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.2024年4月17日；15(4):273.
doi:10.1038/s41419-024-06654-1。

TAK1抑制导致免疫激活癌症中RIPK1依赖性凋亡

海伦·达姆霍费尔 1 2 三, 杜林塔塔 1 三, 本杰明·索斯盖特 4, 斯科特·斯卡内奥 5 6, 卡尔·阿格 三, 达丽亚·什吕埃娃（Daria Shlyueva） 2 三, Lene Uhrbom公司 7, 吉莉安·莫里森 4, 菲利普·休斯 5 6, 蒂莫西·海斯特德 5 6, 史蒂文·波拉德 4, 克里斯蒂安·赫林 8 9 10
附属公司

TAK1抑制导致免疫激活癌症中RIPK1依赖性凋亡

海伦·达姆霍费尔等。 细胞死亡病. .

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）的生存率低和缺乏治疗反应是由于胶质瘤干细胞（GSC）的持续存在。为了确定新的治疗方法，我们进行了CRISPR/Cas9基因敲除筛选，并发现转化生长因子β活化激酶（TAK1）在很大一部分GSC中是选择性生存因子。TAK1激酶活性的丧失通过Caspase-8/FADD复合物激活导致RIPK1依赖性凋亡，依赖于自分泌TNFα配体的产生和构成性TNFR信号。我们确定与免疫激活和间充质GBM亚型相关的转录特征是对TAK1干扰敏感的癌细胞的特征，并利用该特征准确预测对TAK1-激酶抑制剂HS-276的敏感性。此外，暴露于促炎细胞因子IFNγ和TNFα可使耐药GSC对TAK1抑制敏感。我们的发现揭示了对TAK1激酶活性的依赖性是免疫激活癌症中的一种新的脆弱性，包括可用于治疗的间充质干细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

TH、PFH和SS是Eydisbio Inc的联合创始人，Eydisbio Inc是一家初创公司，已获得与本研究中使用的HS-276分子相关的专利许可。SP是Cellinta Ltd.的联合创始人和科学顾问。KH是Dania Therapeutics的联合创始人，也是Hannibal Innovation的科学顾问。BS现被聘为Zifo RnD解决方案的高级生物信息学家。TH、PFH和SS是三份与HS-276支架相关的美国专利申请的共同发明人。其余作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。CRISPR/Cas9剔除屏幕识别GSC子集中的MAP3K7/TAK1依赖性。
A类在神经胶质瘤干细胞中使用定制慢病毒sgRNA表观文库的脱落筛选示意图。B类火山图表示log2褶皱变化和−log10调整第页-比较U3013MG或G166 GSC中最终（第38天或第35天）和参考（第0天）时间点的每个sgRNA丰度值。阳性（必需基因）和阴性（非靶向）控制sgRNAs分别用红色和蓝色表示。虚线表示用于点击选择的截止线。C类维恩图显示了两个GSC屏幕中确定的点击数和基于DepMap数据的常见基本基因的重叠（Archilles common essential，版本22Q1）。表中显示了GSC中19个基因中最佳sgRNA的对数2倍变化损耗。根据所有DepMap细胞系的CRISPR筛查的中位数基因依赖性得分进行排名。D类在强力霉素（dox）诱导Cas9表达72小时后，U3013MG iCas9细胞的Western blot显示TAK1蛋白丢失。E类卡通描绘了iCas9 GSC中竞争性生长分析的实验装置。F类–我iCas9 GSC竞争性生长分析条形图。通过流式细胞术测量人群中BFP阳性细胞的百分比，并描述每一代未经Cas9诱导（-dox）的孔的相对大小。sgNC（非靶向对照sgRNA）、sgCTR（靶向对照sgRNA在编码基因外切割）、sgPRMT5/sgMCM2（必需基因阳性对照sgRNA）。J型竞争性生长试验，通过野生型TAK1或催化不活性TAK1的过度表达进行互补K36瓦突变体。K（K）ctr（sgCTR）和TAK1基因敲除细胞（sgMAP3K7）中的累积生长分析，通过野生型TAK1或催化不活跃的TAK1的过度表达进行互补K36瓦突变体。
图2
图2。地图3K7缺失导致通过TNFR1信号诱导RIPK1依赖性凋亡。
A类表达U3013MG iCas9细胞的sgMAP3K7_32在dox诱导Cas9长达7天后的时间进程实验中指示蛋白质的代表性蛋白质印迹。B类–D类Annexin V阳性细胞百分比条形图(B类和D类)或Caspase-FITC细胞(C类)在TAK1基因敲除（dox）诱导4天后通过流式细胞术进行定量。E类竞争性生长分析显示，在存在靶向Caspases-1、-8和-9的第二个sgRNA的情况下，随着时间的推移，人群中TAK1敲除细胞的百分比（通过BFP丰度测量）。包含基因名称的sgRNA显示在x轴上。通过流式细胞术测量人群中BFP阳性细胞的百分比，并描述每一代未经Cas9诱导（-dox）的孔的相对大小。虚线表示第二个非靶向sgRNA（NC）存在时TAK1缺失对种群的影响。误差条表示每个时间点3个生物复制的平均值+SD。F类用多西环素（dox）诱导sgCTR、sgMAP3K7_15和sgMAP3G_32表达细胞中Cas9表达4天后不同凋亡标记物的Western blot。G公司,H（H）竞争性增长分析(E类)第二个sgRNAs靶向不同的凋亡复合体成员(G公司)或死亡受体基因(H（H）).
图3
图3。TAK1降解导致RIPK1依赖性凋亡。
A类使用dTAG-TAK1降解系统的TAK1消耗示意图。B类用100 nM dTAG处理dTAG-TAK1 GSC的时间进程实验的Western blotsV（V）-1个配体用于指定的时间量。C类用100 nM dTAG处理后用流式细胞术定量的总%Annexin V阳性细胞条形图V（V）-1配体。每个时间点显示2个生物复制。早期凋亡细胞被定义为Annexin V+/DAPI-，晚期凋亡细胞被称为Annessin V+/DAPI+。D类100 nM dTAG治疗24小时后凋亡标记物的Western blotV（V）-1配体。E类用100nM dTAG处理后通过流式细胞术定量的总%膜联蛋白V阳性细胞的柱状图V（V）-敲除指定基因后，在dTAG-TAK1脱基因细胞中1个配体4天。F类表达BFP和亲代GSC的dTAG-TAK1细胞竞争性生长分析的柱状图。dTAG治疗后人群中%BFP阳性细胞的折叠变化V（V）-相对于DMSO处理的对照，显示1个配体持续7天。G公司CRISPR敲除第二个指示基因并用dTAG处理后dTAG-TAK1脱细胞的累积生长测定V（V）-1配体。H（H）描绘用dTAG处理后群体中%BFP阳性dTAG-TAK1细胞的倍数变化的柱状图V（V）-相对于DMSO处理的对照组和使用增加浓度的TNF配体阻断抗体Etanercept治疗的对照组，1个配体持续7天。我用TNFα治疗后RIPK1磷酸化事件的Western blot检测TAK1蛋白缺失与否*表示非特定波段。J型TAK1依赖性GSC对TAK1抑制的分子反应卡通。
图4
图4。新型选择性TAK1抑制剂HS-276的药理抑制作用诱导GSC凋亡。
A类,B类Annexin V阳性细胞百分比条形图(A类)和折叠细胞膨胀(B类)用DMSO或3µM HS-276处理4天后，U3013MG细胞TNFR通路成员被敲除。C类,D类Annexin V阳性细胞百分比条形图(C类)和折叠细胞膨胀(D类)HS-276或Takinib联合RIPK1抑制剂Necrostatin-1s（Nec-1s）处理U3013MG细胞4天。E类用二甲基亚砜、HS-276或HS-276与Nec-1s联合处理的U3013MG或G166细胞的累积生长测定。F类在4种不同的胶质瘤干细胞系（U3013MG、G166、U3017MG和G14）中，DMSO或3µM HS-276治疗后4天内折叠细胞扩张的条形图。G公司用二甲基亚砜或3µM HS-276处理胎儿神经干细胞（fNSC，U5）后4天内的折叠细胞扩增条形图。H（H）TNFα和HS-276处理2或4小时后GSCs中死亡复合物IIb形成的蛋白质印迹。我U3013MG细胞中与二甲基亚砜相关的细胞存活率条形图，用指示的化疗药物单独或与HS-276联合治疗4天。
图5
图5。TAK1抑制剂敏感性GSC的特点是高细胞因子/干扰素信号基因表达特征。
A类热图显示，在12个GSC株系中，生长抑制率%表示为HS-276处理4天后相对于DMSO处理对照平均值的细胞数量相对减少。根据HS-276和DMSO处理条件下细胞数量的显著差异，GSC分为敏感型（红色）和不敏感型（蓝色）。显示了3个生物复制的代表性结果。右侧的热图显示了来自间充质、原神经或经典GBM亚型细胞系的基因表达特征的GSVA评分。B类GSC品系RNAseq数据的主成分分析图（PCA）。HS-276敏感线以红色显示，不敏感线以蓝色显示。C类敏感和不敏感GSC品系差异表达基因的火山图(n个 = 每组6人）。敏感GSC中高表达的基因显着地被染成红色，低表达的基因被染成蓝色，而灰色不变。虚线表示用于确定失调基因的临界值（绝对log2倍数变化>1并调整第页-值<0.1）。D类对HS-276治疗敏感的GSC中12个最显著富集的Hallmark基因特征的条形图（基因集高，n个 = 513).E类敏感人群中选定干扰素刺激基因（ISG）基线表达的log2标准化读取计数的Box和wiskers图(n个 = 6） 和不敏感GSC(n个 = 6） 通过RNAseq测量。晶须显示组内的最小值和最大值。方框表示中位数、上四分位数和下四分位数。F类7天条件下GSC上清液中TNFα浓度的ELISA（6个生物复制品）。nd=未检测到。G公司的条形图IFNB1、IFNG，以及TNF公司用qPCR测定GSC中的基因表达，并将其归一化为RPLP0型.H（H）U3013MG折叠细胞扩增条形图，使用指定药物治疗4天。我GCGR-GSC线中GSVA得分的热图。根据敏感性特征GSVA评分对样本进行排名。ID，GCGR患者ID。*表示选择用于体外测试HS-276反应性的GSC系。J型用HS-276治疗4天后，14个GCGR GSC相对于DMSO的生长百分比与敏感性特征GSVA评分的散点图。所示为3个生物复制品（HS-276/DMSO处理）的相对平均值。HS-276治疗后细胞数量显著减少的GSC用红色表示。虚线表示根据GSVA评分将GSC分为预测的敏感（阳性评分）和预测的不敏感（阴性评分）GSC，HS-276处理对TAK抑制敏感性的生长减少为25%。K（K）的散点图地图3K759个DepMap神经胶质瘤细胞系的针对敏感性标志GSVA评分的基因敲除效应。
图6
图6。联合IFNg和TNFa途径激活需要使GSC对TAK1抑制敏感。
A类U3017MG的CD44表面染色用指定的细胞因子处理3天。B类细胞因子治疗后ISG、间充质或神经前体标记基因表达的qPCR。误差条表示2个技术复制品的平均+/-SD。C类,D类U3017MG细胞用指定的细胞因子预处理3天，然后用DMSO或HS-276进行4天的折叠细胞扩增。E类HS-276治疗对使用指定细胞因子预处理后4个神经前GSC折叠细胞扩张的影响。F类鲁索里尼治疗48小时后U3013MG细胞ISG表达的qPCR。G公司U3013MG细胞中的折叠细胞扩张和%Annexin V阳性细胞，用Ruxolitinib预处理，然后用HS-276治疗4天。
图7
图7。高免疫信号激活是TAK1依赖性癌细胞系的一个共同特征。
A类来自1070个癌细胞系的MAP3K7依赖性基因评分的直方图。突出显示的是对MAP3K7缺失最敏感（红色）或最不敏感（蓝色）的线。B类敏感、不敏感或其他组的细胞系频率热图绘制在不同的原发疾病类别上。*表明与第页 < 0.05（费希尔精确检验）。C类敏感基因之间差异表达基因的火山图(n个 = 47）和不敏感(n个 = 51）癌细胞系。敏感细胞系中高表达基因显着地用红色表示，低表达基因用蓝色表示，而不变的用灰色表示。虚线表示用于确定解除管制的基因的截止值（绝对对数2倍变化>1且经过调整第页-值<0.1）。D类在对MAP3K7缺失敏感的系中高度表达的10个最显著富集的Hallmark基因特征的条形图（基因设置高，n个 = 656).E类对MAP3K7缺失敏感和不敏感的癌细胞株之间差异表达的选定基因的小提琴图。F类HS-276的热图对具有DepMap基因依赖性评分和谱系信息的23个癌细胞系的细胞生长的影响。G公司Etanercept和Nec-1s共处理8个TAKi敏感细胞系的折叠细胞扩增条形图。
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