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.2018年4月26日；14（4）：e1007363。
doi:10.1371/journal.pgen.1007363。 eCollection 2018年4月。

AP-4缺乏综合征小鼠模型神经元中ATG9A分布和轴突聚集物的改变

拉斐拉·德佩斯 1, 米盖尔·斯基尔佐夫斯基 2, 马库斯·达姆 三, 拉斐尔·马泰拉 1, 杰弗里·莫克里奥 1, 阿丽安娜·福斯特 1, 洛雷托·库蒂诺 1, 米查尔·贾尼克 1, 维多利亚·霍夫曼 4, H道格拉斯·莫里斯 5, Tae-Un Han先生 6, 格拉齐亚·M·S·曼奇尼 7, 安德烈斯·布纳诺 2, 胡安·博尼法西诺 1
附属公司

AP-4缺乏综合征小鼠模型神经元中ATG9A分布和轴突聚集物的改变

拉斐拉·德佩斯等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一组临床和遗传异质性疾病，其特征是进行性下肢痉挛。异源四聚体（ε-β4-μ4-σ4）适配器蛋白4（AP-4）复合体亚基的突变导致复杂HSP的常染色体隐性形式，称为“AP-4缺乏综合征”。除了下肢痉挛外，该综合征还表现为智力残疾、小头畸形、癫痫、胼胝体薄和上肢痉挛。然而，其发病机制仍知之甚少。在这里，我们报道了编码AP-4ε亚单位的AP4E1基因敲除（KO）小鼠的特征。我们发现AP-4εKO小鼠表现出一系列神经表型，包括紧抱后肢、运动协调性下降和握力减弱。此外，AP-4εKO小鼠在大脑和脊髓的不同区域显示出薄薄的胼胝体和轴突肿胀。免疫组织化学分析显示，在AP-4μ4亚基突变患者的皮肤成纤维细胞和AP-4εKO小鼠的各种神经元类型中，跨膜自噬相关蛋白9A（ATG9A）更多地集中在反式高尔基体网络（TGN）中，并从外周细胞质中耗尽。ATG9A定位错误与AP-4εKO神经元轴突中突变体亨廷顿蛋白（HTT）聚集物积累趋势增加有关。这些发现表明，AP-4εKO小鼠是AP-4缺乏综合征的合适动物模型，并且TGN中ATG9A的动员缺陷和蛋白质聚集体的自噬降解受损可能导致该疾病中的神经轴突营养不良。

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数字

图1
图1。AP-4εKO小鼠的分子和行为特征。
（A） AP-4ε生成策略示意图(AP4E1接口)KO鼠标。外显子被编号。外显子3被Cre介导的重组删除，导致因移码和ORF提前终止而导致的等位基因为空。通过Flp介导的重组去除用于选择的新霉素盒以及Lac Z报告序列。指出了用于基因分型的PCR引物的位置。（B） 使用与外显子3侧翼序列互补的PCR引物对+/+（WT）、-/-（KO）和+/-（杂合子）小鼠进行基因分型。WT和KO等位基因分别产生932和269 bp片段。（C） 两只WT和两只KO小鼠小脑和大脑皮层匀浆中AP-4ε和β4亚单位、AP-1γ1亚单位和β-微管蛋白（对照）的SDS-PAGE和免疫印迹分析。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（D） 5个月大的WT和KO小鼠用尾巴抱住的扣合反应的代表性图片。红色箭头表示KO小鼠后爪的抓握。（E） 在5个月龄和8个月龄时表现出抱抱的WT和KO小鼠的百分比。每个栏顶部的数字表示每组中扣合/总小鼠的数量（5个月龄体重：5只雄性，8只雌性，KO：4只雄性，5只雌性；8个月龄重量：4只雌性，3只雌性，KO：7只雄性，3只雌鼠）。（F） 3个月大的小鼠在旋转木马上的表现。使用的小鼠数量为：22只WT（12只雄性，10只雌性）和19只KO（10只雄性，9只雌性）。各个点显示了每只鼠标从杆上落下时的RPM。条形图表示每组的平均值±SEM。（G） 3月龄小鼠的握力。使用的小鼠数量为：27只WT（13只雄性，14只雌性）和25只KO（13雄性，12只雌性）。各点表示握力，单位为牛顿（N），杆表示每组的平均值±扫描电镜。（H） 在旷野试验中，3个月龄小鼠的新奇诱导运动活动。使用的小鼠数量为：12只WT（6只雄性，6只雌性）和12只KO（6雄性，6雌性）。数值是每5分钟行驶距离的平均值±SEM。插图描述了在总共30分钟内的累计总行驶距离，单位为米（m）。（I）3个月大的小鼠在噪音水平增加时的声惊吓反应，单位为分贝（dB）。使用的小鼠数量为：22只WT（11只雄性，11只雌性）和22只KO（10只雄性，12只雌性）。数值是以任意单位（A.U.）表示的惊吓响应的平均值±SEM*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。
图2
图2。AP-4εKO小鼠脑内薄胼胝体和轴突球体。
（A） MRI显示，一只9个月大的KO相对于一只年龄匹配的WT小鼠的大脑胼胝体较薄（箭头和绿色亮点）。结果代表每组三只小鼠。（B） H&E染色的冠状脑切片显示，与年龄匹配的WT小鼠相比，9个月大的KO小鼠胼胝体较薄约55%。棒材：500μm。显示了可比切片中胼胝体的厚度。结果代表每组两只小鼠。9月龄小鼠脑冠状切片的（C，D）H&E染色显示KO小鼠小脑深核（DCN）中出现弱染色和强染色的球体（箭头），而WT小鼠则没有。编号的面板是装箱区域的四倍放大。棒材：20μm。小脑切片中钙结合蛋白（绿色）的免疫组织化学染色显示，KO小鼠（而非WT小鼠）浦肯野神经元（E）近端轴突中罕见轴突球体，而DCN（F）浦肯耶神经元远端轴突中大量球体。球体用箭头表示。棒材：50μm。（G） 小脑切片calbindin（绿色）和LAMP1（红色）的免疫组织化学联合染色显示，KO小鼠DCN中的Purkinje细胞球体对LAMP1呈阴性。棒材：50μm。（H） 中脑白质束切片中神经丝蛋白NFH（绿色）和LAMP1（红色）的免疫组织化学联合染色显示KO小鼠中含有这两种蛋白（箭头）的球体。棒材：50μm。在G和H中，单通道图像以倒置灰度显示。在E-H中，用DAPI（蓝色）染色细胞核。
图3
图3。WT和AP-4εKO小鼠小脑浦肯野神经元中谷氨酸受体的分布。
（A-C）用钙结合蛋白（红色）和δ2R（Frontier Institute co.，ltd的AB_2571601）（A）、GluA2（Sigma的SAB4501295）（B）或GluA1（Millipore的AB1504）（C）抗体对WT和AP-4εKO小鼠的小脑切片进行联合免疫染色。在用胃蛋白酶处理的切片上进行δ2R染色，在用柠檬酸钠缓冲液在85°C处理的切片上进行GluA1染色，这两种情况都是为了抗原回收。使用未经高温柠檬酸钠缓冲液处理的样品（S5C和S5D图）和使用不同的GluA1抗体（来自Abcam的抗体ab31232）（S5A和S5B图）获得了类似的结果。Mo：分子层；Gr：颗粒层，Pc：浦肯野细胞层，DCN：小脑深核。DAPI（蓝色）染色细胞核。棒材：50μm。球体的示例用箭头表示。单通道图像以倒灰度显示。注意AP-4εKO DCN中钙结合蛋白阳性球体中δ2R和GluA2的存在，以及GluA1的缺失。
图4
图4。AP-4μ4突变患者成纤维细胞TGN处ATG9A的积累。
（A） 来自一名对照个体和两名患者的皮肤成纤维细胞的基因突变纯合子AP4M1系列通过SDS-PAGE和免疫印迹分析AP-4ε亚基、ATG9A和α-微管蛋白（负载控制）的编码AP-4μ4[7]的基因。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（B，C）对A中提到的成纤维细胞内源性ATG9A（绿色）和AP-4ε（红色）（B）或GM130（红色）。DAPI（蓝色）染色细胞核。（D） 使用ImageJ和Radial Profile插件量化对照组（n=9）、患者1（n=7）和患者2（n=8）成纤维细胞中ATG9A相对于细胞核的分布。数值为各组中荧光强度相对于总细胞强度的平均值±SEM。注意TGN处ATG9A的浓度及其在患者成纤维细胞外周细胞质中的耗竭。
图5
图5。AP-4εKO小鼠神经元TGN处ATG9A的积累。
（A） WT和KO小鼠海马神经元对ATG9A（绿色）和GM130（红色）的共免疫。单通道图像以倒灰度显示。神经元的轮廓用虚线表示。最右边一列的图像是合并图像中神经元胞体的3倍放大视图。棒材：10μm。（B） 通过将编码HA标记ε和PM-RFP的质粒转染KO小鼠海马神经元，挽救内源性ATG9A的正常分布。对神经元进行内源性ATG9A（绿色）和GM130（白色）染色，以及HA表位（蓝色）染色。右侧的六个面板是左侧方框区域1和2的单通道、反转灰度放大视图。棒材：20μm。注意AP-4εKO神经元TGN处ATG9A的浓度和伴随的外周耗竭，以及HA-ε-挽救神经元中这一表型的逆转。
图6
图6。AP-4εKO小鼠不同脑区TGN处ATG9A的积累。
使用内源性ATG9A抗体（绿色）对WT和AP-4εKO小鼠的大脑皮层、小脑皮层、海马和脊髓切片进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。第二列和第四列上的图像分别是第一列和第三列上方框区域的放大倍数。条形图：50μm（缩小视图）和10μm（放大）。注意AP-4εKO小鼠神经元TGN处的ATG9A染色较亮。
图7
图7。AP-4εKO小鼠大脑和神经元中ATG9A水平增加，其他自噬蛋白水平正常。
（A） 用SDS-PAGE和免疫印迹法分析WT和AP-4εKO小鼠的嗅球（OB）、大脑皮层、小脑（Cerebell）、海马（Hippo）、中脑和脑干的匀浆，并用右侧所示的蛋白抗体进行免疫印迹。指示了LC3B的I型和II型的位置。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（B） 根据实验定量ATG9A水平，如A所示。数值为四次测定的平均值±SEM*P<0.05，**P<0.005。注意AP-4εKO某些脑区ATG9A水平增加与.WT小鼠。（C） 根据实验定量ATG5水平，如A所示。数值为四次测定的平均值±SEM。注意，AP-4εKO中ATG5水平没有显著变化与.WT小鼠。（D） 将WT和AP-4εKO小鼠原代培养的皮层神经元在没有（n.t.）或存在100 nM巴非霉素A1（Baf）的情况下孵育5 h。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析总蛋白提取物的LC3B、SQSTM1和β-微管蛋白。指示了LC3B的I型和II型的位置。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（E-G）根据实验（如D中的实验）定量LC3B-II与LC3B-I的比值（E）、总LC3B（F）和总SQSTM1（G）。值是三次测定的平均值±SD*P<0.05。注意在WT和AP-4εKO皮层神经元中与巴非霉素孵育后，SQSTM1显著增加。还要注意，AP-4εKO不影响LC3B处理和自噬通量。
图8
图8。AP-4εKO海马神经元轴突中突变体亨廷顿蛋白聚集体的积累增加，自噬体的活动性降低。
（A） 将编码聚集蛋白HTT103Q-GFP（绿色）和青色荧光蛋白（CFP）的质粒与LC3B-mCherry（mCh）（红色）（顶部两行）或ATG9A-mCherry[红色]（底部一行）共同转染WT和AP-4εKO小鼠培养的海马神经元成像。单通道图像以倒灰度显示。箭头表示含有GFP和mCherry标记蛋白的轴突聚集体。棒材：20μm。（B） WT和AP-4εKO神经元的轴突终末和树突放大并拉直，如A.（C）用LC3B-mCherry或ATG9A-mCherry/100μm轴突量化HTT103Q-GFP病灶数量。数值为10个神经元的平均值±SD**P<0.005，***P<0.0005。请注意，相对于WT神经元，KO中轴突HTT103Q-GFP和LC3B-mCherry聚集体的数量增加，并且ATG9A-mCherri的过度表达抑制了这种增加。（D） 拉直DIV8 WT和AP-4εKO海马神经元表达LC3B-GFP的50μm轴突终末段（顶部）和相应的波形图（底部）。水泡向顶部面板的右侧或左侧移动分别代表顺行或逆行运动。曲线图（底部）中带有负斜率或正斜率的线分别对应于顺行或逆行运动。注意WT轴突中逆行运动的LC3B-GFP小泡，AP-4εKO轴突没有运动小泡。（E） WT和AP-4εKO神经元远端轴突中顺行、逆行和静态LC3B-GFP颗粒数量的定量。运动粒子和静止粒子的数量表示为每个日程表中事件总数的百分比。值是九个WT和五个AP-4εKO神经元的平均值±SEM*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。
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