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.2022年9月16日；479(17):1891-1907.
doi:10.1042/BCJ20220314。

髓细胞中TLR信号传导和细胞因子产生需要TAK1蛋白激酶活性

梅丽莎·罗德里格斯 1, 茨维塔纳·彼得罗娃 1, 布伦丹·蒂布斯 1, J西蒙·C·阿瑟 2, 菲利普·科恩 1
附属公司

髓系细胞TLR信号和细胞因子产生需要TAK1蛋白激酶活性

梅丽莎·罗德里格斯等。 生物化学J. .

摘要

产生了一种条件敲入小鼠，其中TAK1催化亚单位大部分被免疫细胞中激酶激活的TAK1[D175A]突变体所取代。TAK1[D175A]小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中p38αMAP激酶、c-Jun N末端激酶1和2（JNK1/2）以及由几种TLR-激活配体刺激诱导的典型IKK复合物的激活降低。TAK1[D175A]BMDM中的TLR信号传导由这些细胞中残留的野生型TAK1催化，因为它被两种结构上不相关的TAK1抑制剂（NG25和5Z-7-氧代玉米烯醇）中的任何一种消除，这两种抑制剂的脱靶效应不重叠。TAK1[D175A]小鼠腹腔中性粒细胞或BMDM中炎性介质的分泌和TLR结扎诱导的编码这些细胞因子的mRNA的产生大大减少。在TAK1敲除的人THP1单核细胞或巨噬细胞中，Pam3CSK4或LPS刺激的MAP激酶和典型IKK复合体的激活以及细胞因子的分泌也被消除。结果表明，TAK1蛋白激酶活性是小鼠髓细胞TLR依赖性信号和细胞因子分泌所必需的。我们讨论了其他研究人员在研究有条件敲除TAK1或不同条件激酶激活TAK1的髓系小鼠时，报告TAK1是小鼠巨噬细胞和中性粒细胞LPS信号和细胞因子生成的负调节器的可能原因。

关键词：MyD88；免疫细胞信号；类收费受体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

数字

图1。
图1.TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠的淋巴器官增大，B细胞和中性粒细胞数量增加，TAK1和TAB蛋白表达正常。
(A类)12周龄WT和TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠（D175A）脾脏的代表性图像，比例尺=1 cm(B类)12周龄WT的脾脏重量(n个 = 4） 和TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠(n个 = 4). 每个符号代表一个单独的鼠标。(C类–E类)如中所示(B类)除了脾细胞(C类)，B电池(D类)和中性粒细胞(E类)显示了脾脏中的数字。(F类)12周龄WT和TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠（D175A）的腋窝（上图）和腹股沟（下图）淋巴结（LN）的代表性图像。(G公司)12周龄WT腋窝和腹股沟淋巴结细胞总数(n个 = 4） 和TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠(n个 = 4). (H（H）)如中所示(G公司)，但显示LN中的B单元编号。使用未配对的t吨-使用韦尔奇修正进行测试；*表示P（P） < 0.05. (我)从三只单独的WT小鼠或三只单独TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠（D175A）（+、+、+）在SDS中变性，进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，并使用ECL检测系统（GE Healthcare）进行免疫印迹，抗体识别TAK1、TAB1、TAB2、TAB3和GAPDH作为负荷控制。
图2。
图2.Pam三CSK公司4、R848或LPS刺激的细胞因子分泌在TAK1[D175A]BMDM中显著减少。
用1µg/ml Pam刺激4只WT（黑条）和4只TAK1[D175A]（红条）小鼠的BMDM，刺激时间为所示时间三CSK公司4(A类–D类)，250纳克/毫升R848(E类–H（H）)或100 ng/ml LPS(我–L（左）)和IL-6(A类,E类和我)，IL-10(B类,F类和J型)，IL-12p40(C类,G公司和K（K）)和TNF(D类,H（H）和L（左）)测定培养基中的分泌量。条形图显示平均值和误差条形图±平均标准误差（SEM）。在其他八个比较来自一只WT和一只TAK1[D175A]小鼠的BMDM的独立实验中也获得了类似的结果。
图3。
图3 TAK1[D175A]BMDM中Pam3CSK4、R848和LPS刺激的细胞因子mRNA水平显著降低。
用1µg/ml Pam3CSK4刺激4只WT小鼠（黑圈）和4只TAK1[D175A]小鼠（红圈）的BMDM，刺激时间为指定的时间(A类–C类)，250纳克/毫升R848(D类–F类)或100 ng/ml LPS(G公司–我). 从细胞中提取RNAil6号机组信使核糖核酸(A类,D类,G公司),il10号机组信使核糖核酸(B类,E类,H（H）)和il12第40页信使核糖核酸(C类,F类,我)并通过实时定量PCR检测其含量。结果显示为mRNA相对于未刺激样品中水平的倍数增加。将值归一化为GAPDH公司mRNA水平。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。
图4。
图4 TAK1[D175A]中性粒细胞中Pam3CSK4、R848和LPS刺激的细胞因子生成受到抑制。
用1µg/ml Pam3CSK4刺激WT（黑条）和TAK1[D175A]（红条）小鼠的腹腔中性粒细胞达到指定的时间(A类–C类)，250纳克/毫升R848(D类–F类)或100 ng/ml LPS(G公司–我). IL-6(A类,D类和G公司)，IL-12p40(B类,E类和H（H）)和TNF(C类,F类和我)然后在指定的时间测量分泌到培养基中的浓度。结果是用一只WT和一只TAK1[D175A]×Vav-iCre小鼠的中性粒细胞获得的，图中显示了三次测定的误差条±平均值标准误差（SEM）。在四个额外的独立实验中也得到了类似的结果，每个实验都比较了一只WT和一只TAK1[D175A]小鼠的中性粒细胞。
图5。
图5..Pam需要TAK1催化活性三CSK公司4-BMDM中的R848和LPS刺激信号。
(A类–C类)用1µg/ml Pam刺激WT和/或TAK1[D175A]小鼠的BMDM，刺激时间为所示时间三CSK公司4(A类)，250纳克/毫升R848(B类)或100 ng/ml LPS(C类). 对细胞提取物（10µg蛋白质）进行SDS-PAGE，并用识别磷酸化（p）形式的JNK1/2、p38α、IKKα/β以及所有形式的IκBα和p38αMAPK（p38α）的抗体进行免疫印迹。在3个单独的实验中获得了类似的结果。(D类–F类)如中所示A类–C类除了TAK1[D175A]小鼠的BMDM在没有（−）或（+）TAK1抑制剂NG25（2µM）或5Z-7-氧代烯醇（3µM。
图6。
图6.TAK1是THP-1单核细胞和THP-1巨噬细胞中Pam3CSK4-和LPS刺激的信号传导所必需的。
用100 ng/ml Pam刺激WT或TAK1 KO THP1单核细胞克隆4和克隆5（C4-Mono和C5-Mono）30分钟三CSK公司4(A类)或100 ng/ml LPS(B类). (C类–F类)通过PMA刺激WT和TAK1 KO THP-1细胞，然后用Pam3CSK4刺激，将其分化为巨噬细胞样表型(C类,D类)或LPS(E类,F类)如A所示(A类–F类)对SDS变性细胞提取物（10µg蛋白质）进行SDS-PAGE和免疫印迹，抗体识别人TAK1、磷酸化（p）形式的JNK1/2、p38αMAPK（p38α）、IKKα/β和所有形式的p38α（p38β）。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。
图7。
图7.Pam需要TAK1三CSK公司4-LPS刺激THP-1单核细胞分泌细胞因子。
用100ng/ml Pam刺激WT THP-1细胞（黑色条）、TAK1 KO THP1细胞克隆4（白色条水平为基线）和TAK1 KO THP1细胞克隆5（阴影条）8小时或16小时三CSK公司4(A类–D类)或100 ng/ml LPS(E类–H（H）)和IL-6的分泌(A类,E类)，白介素-8(B类,F类)，巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1β(C类,G公司)和TNF(D类,H（H）)在培养基中进行测定。实验是用重复的培养皿进行的，图表显示了平均值。在三个单独的实验中获得了类似的结果。
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