本文中提到：

介绍

牙周病是一种传染性细菌牙周支持组织中发生的疾病，可能导致牙周组织的持续和不可逆破坏支撑组织，导致牙齿脱落，严重影响生活质量(1). 也，牙周炎会导致牙槽骨破坏牙周韧带，与多种类型的系统性疾病(2)，例如糖尿病、心脏病和骨质疏松症。然而牙周炎仍然主要是基于机械去除牙菌斑和牙石等牙周致病因素，需要终身牙周维护治疗。治疗牙周炎和修复吸收的牙周组织重大挑战(3).

药物通常用于辅助治疗牙周炎(4)补充牙周炎的非手术治疗。最常用的抗生素，如甲硝唑、米诺环素和强力霉素，可以局部进入粘膜(5).这些药物用于牙周袋，以抑制或消除牙周病病原微生物及其调控组织的炎症反应。然而，抗生素的使用可能导致免疫紊乱，或诱导细菌产生药物这些不利影响限制了抗生素在牙周炎治疗中的应用(6). 中医已经显示牙周炎治疗的潜力(7). Oroxylin A是一种类黄酮化合物从根分离黄芩。一个数字的研究证实了牛氧基蛋白A具有抗氧化剂，抗炎和抗肿瘤活性(8–10)在在抗炎作用方面，Oroxylin A被证明抑制炎性细胞因子的分泌(11)，但分子机制是不清楚的。

血红素加氧酶-1（HO-1）是一种关键的细胞保护酶酶。许多研究已经证实HO-1为炎症消退的调节作用多种药物潜在的治疗靶点抗炎作用(12–14).研究证实HO-1在牙周炎的发生发展及其调节某些细胞因子，如环氧合酶（COX）-2和TNF-α影响牙周炎的进程(15,16).据我们所知，还没有报道称Oroxylin A通过HO-1影响炎症。因此，它是假设Oroxylin A可能降低COX-2的表达和TNF-α通过调节HO-1，从而减轻牙周局部炎症，同时下调RANKL：骨保护素（OPG）比率，从而抑制吸收牙槽骨。

材料和方法

材料

青霉素/链霉素，最低必需培养基-α，胰蛋白酶和胎牛血清由生物公司提供工业。购买了脂多糖（LPS）和Oroxylin A来自北京太阳生物科技有限公司RNAiso此外，TB Green™Premix Ex Taq™II和PrimeScript™RT试剂盒gDNA橡皮擦由Takara Bio，Inc.提供。PCR引物为购自Sangon Biotech Co.，Ltd。

动物和治疗

8周龄雄性Wistar大鼠体重250-300克从Charles River Laboratories，Inc.购买，共30个老鼠被关在青岛大学附属医院25°C、40%湿度和12小时光/暗循环。这些动物可以自由获取食物水。牙周炎是由在牙龈周围系上丝绸结扎物引起的上颌第二磨牙和高糖饮食描述(17).

大鼠被随机分为以下组（n=10/组）：假手术（PBS，无牙周炎，无丝绸结扎）、牙周炎（PBS+丝线结扎）和治疗组（蚕丝结扎+Oroxylin A）。全身麻醉是由腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg，2%）。牙周炎是通过将丝线放在右上颌第一和第二磨牙。治疗中的大鼠组注射8µl Oroxylin A溶液每48小时在牙龈部位的浓度为0.5µg/µl，持续2小时周，而假手术组和牙周炎组注入相同体积的PBS溶液。总共4周随后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（200mg/kg），然后快速断头；死亡经呼吸和心跳丧失证实。这个收集牙龈组织以提取总RNA和总RNA检测COX-2、TNF-α、RANKL和制作OPG和石蜡切片。所有动物研究经附属研究伦理委员会批准青岛大学医院（中国青岛，AHQU-MAL20210326）。用免疫组织化学方法观察COX-2的表达水平。牙龈组织标本采用福尔马林固定室温下石蜡包埋（固定剂浓度，4%；持续时间12小时）。使用免疫组织化学。通过加热进行抗原提取在97°C下对试样进行清洗，然后用二甲苯清洗并逐渐用下降的乙醇系列进行复水。分区被阻止在室温下用牛血清白蛋白（BSA，3%）浸泡30分钟温度。免疫组织化学切片孵育在3%H（H）2O（运行）2在甲醇中放置30分钟以堵塞内源性过氧化物酶活性。抗COX-2的一级抗体（1:1000，Abcam，ab151571）在37°C下孵育1小时小鼠IgG与辣根过氧化物酶结合（1:1000，Abcam，ab6789）用作二级抗体，在37°C持续30分钟。使用DAB进行1次色原检测室温下的最小值。添加足量苏木精将组织切片溶液完全覆盖并培养室温下1分钟。图像以40倍放大率采集使用光学显微镜（奥林巴斯，BX43）。Image-Pro Plus版本6.0软件（Media Cybernetics，Inc.，USA）用于分析。

分离、培养和鉴定原代大鼠牙龈成纤维细胞（RGFs）

麻醉后，大鼠牙龈组织取自Wistar大鼠附着的牙龈被切成碎片在含有10%的完整最低必需培养基-α中培养胎牛血清和1%青霉素/链霉素，湿化5%CO培养箱237°C时(18). 当细胞从牙龈组织边缘，融合率达到80%，细胞消化、离心并传代。第三至第五通道将细胞用于随后的分析。RGF由抗波形蛋白、抗纤维连接蛋白、，对照组抗细胞角蛋白抗体和PBS(19). 细胞被分成以下组：对照组（PBS）、LPS（10 pg/ml）和50、100、200和400µg/ml牛氧基蛋白A+LPS（10 pg/ml）。所有治疗均为在37°C下进行24小时。细胞在4°C下用福尔马林固定（固定剂浓度4%；20分钟），用正常山羊阻断血清（10%，Absin）在37°C下放置1小时。细胞与主要抗体如下：抗病毒素（1:1000，Abcam，ab8978）；抗纤维连接蛋白（1:1000，Abcam，ab2413），抗细胞角蛋白（1:1000，Abcam，ab53280）在37°C下放置2小时。山羊与辣根过氧化物酶（1:1000，Abcam，ab6789）用作孵育的二级抗体在室温下放置2h。细胞核用DAPI公司。用荧光显微镜（Keyence，BZ-X800）。Image-Pro Plus 6.0版软件（媒体控制论，Inc.）用于分析。

细胞转染

用小干扰（si）RNA转染RGF（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.），37°C。使用的序列如下：大鼠HO-1正向，5′-ACAGAGAACCAGUCUA-3′和反向，5′-UAGACUGGUUCUGCUUGU-3′和阴性对照（NC）正向，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反向，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。RGF（5×105电池/孔）使用RNAimax转染系统（Invitrogen；Thermo FisherScientific公司）。转染36小时后，细胞在黄芩苷（50µM；37°C，5%一氧化碳2)12小时（PCR）或24小时（西部吸墨剂）(20).

细胞计数试剂盒-8（CCK8）分析

用CCK8（Abcam）分析细胞活力根据制造商的协议，细胞被播种并以5×10的密度培养3h3/100µl中的微孔将培养基放入96个微孔板中（37°C）。然后，对细胞进行处理在37°C下用Oroxylin A处理24小时。将10µl CCK-8试剂添加到每个孔，然后在37°C下培养2小时。所有实验均为一式三份。在450 nm处分析吸光度使用微孔板阅读器。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）

TRIzol（Thermo Fisher Scientific，Inc.）用于从RGF中分离总RNA。然后使用RT-qPCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq II，DRR820A，Takara）温度和持续时间取决于制造商协议。用光将RNA反转录成cDNACycler LC480（罗氏诊断）。循环条件包括初始培养，然后40个变性周期，退火和延伸。qPCR的热循环条件步骤如下：活化（温度：50°C；持续时间：2分钟），双锁DNA聚合酶（温度：95°C；持续时间：2min），变性（温度：95°C；持续时间：15秒），以及退火/延伸（温度：60°C；持续时间：1分钟）。mRNA表达水平归一化为GAPDH水平家政基因。使用2-ΔΔCq方法来确定目的基因的表达。所用引物如下：GAPDH正向，5′-ACCACAGTCACATGCACATGCAAC-3′和反向，5′-TCCCACCCCTGTTGCTGTA-3′；TNF-α（GenBank:NM_013091.2）向前，5′-ATGGGCTCCCTCATCAGT-3′和背面，5′-AAATGGCAAATCGGCTGACG-3′；COX-2（GenBank:NM_017232.4）正向，5′-CTCAGCCATGCAATCC-3′反向为5′-GGGTGGGCTTCAGCAGTAAT-3′；RANKL（GenBank:NM_057149.2）正向，5′-CCTGTTCGAGCGCAGA-3′和反向，5′-AGTCGAGCCTGCAAACCTG-3′；OPG（GenBank:NM_012870.2）正向，5′-GAATGTGAGGAGAGGGCGCTA-3′和背面，5′-CTTCGCAGAGGTGACAT-3′和HO-1（GenBank:NM_012580.2）正向，5′-ATGCCCCCACTCTCTCT-3′和背面为5′-TGTTGGCTGGTGTAAGG-3′。

蛋白质印迹

TRIzol（Thermo Fisher Scientific，Inc.）用于从RGF中分离总蛋白。蛋白质浓度为通过BCA分析估计。每条车道装载30µg总蛋白。使用12%的分离凝胶和5%的堆积凝胶。蛋白质是转移到PVDF膜上。膜被5%堵塞脱脂牛奶在室温下进行western blot前1.5小时分析。在4°C下用一级抗体培养斑点隔夜，然后在房间内进行二次抗体治疗2小时温度。抗COX−2的一级抗体（ab15191，1:1000），TNF-α（ab9579,1:1000），OPG（ab73400，1:1000），RANKL（ab93719，1:1000）和HO-1（ab13248，1:1000）均购自Abcam。兔辣根过氧化物酶二级抗体IgG（7074，1:1000）和抗β-肌动蛋白来自细胞信号技术。最后，通过ECL（Abcam，ab133406），并使用GraphPad Prism（版本8；Dotmatics）和ImageJ 2（美国国立卫生研究院）。

统计分析

使用GraphPad进行统计分析棱镜（版本8；点式）。数据以平均值±标准值表示三个独立实验重复的偏差。单向采用Tukey的事后检验进行方差分析比较各组。P<0.05表示具有统计学显著性差异。

结果

分离、培养和鉴定RGF的

培养3-7天后，牙周组织组织碎片粘附在壁上，一些细胞从组织碎片边缘(图。第1页). 培养2-3周后，细胞向组织碎片的中心，在那里形成漩涡图案。单元格形态主要为纺锤形，细胞核聚集在中心和细胞质辐射形成的突起向外。3-4周后，细胞融合率达到80%(图1B).

图1。 原代培养和鉴定大鼠牙龈成纤维细胞。（A） 传代细胞培养7天，牙周组织碎片粘附在牙周壁和一些细胞上从组织碎片的边缘长出来。（B） 的图像传代细胞培养3周。细胞迅速向组织碎片的中心，在那里形成漩涡图案。抗波形蛋白染色，（C）抗纤连蛋白染色，（D）细胞角蛋白抗体和（E）对照组（F）身份识别。

免疫荧光结果呈阳性纤维连接蛋白和波形蛋白抗体的表达(图1C和D)，while否定表达式角蛋白抗体(图1E).图1F显示阴性对照，一级抗体被PBS取代，没有任何抗体表达式。纤维连接蛋白阳性表达和波形蛋白抗体，角蛋白阴性表达抗体显示牙周膜干细胞来源于来自间质。

Oroxylin A对RGF的炎症和破骨因子

CCK-8初步结果显示，Oroxylin A（50、100、200M、400M）无细胞毒性(图S1). RT-qPCR显示空白对照组COX-2、TNF-αmRNA表达水平LPS刺激组的RANKL随着剂量的增加而降低Oroxylin A浓度(图。2A-C型). LPS炎性刺激不显著增加OPG的表达，然而，预处理Oroxylin A增加LPS刺激的OPG mRNA的表达Oroxylin A中的RGF呈剂量依赖性(图2D). RANKL/OPG比率为LPS组显著增加，并呈下降趋势随着Oroxylin A剂量的增加趋势(图2E).

图2。 RGF被LPS感染并接受治疗（A）COX-2、TNF-α、（B）RANKL、（C）mRNA水平反向分析OPG和（D）RANKL/OPG（E）转录定量聚合酶链反应。（F） 蛋白质western分析COX-2、TNF-α、RANKL和OPG水平吸墨纸。COX-2、（G）TNF-α、（H）RANKL、（I）OPG和（J）水平对照组、LPS组和不同组之间的RANKL/OPG（K）Oroxylin A组的浓度。细胞因子的mRNA水平未经治疗的对照组设为1.0。污渍被剥去以β-肌动蛋白作为负荷控制进行再灌注。条形图显示级别细胞因子的平均值为±SD（n=3）*与对照组相比，P<0.05。RGF，大鼠牙龈成纤维细胞；脂多糖；环氧合酶；OPG，护骨素。

Western blotting显示LPS可以显著地诱导COX-2、TNF-α和RANKL的蛋白表达水平Oroxylin A可以下调其在集中相关方式(图。2英尺-I英寸). Oroxylin A可以诱导OPG蛋白表达浓度依赖方式(图。2J型)而LPS刺激增加了RANKL/OPG比率并随着Oroxylin A剂量的增加而减少(图2K).

HO-1表达的调节Oroxylin A的非炎症性和炎症性RGF

RT-qPCR结果显示HO-1的表达Oroxylin A治疗后，正常RGF中的mRNA增加增加的程度与Oroxylin A浓度(图。3A级). HO-1的蛋白表达随着Oroxylin A治疗(图3B).在Oroxylin A治疗后，HO-1的表达增加剂量依赖性方式(图。3C公司)

图3。 HO-1的mRNA和蛋白水平Oroxylin A处理的RGF的（A）mRNA和蛋白质水平用Oroxylin A处理的RGF中的HO-1。（C）HO-1水平介于对照组和Oroxylin A组。（D） HO-1 mRNA水平经LPS和Oroxylin A处理的RGF。（E）用脂多糖和牛磺酸A处理的RGF。（F）HO-1水平介于对照组、脂多糖组和牛磺酸A组。RGF，大鼠牙龈成纤维细胞；脂多糖；血红素加氧酶*P<0.05与控制相比。

LPS诱导后，mRNA和蛋白RGF中HO-1的表达显著高于空白对照组无炎症诱导，HO-1为随着Oroxylin A浓度的增加而上调(图3D-F).

siRNA的转染效率和RGF中HO-1基因敲除的影响

RGF转染后荧光标记siRNA，外周细胞显示高亮度显微镜下(图4A). 这个荧光显微镜结果显示，荧光均匀分布在细胞中(图。4B类). RT-qPCR和western blotting结果均不显著HO-1 mRNA和蛋白表达水平的差异加扰组和控制组(图4C-E).

图4。 转染效率。（A）外周细胞在显微镜。（B） 荧光在细胞中分布均匀。（C） 反向分析HO-1 mRNA的mRNA水平转录定量PCR。（D） HO-1的蛋白质水平为通过蛋白质印迹分析。（E） 控制之间的HO-1水平组、干扰siRNA组、LPS组和不同浓度Oroxylin A组。血红素加氧酶*P<0.05与。控件。

HO-1后LPS炎症诱导RGF基因沉默，RT-qPCR和WB显示mRNA和蛋白COX-2、TNF-α和RANKL的表达显著增加，OPG组无统计学差异(图5A-K). mRNA和蛋白质表达COX-2、TNF-α、RANKL和OPG以及RANKL/OPG水平不同浓度对比率没有显著影响Oroxylin A的(图5A-K).

图5。 RGF（HO-1−）感染LPS处理并用奥罗木素A处理。COX-2，（A）的mRNA水平TNF-α，（B）RANKL，（C）OPG（D）和RANKL/OPG（E）通过逆转录定量PCR。（F） 蛋白质水平western blotting分析COX-2、TNF-α、RANKL和OPG。COX-2、（G）TNF-α、（H）RANKL、（I）OPG和（J）RANKL/OPG水平（K） 对照组、干扰siRNA组、LPS组和不同浓度的Oroxylin A组。mRNA水平未治疗对照组的细胞因子设为1.0。这些斑点是以β-肌动蛋白作为负荷控制物进行剥离和再增殖。*与对照组相比，P<0.05。RGF，大鼠牙龈成纤维细胞；HO，血红素加氧酶；环氧合酶；OPG，骨保护素；LPS、，脂多糖；si，小干扰。

Oroxylin A在大鼠脑缺血模型中的作用牙周炎

免疫组织化学结果显示COX-2为在大鼠牙周膜中表达及阳性细胞呈黄褐色。COX-2的表达+细胞各组间差异显著。COX-2的表达在对照组和Oroxylin A的牙周组织中治疗组明显低于牙周炎组(图6A-F)COX-2、TNF-α和RANKL/OPG比值在Oroxylin A治疗组的牙周组织轻微高于对照组，但表达水平下降随着剂量的增加(图。6克/升).

图6。 免疫组织化学表达COX-2与COX-2、TNF-α和RANKL/OPG蛋白表达对照组、结扎组和Oroxylin A的比率治疗组。表达的免疫组织化学结果对照组COX-2，（A）对照组，（B）帕金森病组，（C）PD组为（D），PD+Oroxylin A组为（E）组（F）。（G） COX-2、OPG、RANKL和TNF-α的蛋白水平牙龈。COX-2、（H）TNF-α、（I）RANKL（J）、OPG和（K）水平三组PBS之间的RANKL/OPG（L），结扎+PBS，结扎+PBS+Oroxylin A.环氧合酶；OPG，护骨素。*与对照组相比，P<0.05。

讨论

中药及其提取物牙周炎治疗的潜力(21). Oroxylin A是主要活性成分成分黄芩，具有消炎作用，抗肿瘤、抗氧化、血管保护等药理作用(22,23).由于这些特性，Oroxylin A提供了一种很有前途的牙周炎的治疗方法。电流的用途这项研究是为了研究牛蒡苷A的抗炎作用LPS刺激RGF及其潜在分子机制。在初步实验，在体外CCK-8分析用于检测Oroxylin A对RGF的细胞毒性作用；没有0-400处理的成纤维细胞之间的显著差异µmol/l Oroxylin A和正常成纤维细胞。这些结果表明Oroxylin A对RGF的毒性较低，有可能用于牙周组织局部。

鉴定成纤维细胞常用的技术包括形态学观察、免疫细胞化学染色、，生物特性评价和分子生物学检测(24,25). 形态学观察通过显微镜提供了对细胞形状和结构但缺乏特异性。免疫细胞化学染色法针对特定成纤维细胞标记物的抗体，如胶原蛋白或α-平滑肌肌动蛋白可提供更高的特异性，但可能具有抗体特异性和潜力的局限性交叉反应性。生物特性评估，例如分析细胞对培养基的依赖性、增殖率和细胞周期进展，可以提供对成纤维细胞行为。同样，分子生物学技术因为RT-qPCR或western blotting可以确认成纤维细胞特异性基因，提供分子水平的验证(26).

前列腺素由花生四烯酸合成通过COX(27). 最丰富的体内前列腺素为TNF-α；COX-2似乎是主要的控制炎症反应中TNF-α合成的COX(28). 研究数量有证明COX-2和TNF-α在牙周炎的发生和发展与牙周组织损伤，导致牙龈炎症和牙槽骨吸收(29–31).因此，在本研究中，COX-2和TNF-α被选为检测Oroxylin A对这些细胞因子的影响。根据RT-qPCR和western blotting结果显示，牛蒡苷A可以抑制LPS诱导的RGF中COX-2和TNF-α的产生表明Oroxylin A可能在调节免疫反应中起作用与牙周疾病有关。

RANKL是破骨细胞的主要调节器分化和功能，在破骨细胞形成(32,33). OPG是RANKL的诱饵受体，是一种在骨骼中起核心作用的关键骨骼保护因子体内平衡(34). 大量的研究证实了RANKL的上调OPG的下调或降解与牙周骨，RANKL/OPG比率反映了骨吸收(32,35,36).本研究表明，Oroxylin A调节RANKL/OPGmRNA和蛋白质水平的比值，并参与牙周炎的成骨修复过程。Oroxylin A罐减轻炎症对牙周炎疗效的影响促进成骨。

骨中HO-1表达上调可能是一种重要的抗氧化防御机制(37,38).本研究表明，HO-1随着Oroxylin A剂量的增加而增加。因此，假设Oroxylin A具有成骨作用通过上调HO-1。HO-1的表达被抑制，mRNA和检测COX-2、TNF-α、RANKL和OPG蛋白水平。Oroxylin A没有降低这些细胞因子的表达LPS刺激上调。这表明Oroxylin A依赖HO-1发挥作用并下调LPS刺激RGF中的炎症因子。

Rankl调节破骨细胞，在骨代谢(39). 给，一只老鼠建立结扎诱导牙周炎模型Oroxylin A用于干预。Oroxylin A可以保护COX-2和TNF-α对牙周组织的损伤RANKL/OPG比值。结扎促进斑块形成堆积，导致牙周炎的发病机制类似对人类牙周炎(40).免疫组织化学显示Oroxylin A降低了大鼠牙周炎中COX-2的表达。Western blotting显示COX-2、TNF-α和RANKL/OPG比值在牙周炎大鼠的牙周组织。一些研究已经证实，鸟氨酸A可以抑制细胞炎症还有骨关节炎、呼吸道炎症和皮肤肿瘤(9,41,42).Oroxylin A用于牙周炎的治疗，为治疗牙周炎的未来。

本研究调查了奥罗木素A对HO-1表达的影响，以验证奥罗木素A是否抑制炎症细胞因子通过HO-1在牙周炎中的作用。Oroxylin A做了HO-1不诱导炎症细胞因子的表达击倒，证明Oroxylin A抑制炎症细胞因子通过HO-1在牙周炎中的作用。总之，Oroxylin ALPS诱导RGF中炎性细胞因子表达减少对大鼠牙周炎有良好的抑制作用，为牙周炎的治疗提供了新的药物选择。

补充材料

支持数据

致谢

作者感谢高玉立博士实验协助和李聪珊博士讨论（附属医院正畸科青岛大学）。

基金

本研究得到了国家自然科学局的支持国家自然科学基金（批准号：51703106）中国山东省基金（批准号：ZR2016EMQ05和ZR2022ME021）。

数据和材料的可用性

本研究中产生的数据包括在本文的图表中。

作者的贡献

TW、ZW和CJ进行了实验，并编写了文章。YZ和LT分析和解释数据，并编写手稿。JF和XX构思并设计了该研究，并对其进行了修订手稿。所有作者均已阅读并批准最终版本手稿。TW和JF确认所有原材料的真实性数据。

道德批准和同意参与

本研究得到了伦理委员会的批准附属实验动物福利委员会青岛大学医院（批准号：AHQU-MAL20210326).

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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