介绍
慢性肾脏病（CKD）是一种长期的导致肾实质进行性损伤的疾病，导致肾功能恶化进展至终末期肾病（ESKD）(1). 无肾ESKD危及生命替代治疗，如透析和肾移植。腹膜透析（PD）使用患者的腹膜腹部是透析液通过的膜在这个过程中，流体和溶解物质与血液。导致的多余液体、毒素和其他物质肾功能衰竭也通过这个过程被清除(2). PD的优势在于在家里进行，从而避免了患者需要入院；此外，它更具成本效益减少饮食限制，并增加患者自由感和患者满意度，从而提高患者的生活质量(三). 尽管有这些好处，但PD仍然存在腹膜感染、皮下感染的高风险隧道感染与导管出口感染(4-6).然而，尽管这种透析技术有许多与其他可用方法相比，具有以下优点腹膜炎和微生物污染的风险增加血液通过导管，影响免疫防御导致并发症、发病率和死亡率(三,4).
目前，下一代测序（NGS）提供广泛微生物鉴定的一种有希望的替代方法临床样本中(7,8). 这种方法允许无偏见几乎所有潜在微生物的检测，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。NGS方法可以是用于克服传统方法的局限性微生物的存在可以通过独特的DNA/RNA序列的分类(7). 这种方法已经成功应用于传染病的临床诊断，如严重急性呼吸综合征冠状病毒(9)、医院感染检测(10),梭菌属难辨的-相关疾病(11)以及应对疫情疾病和新病原体的发现(7,12).特别化脓的液体通常预示着感染病因和NGS方法的应用有可能降低检测灵敏度，缩短检测时间(13). 大多数宏基因组研究使用了Illumina测序平台，测序周转时间超过16小时，整个过程周转时间为48-72h.相比之下，牛津纳米孔技术公司（ONT）提供了第三代测序技术与第二代技术相比在以下方面的优势更长的读取和实时序列分析功能，允许在数小时内检测潜在微生物排序，要求更短的周转时间<6小时(13,14).
然而，微生物的精确性质可能影响感染发生的污染目前尚不清楚，这代表着我们在以下方面的知识差距急需填补。很少有研究使用NGS技术探讨与血小板相关腹膜炎相关的微生物通过短读测序平台；然而，分类分辨率仅限于属级别(15,16).因此，本研究旨在发展快速诊断PD废水中细菌种类分类管道感染早期ESKD患者的PDE基于16S核糖体DNA（rDNA）长读扩增子测序。此外，该技术的准确性与金标准培养依赖法。因此，本研究是利用ONT在发现和帕金森病相关微生物感染以及与文化依赖方法的比较。
患者和方法
参与者
本研究使用了获得的104个PDE样本患者（62名男性和42名女性；年龄57.88±14.43岁）泰国腹膜透析结果与实践模式研究2019年1月间，泰国22家医院的（PDOPPS）设施和2021年12月。PDOPPS由机构批准朱拉隆功大学医学院评审委员会（批准号：1544/2020；IRB号：499/58；泰国曼谷）。这个本研究是利用先前获得的残留物进行的来自PDOPPS的样本，该样本由机构批准朱拉隆功大学医学院评审委员会（COA编号0754/2022；IRB编号0253/65；泰国曼谷）。见多识广的所有入选患者均表示同意。
所有参与者年龄均大于18岁诊断为肾衰竭，经历了连续非卧床腹膜透析或自动腹膜透析至少1个月。腹膜炎是根据存在以下三分之二的入选标准：i） 观察到第一次感染的PDE为cloud，ii）感染引起的腹膜炎已被报道iii）患者的白细胞计数>100个和/或多形核中性粒细胞百分比>50%。相比之下，18岁以下的患者和血液透析、急性腹膜透析或联合肾透析替代治疗被排除在目前的参与范围之外研究。
样品处理和DNA提取
简单地说，收集的样品（50 ml）是在微型离心机中在25˚C下离心15分钟18500 x g，随后去除上清液。这个将所得颗粒悬浮在400µl山梨醇缓冲液中，该缓冲液含有50 U溶菌酶（Merck KGaA），然后在30˚C下培养60分钟打破细胞。然后离心细胞悬浮液在18500 x g，4˚C下保持5分钟，然后丢弃上清液。随后，567µl 1M TE缓冲液、3µl 10%十二烷基硫酸钠（默克KGaA）、100µl 10 mg/ml溶菌酶（Merck KGaA添加mg/ml蛋白酶K（沃辛顿生化公司）解决方案。将所得混合物在65˚C下培养90min以消化蛋白质并抑制存在。最后，样品在在4˚C下以18500 x g进行微量离心5分钟，得到收集颗粒并将其重新悬浮在200µl无菌水中。总基因组DNA（gDNA）提取使用磁头®12gC系统（Precision system Science Co。，Ltd.），遵循制造商协议。数量和用260/280分光光度法评估DNA的质量DNA纯度（1.70-1.85）与1.5%琼脂糖凝胶的比率用RedSafe™核酸染色液电泳（cat。编号21141；Intron Biotechnology，Inc.）和提取的DNA在20˚C下保存，直至再次使用。
细菌培养
三个50 ml PDE袋在25˚C持续15分钟，并丢弃上清液。属于将剩余溶液5ml混合到颗粒中并注入装入BACTEC™Plus需氧/F和BACTEC Plus厌氧/F小瓶（Becton、Dickinson和Company）。随后，混合物涂在各种琼脂平板上，包括血琼脂，氧化物®麦康凯琼脂和巧克力琼脂（Thermo Fisher科学公司）和柠檬酸硫代硫酸盐胆汁盐蔗糖琼脂（Biomedia Thailand Co.，Ltd.），根据要求。盘子当时是在37˚C下培养5-7天，以促进细菌培养。随后进行细菌病原体鉴定通过革兰氏染色，利用VITEK®MS系统（生物技术研究所）。
16S rDNA基因扩增
部分16S rDNA的PCR扩增（V1-V4区域）被选为细菌分类方法物种层面的群落。引物包括特异性靶引物序列（下划线显示）和纳米孔适配器尾部，如下所示：16S_27向前，5'-TTTCTGTTGGTGCTGTATTGCAGRGTTYMGCTCAG-3'；和16S_806背面，5'-ACTTGCCTGTCGCTCTATCTCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。这个从用16S_27F/16S_806R引物扩增16S rDNA基因如所示图S1.PCR使用Phusion™Plus DNA聚合酶（ThermoFisher Scientific，Inc.）将放大过程中的误差降至最低。PCR反应的总体积为20µl，包含10µM正向和反向引物对、10µM dNTP、0.4U Phusion™Plus DNA聚合酶和10 ng DNA模板。这个热循环条件如下：98˚C 30秒，2598℃循环10秒，60℃循环10秒钟，72℃循环50秒，以及在72˚C下最后延长5分钟。每个样品的DNA文库使用PCR条形码扩展1-96试剂盒（目录号。EXP-PBC096；牛津纳米孔技术公司）。完成的条形码步骤使用与第一个PCR类似的热曲线，尽管条形码引物代替引物特异的16S rDNA基因。这个条形码步骤包括以下热循环条件：98˚C持续30秒，25次98˚C循环持续10秒，60˚C循环持续10秒钟，72˚C持续50秒，最后在72˚C下延长5分钟。PCR随后使用1%琼脂糖凝胶分离产物用RedSafe™核酸染色液电泳使用QIAquick凝胶提取试剂盒（目录号28704；Qiagen GmbH），遵循制造商协议。
纳米孔文库的制备和排序
使用Quant-iT™量化DNA库Qubit™的dsDNA高灵敏度检测试剂盒（目录号Q32851）4荧光计（赛默飞世尔科技公司）。随后，所有将文库汇集在一起（最终浓度为1µg）进行多路复用，并使用0.5X Agencourt AMPure XP珠进行纯化（贝克曼·库尔特公司）。纯化后，结扎牛津纳米孔技术公司的测序试剂盒（目录号。SQK-LSK112）用于修复和连接DNA末端库。最后，对汇集的DNA库进行测序（单端，800 bp），使用MinION™Mk1C测序设备和R10.4流量电池（目录号FLO-MIN112），均来自牛津纳米孔技术。
数据分析
原始数据或FAST5数据使用带有生成FASTQ格式的传递读取的超精确模型最低可接受质量分数Q>10(17). 随后，MinIONQC被用于评估纳米孔数据的读取质量(18). FASTQ序列经过使用Porechop 0.2.4版进行多路复用和适配器微调。筛选的读取经过聚类、抛光和分类使用NanoCLUST分类(19).该分类基于16S rDNA基因的V1-V4区域核糖体数据库项目数据库中的序列(20). 相对丰度和分类学分配数据转换为QIIME2数据格式，基于分类群丰度，并使用GraphPad Prism 9.5.0可视化。这个分析使用了为QIIME2软件实现的插件版本，2021.2(21). 这个进行了无监督聚类，并用热图表示使用ComplexHeatmap R软件包(22).
结果
PDE中的细菌多样性
细菌16S rDNA（V1-V4可变区）为使用高通量MinION™平台（牛津纳米孔技术）。在本研究中，平均读数为15079±11214。平均值分类阅读次数为10656±7762次/样本。A类随后应用稀疏分析来估计有足够的序列覆盖率来对所有样本进行分类并将其分类操作分类单元。结果表明89个PDE样本多样性的测序深度(图S2). 对α多样性进行了评估基于Chao1和Shannon指数，如所示图1A和B类Chao1指数（8.15±8.06）表明每个样本中细菌的丰富度，而香农指数（1.24±1.05）表示每个细菌的丰富度和均匀度样品。这一结果表明，样品异质性，这表明患者卫生的差异这可能解释了患者。
PDE中的相对细菌丰度ESKD患者
细菌组成的相对丰度对89份PDE样本进行分类。在门的水平上细菌为厚壁菌、变形杆菌和放线菌(图2A). 相对丰度属水平的细菌数量如图所示图2B五大细菌属被发现是大肠杆菌/志贺氏菌,链球菌,葡萄球菌,叶状杆菌和乳球菌属.一些丰富的细菌种类在接受帕金森病治疗的患者中发现(图2C). 结果表明：大肠杆菌(大肠杆菌)是最丰富的细菌种类，然后是（按顺序）叶状杆菌鼠尾草(P.myrsinacearum公司),链球菌溶木脂菌(溶性链球菌),葡萄球菌表皮病(表皮葡萄球菌)和海藻希瓦菌(S.藻类).
热图分析用于可视化细菌多样性的层次聚类，从而揭示前35位最丰富的细菌种类。所有受试者根据微生物群落划分为八个集群样品中的图案(图3).优势菌群包括坎迪达斯根瘤菌（集群1），格氏乳球菌（集群2），P.myrsinacearum公司（集群3），溶性链球菌（集群4）和表皮葡萄球菌（集群6）。大肠杆菌以第7组和第8组为主，以相对丰度分别为>70%和<70%。其他微生物群落类型划分为5类。这一结果表明压倒性的存在大肠杆菌在集群7和8，相对丰度有明显差异，可能意味着对患者健康的不同影响与不同的感染风险或结果相关。这个高丰度（>70%）和中等丰度（<70%）组大肠杆菌可能指向不同的定植或感染动态，表明集群7可能具有较高的感染相关风险与集群8相比的并发症(23). 其他微生物的分类集群5中的社区模式可能代表混合或过渡植物群，可能包括较少常见或不太常见，但仍可能在导管中发挥作用生态系统，无论是共生还是机会性病原体(24). 内部的这种多样性簇5也可能表明微生物环境波动受抗生素使用、患者等外部因素的影响卫生，或导管插入程序和维护。
宏基因组比较细菌鉴定方法与传统培养
在89份PDE样本中，细菌种类为根据传统方法，仅从56个样本（62.92%）中识别出培养法，而所有样品（100%）都可以分类通过宏基因组方法(图4). 在以下两者的比较中细菌的宏基因组和传统培养方法在56个样本中进行分类，两者的结果一致在42/56个样本中观察到了这些技术（75%）。简而言之优势细菌种类为大肠杆菌（8例），美国。表皮病（6例），肺炎克雷伯菌（三种情况），金黄色葡萄球菌（三种情况），粪大肠杆菌（两种情况），铜绿假单胞菌（两种情况），米提斯链球菌（两种情况），以及16种其他细菌（各1例），总结如下表一另一方面，对于剩下的14/56个样本（25%），不同的结果是在宏基因组方法和传统方法之间证明培养方法，如所示表二有趣的是，宏基因组方法可以应用用于细菌分类的样本数为33/89（37.08%），其中就传统文化方法而言是消极的。宏基因组结果总结于表III.
 | 表一一致性细菌概述两种方法获得的物种。 |
表一
一致性细菌概述两种方法获得的物种。
| 细菌物种 | 样本ID | 案例数量(%) |
|---|
| 不动杆菌印度 | PD591型 | 1/42 (2.38) |
| 伯克氏菌属洋葱属 | 780 | 1/42 (2.38) |
| 坎迪达斯根瘤菌 | PD596型 | 1/42 (2.38) |
| 柠檬酸杆菌弗雷迪 | 485 | 1/42 (2.38) |
| 棒状杆菌模拟人 | 796 | 1/42 (2.38) |
| 棒状杆菌纹状体 | 568 | 1/42 (2.38) |
| 棒状杆菌纹状体 | 633 | 1/42 (2.38) |
| 肠球菌属屎 | | |
| 埃希氏菌大肠杆菌 | 505, 487, 497, 510,511、716、750、PD711 | 8/42（19.05） |
| 肠杆菌属泄殖腔 | 520 | 1/42 (2.38) |
| 肠球菌属粪便 | 690、661 | 2/42 (4.76) |
| 克雷伯菌属肺炎 | 736、PD924、，PD631型 | 3/42 (7.15) |
| 乳球菌属加维埃 | 684 | 1/42 (2.38) |
| 假单胞菌属铜绿假单胞菌 | 734, 601 | 2/42 (4.76) |
| 希瓦氏菌属藻类 | 828 | 1/42 (2.38) |
| 葡萄球菌金黄色葡萄球菌 | 573, 647, 663 | 3/42 (7.15) |
| 葡萄球菌表皮病 | 541, 539, 711, 771,PD763、PD957 | 6/42 (14.29) |
| 葡萄球菌溶血杆菌 | 556 | 1/42 (2.38) |
| 葡萄球菌人类 | 709 | 1/42 (2.38) |
| 葡萄球菌巴斯图里 | 723 | 1/42 (2.38) |
| 葡萄球菌施莱弗利 | 727 | 1/42 (2.38) |
| 链球菌安哥拉人 | 536 | 1/42 (2.38) |
| 链球菌溶木脂菌 | 495 | 1/42 (2.38) |
| 链球菌米提斯 | 827，PD927 | 2/42 (4.76) |
| 表二不同细菌汇总宏基因组方法与传统文化之间的物种方法。 |
表二
不同细菌汇总宏基因组方法与传统文化之间的物种方法。
| 样本ID | 传统文化方法结果 | 前三名元基因组方法结果（丰度，%） |
|---|
| 496 | 科库里亚克里斯汀亚科 | 埃希氏菌大肠杆菌(38.54%),活泼瘤胃球菌(36.54%),粪普雷沃菌(11.45%) |
| 502 | 苍白杆菌属人类的 | 埃希氏菌大肠杆菌(48.22%),丹科肯甲基杆菌(26.55%),解糖梭菌(7.73%) |
| 506 | 假单胞菌属铜绿假单胞菌 | 埃希氏菌大肠杆菌(98.70%),白痢丁球菌(0.68%),沼泽石勒菌(0.63%) |
| 525 | 葡萄球菌金黄色葡萄球菌 | 卡他菌香港人(28.33%),酸性糖精(21.85%),Coprococcus来了(18.24%) |
| 554 |
棒状杆菌服务提供商。 | 芝中希拉钙质(40.20%),胃八叠球菌（37.47%），鲁兰地无色杆菌(5.99%) |
| 582 | 假单胞菌属铜绿假单胞菌 | 布鲁氏菌属西替尼（48.96%），戊酸杆菌(21.84%),木糖氧化酶无色杆菌(7.65%) |
| 593 | 根瘤菌放射杆菌 | 乳酸杆菌罗伊特里(33.81%),香港变形杆菌（21.98%），溶纤酵母(17.36%) |
| 665 | 葡萄球菌表皮病 | 链球菌乐观主义者(100%) |
| 695 | 分枝杆菌属肺结核 | 短状杆菌属砾岩(35.84%),痤疮丙酸杆菌(26.55%),大肠杆菌(20.58%) |
| 781 | 凝固酶阴性葡萄球菌 | 乳球菌属加维埃(93.95%),溶纤酵母(2.21%),大肠杆菌(1.24%) |
| 788 | 希瓦氏菌属腐败菌 | 埃希氏菌大肠杆菌(24.51%),痤疮丙酸杆菌(22.27%),屎蔷薇(17.22%) |
| PD512 | 克雷伯菌属肺炎 | 葡萄球菌人类(79.20%),大肠杆菌(17.44%),非典型韦氏杆菌(0.71%) |
| PD542型 | 分枝杆菌属肺结核 | 布鲁氏菌属西替尼(50.73%),屎类副杆菌(47.73),肠蔷薇(1.48%) |
| PD941型 | 葡萄球菌溶血杆菌 | 乳酸杆菌惰性气体(93.77%),斯塔利比雷卢拉(4.15%),尖端甲基杆菌(1.93%) |
| 表III细菌种类总结唯一的宏基因组方法。 |
表III
细菌种类总结唯一的宏基因组方法。
| 样本ID | 前三名元基因组方法结果（丰度，%） |
|---|
| 488 | M。嗜热菌(28.32%),梭状芽孢杆菌(22.94%),P.科普利(12.99%) |
| 498 | 大肠杆菌(49.62%),结核分枝杆菌(16.36%),A.chartisolvens公司（12.73%） |
| 504 | M。肺结核(86.92%),C.塞格尼斯(2.80%),大肠杆菌（2.49%） |
| 512 | 大肠杆菌(64.79%),弗格森大肠杆菌(19.04%),结核分枝杆菌(5.14%) |
| 513 | 美国。溶木脂菌(83.13%),大肠杆菌(12.31%),B.塞提（3.57%） |
| 521 | 大肠杆菌(92.49%),F.magna公司(7.51%) |
| 537 | 大肠杆菌(100%) |
| 565 | 蜡样芽孢杆菌(99.62%),P.痤疮(0.30%),魏亨斯特普汉氏杆菌(0.08%) |
| 583 | 豌豆乳杆菌(86.47%),D.埃及(9.74%),棉铃虫(3.79%) |
| 584 | D.埃及(88.51%),粪大肠杆菌(7.62%),米曲霉(2.08%) |
| 606 | 大肠杆菌(93.77%),镰刀菌(4.13%),M.放射耐受(1.40%) |
| 609 | 美国。溶木脂菌(98.93%),豌豆乳杆菌(1.07%) |
| 626 | 杰氏C.ikeium(99.50%),嗜盐分枝杆菌(0.27%),P.痤疮(0.23%) |
| 635 | 屎肠杆菌(41.69%),颊侧柏（14.21%），缬草O.valericgenes(8.52%) |
| 678 | 美国。唾液(97.45%),S.warneri公司(2.36%),E。粪便(0.19%) |
| 689 | N.marinus海军陆战队(59.48%),S.戈多尼(31.69%),塞迪米尼氏疟原虫(8.11%) |
| 701 | 美国。溶木脂菌(99.54%),大肠杆菌(0.46%) |
| 704 | 大肠杆菌(65.45%),表皮葡萄球菌(34.55%) |
| 721 | 屎肠杆菌(94.92%),B.黄体(3.95%),P.斯图泽里（0.75%） |
| 743 | 大肠杆菌(62.44%),P.myrsinacearum公司(29.22%),微小C.minuta(8.34%) |
| 787 | 第页。鼠尾草(99.53%),垂体外叶(0.47%) |
| 796 | 豌豆乳杆菌(65.22%),副结核链球菌(20.05%),棉铃虫（14.73%） |
| 801 | 大肠杆菌(52.48%),A.公社(26.08%),F.糖醋杆菌(10.55%) |
| 802 | 第页。鼠尾草(94.42%),泡状芽孢杆菌(3.59%),R。粘液性(1.99%) |
| 856 | 第页。鼠尾草(63.30%),B.金黄色葡萄(27.09%),B。囊泡菌(4.72%) |
| 967 | 大肠杆菌(98.17%),P.痤疮(1.83%) |
| PD504型 | 大肠杆菌(37.35%),粪大肠杆菌(25.86%),山羊P.capillosus(17.96%) |
| PD516型 | 大肠杆菌(51.20%),S.藻类(48.80%) |
| PD536型 | eligens大肠杆菌(74.34%),镰刀菌(11.61%),表皮葡萄球菌(7.05%) |
| PD585型 | 克氏K.kristinae(95.64%),对乙酰半乳糖(1.62%),链球菌病(0.71%) |
| PD587型 | 屎肠杆菌(32.69%),泄殖腔大肠杆菌(14.38%),eligens大肠杆菌(8.00%) |
| PD683型 | 塞迪米尼氏疟原虫(40.62%),短锥虫(12.76%),P.斯坦利(11.20%) |
| PD761型 | S.藻类(72.93%),C.纤维素(15.33%),北克氏（5.45%） |
讨论
使用牛津纳米孔进行扩增子测序技术平台是微生物的强大战略鉴定，并已广泛用于微生物组不同患者临床样本的分析(25). 该测序平台提供了无培养方法，两者都提供了成本效益高的技术与以下方面的一些基本好处相关长读取数据(26). 这个全长16S rDNA基因的扩增和序列测定（~1500 bp）可以对细菌进行鉴定具有高精度和高灵敏度的水准仪(27,28).然而，最初需要一个质量良好的DNA样本来扩增所述全长基因以进行长读测序；因此，这种方法的一个局限性是难以实现低质量DNA样本中的全长基因扩增。
在本研究中，PDE样本中的DNA是由于多种原因降级，包括在没有核酸保存（NAP）、RNA/DNA稳定缓冲液、，多次冻融，长时间保持在-20˚C一段时间(29). 降级样本中可能没有足够数量的DNA来扩增全长16S rDNA基因。为了解决这个问题，样品应该保留在NAP缓冲区中(30),避免多次冻融步骤更合适用于全长扩增子测序。通常，V3-V4高度可变16S rDNA基因区域（~500 bp）广泛用于细菌限制分类多样性的鉴定研究，仅在属级别指定(31). 对于V1-V4（~800 bp），目标序列长于V3-V4高变。因此，部分16SrDNA基因（V1-V4区）应用于鉴定没有保存缓冲液的样品中的细菌种类细菌DNA丰度低。另一个可能起作用的因素DNA中使用的裂解缓冲液将导致DNA降解提取过程。在大多数不同种类的细菌，而这一点要严格得多哺乳动物细胞的质膜。温和的溶解缓冲液因此可以用来确保质膜选择性溶解，不会对微生物造成损害。然而，某些微生物更有可能被使用选择性裂解缓冲液，导致不希望的低用于文库制备和测序的DNA数量(32).
在本研究中，Chao1和ShannonPDE的多样性指数相对低于之前的研究调查了腹膜组织样本(33).这一结果表明PDE中的细菌组成与细菌群落相比，样品可能会被稀释腹膜组织样本。然而，PDE样本采集是非侵入性和更方便的过程。本研究证明了传统的细菌培养方法104份样本中只有56份呈阳性（53.8%），而16S rDNA宏基因组方法能够识别多达89个样本(85.6%). 此外，目前的研究表明，同样的结果将传统培养方法与在42/56个样本中进行16S rDNA测序（75%）。值得注意的是，细菌根据缺少的33个样品（31.73%）对物种进行分类通过使用16S rDNA扩增子实现传统培养排序。综合考虑目前的研究与最近的研究相比较(16)，其中鸟枪基因组进行分析以确定PDE样本中的病原体在BGISEQ平台上，如表四.
| 表四阳性率的比较细菌培养和宏基因组分析研究和最新报告。 |
表四
阳性率的比较细菌培养和宏基因组分析研究和最新报告。
| 结果 | 目前的研究 | Ye（是）等,2022(16) |
|---|
| 阳性率来自培养方法 | 56/104(53.85%) | 18/30 (60%) |
| 阳性率来自宏基因组分析 | 89/104(85.58%) | 26/30 (86.67%) |
| 阳性率来自两种技术 | 56/104(53.85%) | 15/30 (50%) |
| 负利率自两种技术 | 0/104 (0%) | 1/30 (3.33%) |
在本研究中，16S rDNA基因测序结果表明，厚壁菌、变形杆菌和放线菌是ESKD患者的优势门，与先前发表的研究结果(34). 根据调查结果目前的研究，以前的研究在ESKD患者的腹膜组织厚壁菌和变形杆菌的丰度(33). 细菌属埃希氏菌,链球菌和葡萄球菌在最近的一项研究中也发现了(16)使用传统文化方法和鸟枪基因组分析。因此E。大肠杆菌，P.myrsinacearum,溶性链球菌,美国。表皮病和S.藻类在PDE样本中本研究可能具有临床意义。此外，一个不同的研究(35)揭示了病因基于传统培养基的PDE样品中的微生物发现两种革兰氏阳性菌（即，葡萄球菌，链球菌和肠球菌属)和革兰氏阴性细菌（即，大肠杆菌，克雷伯菌和假单胞菌属). 这一发现在一定程度上与那些在本研究中。
一般来说，大肠杆菌是一个经常革兰氏阴性腹膜炎细菌，可产生与穷人相关的超广谱β-内酰胺酶预后(36). 有趣的是，PD-相关腹膜炎链球菌属.具有从进入腹膜腔的途径报告，包括交换或导管相关过程中的污染过程和细菌移位(37). 许多研究表明最常见的病原体是凝固酶阴性葡萄球菌物种，包括表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌通常在人类皮肤和手上定居也可能通过出口和隧道感染导致腹膜炎(38,39).希瓦氏菌属sp.是氢产硫化物的活动革兰氏阴性杆菌。临床常见的综合征是皮肤和软组织感染，包括腹膜导管相关感染(40). 最后，第页。鼠尾草是一种革兰氏阴性细菌人类感染。作为P.myrsinacearum公司无法继续生长标准培养基培养，基于此细菌的鉴定关于宏基因组方法提出了几个悬而未决的问题关于它是否能引起人类严重感染(41).
总之，本研究证明了基于16S部分基因扩增的宏基因组分析rDNA与牛津纳米孔技术，适用于PDE含有低丰度DNA的样本。目前的宏基因组这种方法将有助于监测可能的细菌CKD腹膜透析患者的感染。此外，这种方法可能具有吸引力，并适用于其他样本尿液、皮肤和结膜等DNA含量低试样。此外，它还可以用于选择合适的药物长期容易降低抗生素耐药性。
补充材料
1%琼脂糖凝胶电泳使用16S_27F/16S_806R引物的代表性PCR产物特异于细菌16S rDNA（V1-V4区）扩增。这个三角形表示预期的带区。“+”和“-”表示阳性和阴性对照。bp，碱基对；M、，100 bp阶梯标记；S1-S4：代表性腹膜透析废水样本。
稀疏曲线分析。X轴表示排序深度，而Y轴表示香农多样性指数。每条颜色线代表不同样品。
致谢
作者想感谢系统微生物学卓越中心（CESM）朱拉隆功大学医学部提供技术支持和协助本研究中的实验。
基金
资助：本研究由Ratchadapisek Sompot资助基金（赠款编号：GA66/034、HEA663000115、HEA6.63000116和RA-MF-26/66），朱拉隆功大学医学院。这个作者还获得了国家研究委员会的拨款泰国（NRCT）（批准号N41A660174），泰国科学研究院朱拉隆功大学创新基金（批准号：。CU_FRB65_hea（19）026_30_07）和皇家医学院泰国（批准号：02/66）。本研究得到部分支持朱拉隆功大学研究生奖学金纪念普密蓬·阿杜德国王陛下72周年纪念。
数据和材料的可用性
可以找到本研究中生成的数据国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案（SRA），注册号为SRR26930019至SRR26930107。本研究中产生的数据可以找到在NCBI GenBank中，注册号为PRJNA1044279或以下URL：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1044279.
作者的贡献
SP和TK将研究概念化。SV执行了实验、分析数据、解释结果和准备手稿的草稿。PK、VS和PS有助于数据分析。PC、TS和PP为实验。SP和TK监督、修订了最终手稿确认所有原始数据的真实性。所有作者阅读和批准了最后的手稿。
道德批准和同意参与
本研究根据赫尔辛基宣言（2013），本研究的方案为由学院学院审查委员会批准朱拉隆功大学医学院（批准号0754/2022；IRB号。0253/65; 泰国曼谷）。获得了所有人的知情同意包括患者。
患者同意发布
不适用。
竞争性利益
作者声明他们没有竞争对手利益。
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