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.2015年12月；89(23):12118-30.
doi:10.1128/JVI.02098-15。 Epub 2015年9月23日。

Vpr增强HIV-1感染T细胞产生肿瘤坏死因子

费迪南·罗什 1, 莱娅·理查德 1, 雷珍·鲁 1, 弗朗索瓦斯·波洛 2, 尼科莱塔·卡萨尔泰利 2, 奥利维尔·施瓦茨 三
附属公司

Vpr增强HIV-1感染T细胞产生肿瘤坏死因子

费迪南·罗什等。 J维罗尔. 2015年12月.

摘要

HIV-1辅助蛋白Vpr表现出可能影响病毒复制的不同活性，包括G2期细胞周期的阻滞以及细胞凋亡和DNA损伤反应途径的刺激。Vpr还调节受感染细胞的细胞因子生成，但这种特性仍有部分特征。在此，我们研究了Vpr对促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）产生的影响。我们报告Vpr显著增加受感染淋巴细胞的TNF分泌。这种效果需要重新生产Vpr。已知存在G2细胞周期阻滞缺陷的Vpr突变体诱导较低水平的TNF分泌，表明这两种功能之间存在联系。沉默实验和化学抑制剂的使用进一步表明细胞蛋白DDB1和TAK1参与了Vpr的活性。HIV-1感染细胞分泌的TNF在旁观者细胞中触发NF-κB活性，并允许潜伏感染细胞模型中的病毒重新激活。因此，Vpr对促炎途径的刺激可能会影响HIV-1在体内的复制。

重要性：HIV-1辅助蛋白Vpr的作用仅保留部分特征。这种蛋白对于感染者的病毒发病机制很重要，但对于大多数细胞培养系统中的病毒复制来说是不必要的。为Vpr描述的一些函数仍然存在争议。尤其是，Vpr是否促进或阻止促炎和抗病毒免疫反应尚不清楚。在本报告中，我们发现Vpr促进TNF的释放，TNF是一种与疾病快速进展相关的促炎细胞因子。利用Vpr突变体或抑制选定的细胞基因，我们表明细胞蛋白DDB1和TAK1参与HIV感染细胞释放TNF。本报告提供了关于Vpr如何操纵TNF生成的新见解，并有助于阐明Vpr在先天免疫反应和炎症中的作用。

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数字

图1
图1
Vpr增强HIV-1感染的T细胞分泌TNF。（A） MT4C5细胞中HIV-1复制和TNF分泌。MT4C5细胞感染HIV或Δ虚拟专用数据库HIV（0.4至4 ng Gag p24/ml/106单元格）。未感染细胞（NI）作为对照。通过测量Gag的百分比来监测感染+通过流式细胞术检测细胞，并在感染后的指定天数通过Luminex测定或ELISA对上清液中的TNF进行定量。数据表示进行的四个病毒复制动力学实验（左面板）和TNF生成动力学实验（右面板）的结果。（B） 六个独立实验中的感染水平和TNF生成。MT4C5细胞被感染，并按照面板A所述进行分析。数据表示10个独立实验结果的平均值±标准偏差（SD），Gag阳性（Gag阳性）+)感染后24小时测定细胞数，48小时测定TNF。单个实验用匹配符号描述。*，P（P）<0.05（Wilcoxon检验）。（C） 原发性CD4中HIV-1复制和TNF分泌+T细胞。这些细胞感染了HIV或Δ虚拟专用数据库HIV（40至400纳克Gag p24/ml/106单元格）。通过测量Gag的百分比来监测感染+流式细胞仪检测细胞，并在感染后指定天通过Luminex试验或ELISA对上清液中的TNF进行定量。数据表示进行的一项病毒复制动力学实验（左图）和六项TNF产生动力学实验（右图）的结果。（D） 原发性CD4的感染水平和TNF生成+6名独立供体的T细胞。按照面板C所述对细胞进行感染和分析。数据表示6个实验结果的平均值±SD，Gag+感染后24小时测定细胞数，48小时测定TNF。个人捐赠者用匹配符号表示。*，P（P）<0.05（Wilcoxon检验）。
图2
图2
受感染T细胞分泌TNF需要病毒整合和Vpr新合成。（A） 抗逆转录病毒药物对感染细胞释放TNF的影响。MT4C5细胞感染HIV或Δ虚拟专用数据库在存在或不存在逆转录酶抑制剂奈韦拉平（NVP；25 nM）或整合酶抑制剂雷洛替加韦（RAL；1μM）的情况下感染HIV。未经处理的细胞（NT）作为对照。如图1所示，测量24小时的感染水平和48小时的TNF释放。用野生型HIV和无抗逆转录病毒药物获得的TNF水平设定为1。结果表示3个独立实验结果的平均值±SD。（B）反式-Δ的互补虚拟专用数据库艾滋病毒。Δ虚拟专用数据库艾滋病毒在反式与HA-Vpr共转染病毒产生的293T细胞。通过蛋白质印迹分析所指示的病毒的HA-Vpr掺入（上图）。每条车道上装载了20 ng Gag p24。Gag p24水平作为对照组（下面板）进行评估。数据表示一个代表性实验的结果。（C） Vpr的影响反式-补充TNF释放。MT4C5细胞感染HIV，Δ虚拟专用数据库HIV或Δ虚拟专用数据库HIV加HA Vpr。如图1所示，测量24小时的感染水平和48小时的TNF释放。野生型HIV感染水平设定为1。数据表示3个独立实验结果的平均值±SD。
图3
图3
Vpr突变体的特征。（A） 病毒突变病毒感染MT4C5细胞。指示的虚拟专用数据库将突变引入HIV NL4-3。如图1所示，在24小时通过流式细胞仪分析感染水平。野生型HIV-1感染设定为1。数据表示4个独立实验结果的平均值±SD。（B） Vpr突变体的表达和整合。细胞裂解物来自转染的293T细胞。病毒颗粒在碘克沙醇（Optiprep）垫上通过超速离心纯化。用抗Vpr单克隆抗体进行Western blot分析，评估Vpr水平。对于细胞裂解物和纯化的病毒，每个通道中分别装载45 ng和100 ng Gag p24（上面板）。Gag p24水平作为对照组（下面板）进行评估。使用ImageStudio Lite计算相对波段强度，并显示每条车道的相对波段强度。数据表示一个代表性实验的结果。（C） Vpr突变病毒感染MT4C5细胞中TNF的诱导。如图1所示，在48小时p.i.的感染细胞上清液中测量TNF，野生型HIV的水平设置为1。数据表示4个独立实验结果的平均值±SD。
图4
图4
DDB1和TAK1介导感染细胞释放TNF。（A） 受感染细胞释放TNF需要DDB1。对照组或DDB1-silenced MT4C5细胞感染HIV或Δ虚拟专用数据库艾滋病毒。如图1所示，测量24小时的感染水平和48小时的TNF-α释放。野生型HIV和对照细胞的水平设置为1。数据表示3个独立实验结果的平均值±SD。（B） 受感染细胞释放TNF需要TAK1。MT4C5细胞感染HIV或Δ虚拟专用程序在（5Z）-7-氧代烯醇（一种先前描述的TAK1抑制剂）浓度增加（5、15和50 nM）的情况下感染HIV。如图1所示，测量24小时的感染水平和48小时的TNF释放。野生型HIV和非处理（NT）细胞的水平设置为1。数据代表3个独立实验结果的平均值±标准差。（C） DDB1消声效率。用表达对照或抗DDB1 shRNAs的慢病毒载体转导MT4C5细胞，并用嘌呤霉素筛选。DDB1水平通过Western blot分析（上面板）进行评估，使用dynamin作为负荷对照（下面板）。使用ImageStudio Lite计算相对波段强度，并显示每条车道的相对波段强度。数据表示一个代表性实验的结果。（D） TAK1抑制和DDB1耗竭对PMA诱导TNF生成的影响。用PMA（10 ng/ml）单独或与离子霉素（200 ng/ml。20小时后量化TNF水平。数据表示5个独立实验结果的平均值±SD。*，P（P）<0.05（Mann-Whitney试验）。
图5
图5
HIV-1感染细胞产生的TNF刺激NF-κB和旁观者细胞中的病毒重新激活。（A） 旁观者细胞中的NF-κB活性（实验大纲）。293T CD4型+CXCR4系列+用NF-κB荧光素酶报告质粒瞬时转染细胞，并与感染HIV或Δ虚拟专用数据库艾滋病毒。Gag的百分比+细胞用流式细胞仪定量，荧光素酶用光度计测定。（B） MT4C5供体和293T CD4中的Gag水平+CXCR4系列+目标细胞。结果表示7个独立实验结果的平均值±SD。（C） 共培养中的NF-κB活性。野生型HIV的值设置为1。结果表示6个独立实验结果的平均值±SD。*，P（P）<0.05（Wilcoxon检验）。（D） 潜伏感染的旁观者细胞中的病毒重新激活（实验大纲）。MT4C5细胞感染HIV或Δ虚拟专用数据库HIV，并以1:1的比例与J-Lat 10.6细胞共培养。在共培养之前和期间，用抗肿瘤坏死因子抗体（1μg/ml）处理供体细胞。通过测量GFP的百分比来量化24小时后的病毒再激活+流式细胞术检测细胞。（E） J-Lat细胞中病毒再激活的剂量反应分析。MT4C5细胞感染水平增加（从Gag的5%到25%+细胞，用于HIV和Δ虚拟专用数据库HIV）被用作捐赠者。作为对照，J-Lat细胞单独培养（NT）或与未感染的MT4C5（NI）一起培养。数据表示一个代表性实验的结果。（F） Vpr增强了旁观者细胞中的病毒重新激活。野生型HIV检测结果设定为1。数据表示4个独立实验结果的平均值±SD。*，P（P）<0.05（Wilcoxon检验）。
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