
518种人类蛋白激酶根据其磷酸化的氨基酸残基进行分类。大多数激酶同时作用于丝氨酸和苏氨酸（丝氨酸/苏氨酸激酶；STKs），其他激酶作用于酪氨酸（酪氨酸激酶；TKs），还有一些激酶作用于所有三种激酶（双特异性激酶；DSKs）(16). 后者可以磷酸化STK和TK(17); 至少125种人类蛋白激酶是STK(18).
STK是磷酸化丝氨酸或苏氨酸的OH基团的酶，并被不同事件激活，如DNA损伤或化学信号介导，例如钙2+/钙调素、环腺苷一磷酸/环鸟苷一磷酸（cAMP/cGMP）和二酰甘油。
蛋白激酶还有以下亚家族：AGC、CaMK、CK1、CMGC、STE、TK和TKL(19–27) (表一).
3.蛋白质磷酸酶
磷酸酶具有与激酶相反的功能。他们通过将磷酸单酯水解为磷酸基团和带有游离羟基的分子，从磷酸蛋白中去除磷酸基团(28,29).
酶去除使蛋白质恢复到非磷酸化状态，其动力学比激酶更快(30). 在实验室中处理蛋白质时，磷酸酶通过变性或抑制剂被灭活，因此样品内部的磷酸化不会丢失(31).
与蛋白激酶相比，蛋白磷酸酶被认为是被动家政酶；它们的不同结构使得它们更难识别，也不如蛋白激酶重要(32).
目前，已知的蛋白质磷酸酶约有226种(33)分为3个家族：磷酸蛋白磷酸酶（PPP）家族、金属依赖性蛋白磷酸酶家族和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族(19).
PPP家族包括PP1、PP2A、PP2B和PP4-7，负责许多脱磷反应(1)而PP2C是PPM家族中最重要的成员之一(34). PPP和PMP基团负责磷酸丝氨酸和磷酸三氮（pSer/pThr）的大多数去磷酸化反应，它们还可以去磷酸化磷酸酪氨酸（pTyr）(35,36). 然而，与pTr相比，pSer/pThr具有不同的结构域序列(37).
相反，属于PTP家族的磷酸酶具有相同的催化结构域，但对磷酸化蛋白的选择性不同(38,39). 在所有磷酸酶中，至少有100种属于酪氨酸残基去磷酸化的磷酸酶，例如酪氨酸特异性磷酸酶亚家族、Cdc25家族、肌管蛋白相关磷酸酶和低分子量酪氨酸磷酸酶(12,14,32,33,39,40). 天冬氨酸磷酸酶，如FCP/SCP（小CTD磷酸酶）(41–43)和TAD（卤酸脱卤酶）家族酶是PTP组的一部分(44).
众所周知，PTP还可以去磷酸化非蛋白靶点，如碳水化合物、mRNA和磷脂酰肌醇(12,45–47).
4.生理条件下蛋白质磷酸化的活性和作用
蛋白质磷酸化是细胞和有机功能协调的初始步骤之一，如新陈代谢、增殖、凋亡、亚细胞运输、炎症和其他重要生理过程的调节。
磷酸化有几种方式发挥作用。首先，磷酸化/去磷酸化的活性起到分子开关的作用(图1).
例如，蛋白激酶B仅在其Ser和Thr残基磷酸化后激活，因此能够调节细胞存活(48); 另一方面，当原癌基因酪氨酸蛋白激酶（c-Src）去磷酸化时，它被关闭，导致细胞生长调节受阻(49).
另一种磷酸化模式是暂时的蛋白质-蛋白质相互作用，它可以调节许多信号通路(50,51). 肾小球足细胞蛋白nephrin 1（Neph1）就是一个例子，它是肾细胞的一种重要蛋白，一旦被Src-Fyn磷酸化，就会与Grb2相互作用，Grb2是一种参与信号转导和细胞通讯的适配蛋白(52).
此外，蛋白质的磷酸化可以调节信号转导过程，因为它能够触发由机制本身磷酸化的蛋白质的亚细胞移位。
此外，死亡相关蛋白（DAP）丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（Ser350）残基的磷酸化导致凋亡诱导激酶2（DRAK2）从细胞质转移到细胞核，DRAK2能够诱导T和B细胞凋亡(53).
另一个例子是突触体相关蛋白25（SNAP25）的膜移位。被磷酸化后，SNAP25与突触结合蛋白1A的结合亲和力降低，从而改变位置(54,55).
此外，磷酸化主要涉及ATP的生成和再循环，因此在需要能量的生物反应中很重要(5,56).
有时，蛋白质磷酸化可能促进第二PTM的形成或去除(4,57) (图1). 一个例子是核糖体蛋白S6激酶β1对胰岛素受体底物-1（IRS-1）的磷酸化，IRS-1是胰岛素信号通路的介质，由于E3连接酶CUL7及其连续的蛋白酶体降解而诱导IRS-1的多泛素化(58).
磷酸化和去磷酸化的过程可能非常复杂，因为单个激酶或磷酸酶可能同时具有更多底物，并可能在各种细胞信号通路中发挥作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK/ERK）是已知的信号通路之一。它通过磷酸化MAPK被激活，MAPK反过来磷酸化许多底物，包括40S核糖体蛋白S6激酶（RSK，然后磷酸化核糖体蛋白质S6）、c-Myc和MNK（然后磷酸化这个级联反应中的CREB）(59,60).
MAPK是一种已知的蛋白质，参与磷酸化事件级联效应激活的信号通路(61). 干扰素-γ（IFN-γ）与其受体的结合诱导Tyr-440受体磷酸化，从而促进与酪氨酸激酶JAK1和JAK2形成复合物。这种复合物磷酸化Stat1，导致其二聚化和核移位，在那里调节基因转录(62–65).
因此，磷酸化噬菌体网络是许多细胞过程的基础。它们主要由蛋白激酶、磷酸酶及其各自底物磷酸结合蛋白组成(66) (图1).
在蛋白质位点的水平上也存在激酶和磷酸酶的竞争机制，以调节常见底物的磷酸化状态(67,68).
PhosphoNET和PhosphoSitePlus网站记录了850多个不同的磷位点对人类蛋白质的抑制或激活，并预测了1000多个额外位点。
因此，习惯上将磷酸化分为两类：一类是指功能变化（稳定），另一类是暂时性的，对调节功能没有影响。因此，人们认为所有稳定的磷位点都是有功能的，而那些不稳定的则不是有功能的(69–71).
此外，蛋白质中磷酸化位点的功能作用是依赖于位点的(72)这意味着它们只有在磷酸化发生在特定位点而非随机时才有功能。这支持了对磷酸化网络的详细研究可能有助于理解生理和病理机制的观点(72–76).
5.蛋白质磷酸化与癌症
磷酸化是最常见的PTM之一，参与调节多种生物过程和激酶过度表达。调节机制的突变或缺陷可导致激酶信号通路的异常激活或失调(77)这是多种肿瘤发生的基础(78–80).
癌症不仅被认为是由基因突变引起的疾病，也是由表观遗传改变引起的疾病(81–83)这主要导致信号转导途径的放松调控，随后正常细胞机制发生变化(84).
许多控制基因表达的关键调节蛋白是激酶的靶点。通过激酶向蛋白质中添加磷酸基团可以改变蛋白质的活性，这种作用通常被用作开关(85,86).
在慢性粒细胞白血病中，发现了一种特殊的染色体易位（费城染色体），该易位可产生一种始终活跃的新型激酶，即视网膜母细胞瘤pRb。通常由该激酶控制的过程被卡在“打开”位置。这导致肿瘤细胞增殖(87).
D.Stehelin是最早了解蛋白激酶直接参与肿瘤的研究人员之一，研究了癌基因v-SRC(88). 这种带有磷酸基团Tyr-527的酪氨酸激酶在肿瘤细胞增殖中起着关键作用，并且已经在Rous肉瘤病毒（RSV）中进行了广泛研究，该病毒是鸡肉瘤的主要病因(89–92). 其致癌作用是由于能够消除酪氨酸残基的分子羧基末端发生突变，从而引起构象变化和不规则的无调节的自身磷酸化，导致生长增加的信号(93,94).
在不同类型的癌症中已经报道了激酶的异常。一个例子是在浸润性乳腺癌的肿瘤细胞中观察到Her2/neu的扩增(95,96).
磷酸化甚至在口腔癌中也起着关键作用。事实上，EGFR的磷酸化(图2)通过CXCL1和CXCR2轴对白细胞介素（IL）-1β的反式激活很重要(97).
磷酸蛋白质组的改变也影响胃肠道间质瘤（GISTs）(98,99)，肺癌(73,100)、血液恶性肿瘤(101,102)，乳腺癌(103,104)，胰腺癌(105,106)和前列腺癌(103,107).
迄今为止，在人类肿瘤中检测到1000多种蛋白激酶的表达变化(108–111). 其中许多激酶现在被认为是癌症生物标记物，例如结肠癌的EGFR、GIST的cKIT和乳腺癌的人类EGFR相关基因（Her2）(112).
在肿瘤中，mTOR(图2)是一种激酶，当被激活时，能够诱导其下游效应器的激活，从而增加细胞周期蛋白的合成，如缺氧诱导因子-1（HIF-1）（细胞周期蛋白D和HIF-1α），后者反过来刺激血管内皮生长因子（VEGF）(113,114). mTOR通过促进血管生成在肾癌中特别活跃(115,116).
Ras癌基因(图2)是人类肿瘤中最常见的(117)其激活非常复杂，以无数磷酸化事件为特征。首先，配体与位于质膜上的受体酪氨酸激酶（RTK）结合。只有当它与另一个RTK二聚体时，该受体才会被激活。然后它们相互磷酸化并被激活。激活的受体与适配器蛋白Grb2的SH2结构域结合，后者在不被磷酸化的情况下发挥作用。事实上，它的SH3结构域与激活SOS的蛋白质结合，没有任何磷酸化反应。SOS随后靠近质膜，在质膜上结合Ras，用GTP取代GDP，然后被激活；因此，SOS充当核苷酸交换因子（GEF）。众所周知，活化的Ras与一种称为c-Raf的蛋白Ser/Thr激酶的N末端结合，激活它们(118).
6.蛋白激酶作为药物靶点
蛋白激酶调节的信号通路参与了几乎所有类型癌症的发病和进展。因此，对激酶介导的信号通路的研究，以及用靶向治疗阻断它们的可能性，可能具有重大的临床治疗效用，尤其是因为许多这些蛋白都是癌基因(78,119,120).
相当大的进展已经导致识别出针对癌症中激活的酪氨酸激酶的抑制剂，其中17种已用于治疗多种癌症，390多种分子正在测试中(121).
伊马替尼（Glivec®)是一种已知的抑制剂，可阻断酪氨酸激酶BCR-Abl在慢性粒细胞白血病（CML）患者中的作用(122,123). 该药物还针对实体肿瘤中的PI3K(124,125)，丝氨酸/苏氨酸激酶BRAF治疗黑色素瘤(126–128)，肺癌的受体酪氨酸激酶EGFR(129,130)，和丝氨酸/苏氨酸激酶mTOR用于治疗肾脏肿瘤(131).
吉非替尼/埃罗替尼（塔尔塞瓦®)针对肺部肿瘤中的EGFR(132)成功率为71.2%(129)而克里佐替尼（Xalkori®)在同一肿瘤中对抗EML4-ALK(133).
Vemurafenib（泽博拉夫®)针对黑色素瘤中BRAF V600E的突变(134)治疗期间成功反应48%(127).
如果过度表达，HER2是一种蛋白酪氨酸激酶，它可以促进癌细胞的增殖，增强血管的形成，从而增加乳腺癌的侵袭性。目前，由于使用曲妥珠单抗（赫赛汀），这种癌症的预后得到改善®)针对这种蛋白质的单克隆抗体(135).
Sorafenib（内沙瓦®)是另一种激酶抑制剂，可阻断Raf激酶在肾脏和肝脏肿瘤中的作用(136).
苏尼替尼（苏能替尼）®)是一种多靶向受体酪氨酸激酶抑制剂，作用于血小板衍生生长因子受体（PDGFR）和血管内皮生长因子受体(137). 同时抑制这些靶点可减少肿瘤血管生成并触发癌细胞凋亡。它被推荐为治疗肾癌和GIST的药物(138,139). 此外，由于舒尼替尼靶向许多不同的受体，它会导致皮肤毒性副作用，如手足综合征(140).
Temsirolimus（托里塞尔®)是一种用于治疗肾细胞癌的药物，是mTOR的特异性抑制剂(141)，一种可能有利于肿瘤生长的细胞激酶。替米罗莫司导致细胞周期阻滞在G1期，并通过减少VEGF的合成抑制肿瘤血管生成(142).
基于激酶抑制剂的治疗的成功取决于不同方面：临床靶向激酶、信号网络的结构以及先天性或后天性耐药的机制。
首先，必须适当选择患者和治疗方法功能(119). 例如，在慢性粒细胞白血病中，这种治疗仅适用于BCR-Abl阳性患者，因为治疗的主要靶点是BCR和Abl（费城染色体基因）通过活化蛋白酪氨酸激酶融合在一起。
同样，在肿瘤中HER2扩增的患者中，赫赛汀的有效率为34%，而在肿瘤中没有扩增HER2的患者中为7%(143).
然而，并不是所有的肿瘤都对激酶抑制剂有反应，通常同一癌症患者对同一治疗的反应不同。因此，应使用生物标记物对患者进行进一步分层(144)并且需要进一步研究信号通路(145–147).
在这方面，我们知道信号通路的变化是由几个因素引起的（遗传和表观遗传突变、微环境的改变），导致癌基因的形成，并且经常会释放肿瘤分子，这些分子可以被追踪并用作生物标记物。例如，黑色素瘤基质细胞中释放的肝细胞生长因子（HGF）影响BRAF抑制剂的作用方式(148).
癌细胞的信号网络也可以产生先天性或后天性耐药性，因为它们能够产生不同于肿瘤的最常见或罕见的致癌突变（所谓的多基因肿瘤生物学）(149).
对基于激酶抑制剂的药物治疗有两种主要的耐药性。当药物靶蛋白因抑制剂结合的空间位阻而发生改变时，就会发生内在或先天抵抗（靶向）(150)、活动场地地形改变(151)，破坏有利的抑制剂相互作用(152)，改变的蛋白质动力学(153)，致癌性增加(151)和ATP亲和力的改变(154). 通过这种方式，这种耐药性不会被药物抑制，并继续在肿瘤细胞中发挥其正常活性。
在外源性或获得性耐药性（非靶向）中，信号网络能够恢复信号网络中致癌突变的功能(155,156)或者通过旁路/补偿信号，甚至通过反馈回路来调整信号。事实上，癌细胞能够利用并重新激活药物将抑制的信号机制(157). 此外，在治疗过程中可能会出现获得性耐药性，肿瘤可能会形成亚克隆，从而导致复发。
因此，需要对肿瘤信号网络进行新的研究，特别是对蛋白激酶药物抑制剂的作用机制进行关注。
7.结论
磷蛋白组学与生物学的许多方面都有着重要的相关性，对于理解分子机制，尤其是导致肿瘤发生和生长的分子机制具有重要作用(77–79). 蛋白激酶作用的信号网络非常复杂，但我们相信了解激酶的调节功能可能是确定更有效的癌症治疗方法的有效手段(146,147). 许多药物激酶抑制剂已经上市(122,133–137)但是，由于复杂的耐药机制的发展，它们的疗效往往会降低(149).
然而，由于蛋白质组学的众多技术，近年来取得了很大进展。蛋白质组学是研究磷蛋白和磷蛋白在肿瘤生物学中的位置和行为的最重要的方法。识别有助于为单个患者选择最合适治疗方法的生物标记物仍然是一项重大挑战(144).