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.2014年5月1日；192(9):4273-83.
doi:10.4049/jimmunol.1303090。 Epub 2014年3月26日。

肺炎链球菌感染期间，老化增强的内质网应激导致Atg9A对STING介导的IFN-β生成的抑制增加

达纳·N·米策尔 1, 弗吉尼亚·劳里, Anushree C Shirali公司, 刘玉石, 希瑟W斯托特·德尔加多
附属公司

肺炎链球菌感染期间，老化增强的内质网应激导致Atg9A对STING介导的IFN-β生成的抑制增加

达纳·N·米策尔等。 免疫学杂志. .

摘要

肺炎球菌感染仍是65岁以上人群死亡的主要原因。最近的报道说明了衰老和年龄相关疾病中内质网应激反应或未折叠蛋白反应的有害变化；然而，衰老、未折叠蛋白反应和肺炎链球菌固有免疫反应之间的关系尚未完全阐明。我们的结果表明，在肺炎链球菌感染期间，干扰素基因刺激物介导的干扰素β的产生在老年宿主中减少。肺炎链球菌增强肌醇需要蛋白1/X-box结合蛋白1介导的自噬相关基因9（Atg9a）的产生导致内质网应激增强。敲除Atg9a或用盐酸吉西他滨治疗可增强干扰素基因的刺激物，从而使衰老巨噬细胞产生干扰素β。在体内肺炎链球菌感染期间，连续使用吉西他滨治疗可降低老年宿主的发病率和死亡率，这与Atg9a表达降低、IFN-β生成增加和肺组织细菌清除率提高有关。综上所述，本研究中的数据为老年人更容易感染肺炎链球菌提供了新的证据，并为增强这些反应提供了可能的机制，从而降低了该人群的发病率和死亡率。

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数字

图1
图1。肺炎链球菌感染导致老龄小鼠发病率增加
年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/c小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司（ATCC 6303）或经鼻滴注生理盐水。（A） 在感染后24小时和48小时收集体重（双向方差分析，p<0.0001）。（B） 肺是从S.pne公司在计算CFU滴度（双向方差分析，p<0.0001）之前，将感染小鼠和匀浆稀释并放置在羊血琼脂平板上过夜。（C） 在感染后24小时采集RNA，并通过实时PCR（双向方差分析，p=0.0018）评估年轻和老年肺中细菌溶解基因的表达。（D-F）用胶原酶D消化肺组织，显示白细胞总数（D:t检验（48小时），p=0.0026）、肺泡巨噬细胞（E:双向方差分析，NS）和巨噬细胞群（F:双向方差研究，p=0.0470）。从至少三个独立实验中获得了类似的结果，每组大于N=5，结果显示为平均值±SEM。
图2
图2。肺炎链球菌感染时老龄小鼠IFNβ生成减少
年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/c小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司（ATCC 6303）或经鼻滴注生理盐水。通过ELISA评估（A）肺匀浆（双向方差分析，p<0.0001）和（B）血清（双向方差研究，p=0.0015）中IFNβ的产生。（C） 巨噬细胞单独或与培养基一起培养S.pne公司（50 CFU）持续24小时。收集细胞培养上清液，并通过ELISA评估干扰素β的产生（双向方差分析，p=0.0006）。（D-E）在额外的实验中，用ELISA评估用c-di-AMP、c-di-GMP和ISD培养的巨噬细胞产生IFNβ（D:双向方差分析，p=0.0022）或3′-3′和2′-2′cGAMP（F:双向方差，p<0.0001）。从三个或更多的独立实验中获得了类似的结果。对于在体外实验中，数值表示每次实验N=6或更大，并表示为平均值±SEM体内实验中，该值代表每组五只或更多只小鼠，并表示为平均值±SEM。
图3
图3。肺炎链球菌感染期间，STING介导的干扰素β在老年宿主中的产生减少
（A-C）巨噬细胞单独或与培养基一起培养S.pne公司在RNA或蛋白质分离前24小时（50 CFU）。（A） 通过实时PCR（双向方差分析，p<0.0001）评估STING、TBK1、IRF3和IFNβ相对于培养基对照的基因特异性表达。（B） STING蛋白水平通过ELISA进行评估（双向方差分析，p<0.0001）。从培养的巨噬细胞和TBK1中分离（C-D）蛋白，并通过western blotting检测磷酸化IRF3蛋白的表达。（E） 使用TransAM IRF3 ELISA评估IRF3激活（双向方差分析，p=0.0071）。（F-I）年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/c小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司（ATCC 6303）或经鼻滴注生理盐水。在感染后24小时从肺组织样本中收集RNA和蛋白质。（F） 通过实时PCR评估STING、TBK1、IRF3和IFNβ相对于盐水对照的基因特异性表达（双向方差分析，p＜0.0001）。（G） 从肺组织中分离出蛋白，并通过western blotting检测磷酸化IRF3蛋白的表达。（H） STING蛋白水平通过ELISA进行评估（双向方差分析，p=0.0224）。（一） 使用TransAM IRF3 ELISA评估IRF3激活（双向方差分析，p<0.0001）。从三个或更多独立实验中获得了类似的结果。对于在体外实验中，数值表示每次实验N=4或更大，并表示为平均值±SEM体内实验中，数值代表每组五只或更多的小鼠，表示为平均值±SEM。
图4
图4。肺炎链球菌感染期间老年宿主内质网应激增强
（A-B）巨噬细胞单独与含有牛磺脱氧胆酸（TUDCA）、苹果酸舒尼替尼（SM）和/或S.pne公司一夜之间。分离蛋白质并通过ELISA评估BIP/GRP78和PDI的表达（A：双向方差分析，p<0.0001；B：双向方差研究，p=0.0063）。（C-F）年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/C小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司或通过鼻内滴注生理盐水。在感染后24小时从肺组织样本中收集蛋白质，并通过ELISA（双向方差分析，p=0.0006）评估BIP/GRP78的表达。（D） 通过蛋白质印迹评估ATF4、CHOP和BCL2的表达。（E） 通过western blotting检测感染后24小时收集的青年和老年肺匀浆中caspase-12和-3的表达。（F） 采用Annexin V和7-AAD流式细胞术染色评估肺细胞凋亡（双向方差分析，p=0.0007）。从三个或更多独立实验中获得了类似的结果。对于在体外实验中，数值表示每次实验N=5或更大，并表示为平均值±SEM体内实验中，数值代表每组五只或更多的小鼠，表示为平均值±SEM。
图5
图5。肺炎链球菌感染时增加Atg9A介导的老年肺STING抑制
（A-B）巨噬细胞单独或与培养基一起培养S.pne公司24小时。分离蛋白质并通过western blotting评估IRE1、XBP1和Atg9a的表达。（B） 年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/c小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司或通过鼻内滴注生理盐水。在感染后24小时从肺组织样本中收集蛋白质，并通过western blotting评估IRE1、XBP1和Atg9a的表达。（C） 使用α-Atg9a进行共免疫沉淀，然后进行乙酰化赖氨酸的western印迹（单向方差分析，p=0.0391）。（D-F）老化巨噬细胞单独与含有牛磺脱氧胆酸（TUDCA）、苹果酸舒尼替尼（SM）和/或S.pne公司一夜之间。（D） 分离蛋白，并通过western blot检测BIP/GRP78、IRE1、XBP1和Atg9a在老年巨噬细胞中的表达。（E） 通过ELISA评估STING蛋白和IRF3激活（培养基和复合处理的t检验比较，p<0.05）。通过ELISA评估干扰素β的产生（培养基和复合处理之间的t检验比较，p<0.05）。从三个或更多独立实验中获得了类似的结果。对于在体外实验中，数值表示每次实验N=5或更大，并表示为平均值±SEM体内实验中，数值代表每组五只或更多的小鼠，表示为平均值±SEM。
图6
图6。敲除Atg9a恢复肺炎链球菌感染期间STING介导的干扰素β生成
（A-G）细胞在移植前24小时用错义或Atg9a特异性siRNA处理S.pne公司感染。（A） 从培养的巨噬细胞中分离RNA，并通过实时PCR评估Atg9A、STING、IRF3和TBK1相对于对照的表达。基因表达归一化为β2M（A:双向方差分析，p<0.0001）。收集（B-D）蛋白并评估STING、TBK1和IRF3的表达（B:t检验，p=0.0025；D:t检验（p=0.0164）。（E） 收集细胞培养上清液，并通过ELISA评估干扰素β的产生（t检验，p<0.0001）。（G） 通过细胞培养上清液的连续稀释来评估细菌滴度（双向方差分析，p=0.0004）。从三个或更多独立实验中获得了类似的结果。对于在体外实验，每个实验的数值表示N=5或更大，并表示为平均值±SEM。对于体内实验中，数值代表每组五只或更多的小鼠，表示为平均值±SEM。
图7
图7。盐酸吉西他滨降低Atg9A介导的STING抑制作用并增强肺炎链球菌感染期间IFNβ的生成
年轻（2个月）和老年（19个月）雄性和雌性BALB/c小鼠接受1×10三的CFUS.pne公司（ATCC 6303）或经鼻滴注生理盐水。从感染后4小时开始，动物接受100μL盐酸吉西他滨（0.3mg/mL）腹腔注射或生理盐水对照。（A-C）每天评估两次体重（A:双向方差分析，p<0.0001）、临床评分（B:双向方差研究，p<00001）和生存率（C:Mantel-Cox检验，p=0.0001）。（D-H）在治疗后的选定时间点分离并均质肺组织。通过ELISA评估（D-F）STING表达、IRF3激活和IFNβ生成（D-E:t检验，p<0.05；F:双向方差分析，p<0.0001）。（G） 期间老年肺样本的代表性细菌清除率S.pne公司感染。（H） 评估细菌滴度并计算CFU（双向方差分析，p<0.0001）。从三个或更多的独立实验中获得了类似的结果。这些值代表每组五只或更多的小鼠，并表示为平均值±SEM。
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