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介绍

最近，许多研究集中于调查非编码RNA（ncRNAs）的作用翻译成蛋白质。不只是ncRNAs的功能部分理解，但临床或生物学意义大多数ncRNAs尚未确定。在ncRNAs中，long由200多个碱基组成的ncRNAs已被报告给与DNA结合蛋白结合，如染色质修饰复合物和某些非编码RNA可以表观遗传地调节通过这种机制表达多个基因(1–三).

Hox转录物反义基因间RNA(HOTAIR公司)是一个长的ncRNA，从一个自定义的HOXC位点的倾斜阵列（12q13.13）(4).HOTAIR公司用多梳抑制复合物2（PRC2），由EZH2、SUZ12和EED在赖氨酸27（H3K27me3）处转化为三甲基组蛋白H3，从而抑制HOXD公司基因表达。因此，HOTAIR公司表观遗传学调控HOXD公司，一个基因位于单独的染色体上。最近的研究表明的临床意义HOTAIR公司在外科实体中恶性肿瘤。古普塔等发现高HOTAIR公司原发性病变中的表达预后较差与低转移生存率患者相比，无转移生存率和总生存率HOTAIR公司乳腺癌中的表达(4). 此外，我们报告了临床的重要性HOTAIR公司晚期结直肠癌患者癌症（CRC），其中HOTAIR公司在癌组织比非癌组织(5). 高HOTAIR公司表达与肝转移的存在密切相关与较差的预后显著相关。此外，我们发现HOTAIR公司表达式与PRC2（SUZ12、EZH2和H3K27me3）的全基因组重编程利用飞行员cDNA阵列数据进行基因集富集分析研究(5). 自HOTAIR公司在乳腺和结肠中的表达具有临床意义癌症，我们预计这种ncRNA也可能发挥重要作用在其他顽固性恶性肿瘤中。

肝细胞癌（HCC）是世界上常见的癌症。在日本，肝癌是一种难治性肿瘤，每年造成约30000人死亡男性恶性肿瘤死亡的第三大原因，以及女性恶性肿瘤死亡的第五大原因(6,7). HCC的主要病因是病毒感染、酗酒和吸烟。虽然已经做出了努力确定肝癌的适当预后标志物(8–12),包括原发肿瘤大小、AFP水平升高和基因原发肿瘤中的表达标记，这些方法没有已证明足以预测所有HCC患者的预后。在此外，很少有研究描述ncRNAs的表达及其肝癌的临床意义已经发表。目前研究中，我们确定了HOTAIR公司HCC患者中的表达，并调查是否HOTAIR公司是HCC患者有用的预后指标。

材料和方法

临床组织样本

共有64名肝癌患者接受了本研究纳入了Beppu医院的手术。被切除的立即冷冻肿瘤和配对非肿瘤组织标本在液氮中，并保持在−80<C，直到分析。冻结组织标本在硫氰酸胍中匀浆通过铯超速离心获得总RNA氯化物缓冲。获得了所有人的书面知情同意患者。所有患者术后均在定期间隔一个月。

RNA制备，逆转录和定量实时PCR

冷冻HCC样品（n=64）的总RNA为使用Isogen（日本基因有限公司）提取制造商的协议。如前所述样品由8.0μg总RNA合成(13).HOTAIR公司水平被量化使用LightCycler 480 Probes Master套件（罗氏应用科学）遵循制造商的协议，具体如下HOTAIR公司引物：（正向，5′-CAGTGGGGAACTCTGCG-3′和背面，5′-GTGCCTGCTCTTACC-3′）。HOTAIR公司级别为归一化为GAPDH（正向，5′-GTCACGGATTGG TCTGTATT-3′和反向，5′-AGTCTCTGGGGGCAGT GAT-3′）。

细胞系

提供了人肝癌细胞HepG2生物医药研究所细胞资源中心发展、衰老与癌症，日本东北大学。所有单元格线路保持在Dulbecco改良的Eagle’s介质（DMEM）中补充10%胎牛血清和抗生素。我们培养了将电池置于37°C、5%CO的增湿大气中2和95%的空气。

HOTIAR表达慢病毒载体

要生成HOTAIR公司表达慢病毒载体，我们扩增了全长人类HOTAIR公司通过PCR使用MCF7 cDNA。通过瞬时转染具有pCMV-VSV-G-RSV-Rev、pCAG-HIVgp和CSII-CMV公司-HOTAIR公司或CSII-CMV-MCS（空）质粒DNA(5′-Xho公司I和3′-不是I部位）使用Lipofectamine 2000（Invitrogen），遵循制造商的协议。四十八共转染数小时后，含慢病毒的上清液收集并通过0.45-μm过滤器。滴度过滤上清液中的慢病毒载体通过用ELISA法测定HIV p24 gag抗原的浓度工具包（Perkin-Elmer生命科学）。

细胞增殖试验

细胞增殖通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）化验。简而言之，我们将感染了人类HOTAIR公司全长慢病毒载体或空载体慢病毒载体，在96周的组织培养板中，密度为5.0×10三每个孔的细胞数。在不同的时间点（24，电镀后72小时和120小时，代表0小时、48小时和96小时时间点），10μl MTT（磷酸盐缓冲液中5 mg/ml将盐）添加到每个孔中，培养板37°C下额外4小时。当时的彩色formazan产品溶于100μl二甲基亚砜中。然后我们评估线粒体活性，通过测量光学使用微孔板在570–650nm测试波长下的密度阅读器（日本Bio-Rad）；结果表示为最佳密度每毫克蛋白质（OD/mg蛋白质）。

统计分析

两组之间差异的重要性使用Student t检验和χ估计2测试。根据Kaplan-Meier方法，采用对数库检验进行比较。通过单变量分析，p值<0.05的变量为在随后的基于Cox的多元分析中使用比例风险模型。考虑了所有差异当p<0.05时具有统计学意义。统计分析如下使用JMP 5软件（SAS Institute）进行。

基因集富集分析GEO数据库中的HCC

对于GSEA(14)，我们在GEO数据库中使用GSE27462；这是RNA的数据集用基因组拼接阵列收集10例肝癌的表达谱样品(15).HOTAIR公司表达式被视为分为低或中位数高表达。对于功能基因集GSEA，我们使用H3K27me3全球占有率产生的基因集，和EZH2，一种由HOTAIR公司过度表达MDA-MB-231乳腺癌细胞(4).作为GSEA中基因排序的指标高低样本均值HOTAIR公司表达式是使用，其他参数设置为默认值。

结果

我们首先评估了HOTAIR在原代实时定量PCR检测肝癌患者肿瘤（n=64）。发件人根据这些数据，我们将64例HCC患者分为HOTAIR公司高表达组（n=13）和低表达组组（n=51）(图1A). 在考虑到临床应用，我们将截止值设置为正常样本的上限，我们发现HOTAIR公司/HCC样本中GAPDH比率为0.027。患有以下疾病的患者高的HOTAIR公司表达预后明显较差总生存率和明显较大的肿瘤尺寸比低HOTAIR公司表达（p<0.01）(图1B). 临床病理学组间因素分析(表一)，在其他临床病理因素或无复发生存率在高表达组和低表达组之间发现如图所示）。

图1 （A） 定量实时PCR64例肝癌组织HOTAIR分析及分型基于HOTAIR水平（HOTAIR/GAPDH为0.0027）。垂直线表示HOTAIR高压的边界线（n=13）或低表达（n=51）。（B） 肝癌的Kaplan-Meier生存曲线HOTAIR高表达患者（n=13）和低表达（n=51）。HOTAIR表达组有生存率较差（p<0.01，Wilcoxon和log-rank检验）。

表一 HOTAIR表达式和肝癌患者的临床病理特征。

表一

HOTAIR表达式和肝癌患者的临床病理特征。

特征	HOTAIR公司高的表达式（n=13）	HOTAIR公司低的表达式（n=51）	p值
年龄（年）	61.3±2.8	67.2±1.4	0.06
性别
男性	9 (69.2%)	34 (66.7%)	0.86
女性	4 (30.8%)	17人（33.3%）
病毒
乙型肝炎病毒（+）	4 (30.8%)	9 (17.7%)	0.38
丙型肝炎病毒（+）	9 (69.2%)	38 (74.5%)
非B类、非C类	0 (0.0%)	4 (7.8%)
Child Pugh犬
A类	11 (84.6%)	44 (86.2%)	0.88
B	2 (15.4%)	6 (11.8%)
C	0 (0.0%)	1 (2.0%)
肿瘤大小（厘米）	5.7±0.8	3.2±0.4	0.009一
fc（财务总监）
(+)	4 (30.8%)	15 (29.4%)	0.92
(−)	9 (69.2%)	36 (70.6%)
fc-inf型
(+)	7 (53.9%)	22 (43.1%)	0.49
(−)	6人（46.1%）	29 (56.9%)
副总裁
0	5 (38.5%)	24 (47.1%)	0.61
1	7 (53.9%)	20 (39.2%)
2	1 (7.6%)	7人（13.7%）
vv（可变电压）
0	12 (92.3%)	49 (96.1%)	0.59
1	1 (7.7%)	2 (3.9%)
b条
0	13 (100%)	50 (98.0%)	0.61
1	0 (0%)	1 (2.0%)
感应电动机
0	12 (92.3%)	45 (88.2%)	0.85
1	1（7.7%）	5 (9.8%)
2	0 (0.0%)	1 (2.0%)
肿瘤编号
单个	9 (69.2%)	36 (70.6%)	0.92
多个	4 (30.8%)	15 (29.4%)

{需要标签（或@符号）对于fn[@id='tfn1-or-29-03-0946']}临床病理数据分类依据为HOTAIR公司高表达或HOTAIR公司低表达。64例肝癌患者的标本用于研究。肝细胞癌；乙肝病毒，乙型肝炎表面抗原；丙型肝炎病毒；fc，胶囊形成；vp，侵犯门静脉；vv，显微镜下肝脏静脉侵犯；b、 胆管侵犯；im，肝内转移。

a统计上的显著差异。

随后，我们检查了HOTAIR是否HepG2细胞中的过度表达使用MTT分析。虽然我们观察到正常HepG2细胞（对照）和HepG2-细胞过度表达HOTAIR公司，有一种趋势是HOTAIR公司-表达HepG2细胞比对照HepG2细胞（p=0.10）(图。2).

图2 HepG2细胞系的MTT分析，HOTAIR表达组和对照组。这个数字是使用每个数据值与0小时平均值的比值绘制OD/mg蛋白质。HOTAIR诱导的群体趋于增长比对照组更快，但没有显著性差异两组之间的差异（p=0.09）。

接下来我们调查了HOTAIR公司HOTAIR诱导后的表达和基因签名H3K27me3和EZH2使用GSEA。根据以下结果GSEA，两者之间没有显著相关性HOTAIR公司肝癌的表达水平和特征信号的表达水平H3K27me3和EZH2占用导致(图3). 这些结果表明HOTAIR公司肝癌中的表达可能不会诱导全基因组PRC2的重定位，与乳腺和结肠直肠中的不同癌症。

图3 基因表达富集图HOTAIR引发的EZH2和H3K27me3占用签名根据样本均值之间的差异进行排序GSE27462中HOTAIR高表达和低表达。这个上图中的纵轴表示浓缩分数（ES）每个基因集中的基因。条形码图指示基因在每个基因集中的位置；红色和蓝色表示与HOTAIR表达式。中的垂直轴下部图形表示排名列表指标。HOTAIR表达式HCC中的水平没有针对这些基因集进行富集，因为HOTIAR过表达诱导H3K27的定位，以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中的PRC2亚单位EZH2。

讨论

在本研究中，我们发现HOTAIR公司肝癌原发肿瘤中的表达与预后不良。至于临床病理因素两者之间的显著关联HOTAIR公司表达与肿瘤大小。此外，我们发现人类HOTAIR公司在肝癌细胞中导致更多与对照细胞相比增殖迅速。我们推测那个HOTAIR公司可能促进细胞生长，解释了两者之间的显著关联HOTAIR公司表达与肿瘤肝癌的大小，导致肝癌患者预后较差高的HOTAIR公司表达式。

最近，研究人员一直在寻找新的预测肿瘤复发的生物标志物接受肝移植(16). 在本研究中，我们表明高的HOTAIR公司原发性肝癌中的表达可能是有用的肝癌复发的预测标志物，因为肝癌病例可以明确分为高表达组和低表达组。

在之前的研究中，包括我们的研究，HOTAIR公司表达被证明与多个基因相互作用带PRC2(5)，建议重要角色HOTAIR公司肿瘤生长和致瘤性乳腺癌和结直肠癌。此外，杨等报告称长ncRNAs，包括HOTAIR公司，表示为在HCC肿瘤中处于高水平体内(15).HOTAIR公司和其他长ncRNA，例如XIST和其他未识别的ncRNAs可能发挥重要作用与PRC2和组蛋白协同在肿瘤生长中的作用肝癌中的修饰基因(17–19).然而，在本研究中，GSEA结果表明H3K27me3和EZH2（PRC2）诱导的表达谱元素，与HOTAIR公司在肝癌中表达。因此，该ncRNA可能与其他HCC中的分子或不同途径，而不是功能性的PRC2复合蛋白，需要进一步研究充分阐明了这些机制。

总之，某些肝癌患者表现出长非编码RNAHOTAIR公司和肝癌患者HOTAIR公司与低表达患者相比，表达患者的预后较差HOTAIR公司表达式。HOTAIR公司原发性肝癌中的表达肿瘤可能是肝癌的预后标志物；然而，临床的重要性HOTAIR公司肝癌中的表达似乎较少比乳腺癌和结直肠癌更重要，包括组织学分级、肿瘤深度和淋巴结等参数转移。我们的数据表明需要进一步研究支持使用非编码RNA作为穷人的新临床指标肝癌的预后。

致谢

作者感谢T.Shimooka和M.Kasagi他们的技术援助和H.Miyoshi（RIKEN BioResource）中心）提供慢病毒载体质粒DNA。本研究获得了以下赠款和基金会的部分支持：CREST，日本科学技术署（JST）；日本协会科学促进拨款研究（批准号：20390360、20591547、20790960、21591644、，21791295、21791297、215921014和21679006）；资助计划面向下一代世界领先研究人员（LS094）；NEDO（新能源和工业技术发展组织）染色体分析技术的发展；和补助金来自东京生物化学研究基金会。

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